分光光度计使用方法.docx
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分光光度计使用方法
最正确答案
1.接通电源，翻开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。
2.将灵敏度开关调至“1”档〔假设零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。
〕3.根据所需波长转动波长选择钮。
4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室，使空白管对准光路。
5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。
6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。
7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净
分光光度计使用的外部环境要求
分光光度计属于精细仪器，应当妥善保管和精心维护，这样才能保证分光光度计长期使用、长期的稳定可靠、测量精度高。
元析公司在多年的生产和应用的过程中，得到了一套在一定环境下维护分光光度计的经历，具体如下：
1、环境温度在条件容许的情况下，尽量保持在15-30摄氏度之间，这样能保持电器件稳定工作，不易老化，使分光光度计不易损坏，灯源的使用寿命得到延长。
假设条件不容许，在高温的情况下，缩短开机时间，高效使用分光光度计，使电器件不要长期保持在高温下。
在低温下，使预热时间比常温下的预热时间要长，这样能保证在仪器稳定的情况下进展测试。
2、环境湿度在条件容许的情况下，尽量保持在60%以下，这样能保证光度计部的光学件和电器件不易受潮、腐蚀、和上霉。
假设条件不容许，在高湿度和低湿度的情况尽量保持通风。
3、环境在条件容许的情况下尽量保持干净，清扫环境时动作不宜太大，不要扬起灰尘，清扫之前用防尘罩盖上分光光度计，不要让灰尘进入分光光度计部。
以上仅就仪器使用的外部环境作了描述，以供使用用户参考。
分光光度计的使用
分光光度计的应用常识
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。
常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，局部光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。
样品的吸光值与样品的浓度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：
1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，此后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定围变化，即仪器有一定的准确度和准确度。
如EppendorfBiophotometer的准确度≤1.0%〔1A〕。
这样屡次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。
另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：
在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可无视的因素：
由于样品中不可防止存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。
在此围，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高〔超过光度计的测试围〕。
最后是操作因素，如混合要充分，否那么吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否那么读数漂移剧烈；必须使用一样的比色杯测试空白液和样品，否那么浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须到达比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。
纯洁的样品，比值大于1.8〔DNA〕或者2.0〔RNA〕。
如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯洁的核酸A260/A230的比值大于2.0。
A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。
纯样品，A320一般是0。
蛋白质的直接定量〔UV法〕
这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。
选择Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。
蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。
由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm的“背景〞信息，设定此功能“开〞。
与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最正确的线性围在1.0-1.5之间。
实验中选择Warburg公式显示样品浓度时，发现读数“漂移〞。
这是一个正常的现象。
事实上，只要观察A280的吸光值的变化围不超过1%，说明结果非常稳定。
漂移的原因是因为Warburg公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。
蛋白质直接定量方法，适合测试较纯洁、成分相对单一的蛋白质。
紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
比色法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的根底是蛋白质构成成分：
氨基酸〔如酪氨酸，丝氨酸〕与外加的显色基团或者染料反响，产生有色物质。
有色物质的浓度与蛋白质反响的氨基酸数目直接相关，从而反响蛋白质浓度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry等几种方法。
Lowry法：
以最早期的Biuret反响为根底，并有所改良。
蛋白质与Cu2+反响，产生蓝色的反响物。
但是与Biuret相比，Lowry法敏感性更高。
缺点是需要顺序参加几种不同的反响试剂；反响需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Tritonx-100，ammoniasulfate等物质的蛋白不适合此种方法。
BCA〔Bicinchoninine acid assay〕法：
这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。
要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反响产生Cu+，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。
此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反响后形成的化合物非常稳定。
相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。
但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
Bradford法：
这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反响，产生的有色化合物吸收峰595nm。
其最大的特点是，敏感度好，是Lowry和BCA两种测试方法的2倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反响试剂；化合物可以稳定１小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA反响的复原剂〔如DTT，巯基乙醇〕相容。
但是对于去污剂依然是敏感的。
最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。
某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，终究该相信哪种方法？
由于各种方法反响的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。
例如：
Keller等测试人奶中的蛋白，结果Lowry，BCA测出的浓度明显高于Bradford，差异显著。
即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。
如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质，以BSA作标准品，浓度1.34mg/ml，以a球蛋白作标准品，浓度2.64mg/ml。
因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。
另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。
关键问题是，反响后1011分光光度计的重要配件——比色杯的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反响测试时间，所有的样品〔包括标准样品〕，都必须在此时间测试。
时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。
除此，反响温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。
此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。
防止使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反响后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。
细菌细胞密度〔OD600〕
实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经历和目测推断细菌的生长密度。
在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。
OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。
以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。
为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进展细胞计数，做出校正曲线。
实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反响，发生变色反响。
另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。
分光光度计的重要配件——比色杯
比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。
根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。
一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。
因为反响中的染料〔如考马斯亮兰〕能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。
而塑料杯一般不适合用于在紫外围测试样品。
由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。
目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。
如EppendorfUVette?
塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。
随着生命科学以及相关学科开展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。
分光光度技术
6.1根本原理
利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进展定性定量分析和物质构造分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的根本手段之一。
因此本章重点讨论紫外/可见分光光度法的根本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。
1.光谱：
光是电磁波，可用波长“λ〞表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。
光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。
光的传播是由相互垂直的电场分量“E〞和磁场分量“H〞所构成。
λ＝C/ν
λ——波长C——光速ν——频率，单位时间通过一个定点的波数。
光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。
这些粒子所具有的原能量“E〞由下式算出：
E＝h?
ν
H——普朗克常数〔6.624×10-27尔格?
秒〕
ν——频率
紫外区可分为紫外〔近紫外〕和真空紫外〔远紫外〕。
由于吸收池〔又称样品池、比色杯等〕和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm～400nm。
可见光区为400nm～800nm。
组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着，分子的运动可分为平动、转动、振动和分子电子的运动，每种运动状态都处于一定的能级，因此分子的能量可以写成：
E＝E0+E平+E转+E振+E电
E0是分子在的不随分子运动而改变的能量，平动能E平只是温度的函数，因此与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量。
分子的每一种能量都有一系列的能级，能级不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子处于基态，当它吸收一定能量跃迁到激发态，那么产生吸收光谱。
分子转动、振动和电子能级的跃迁，相应地产生转动、振动及电子光谱。
按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合以下关系：
E＝E2-E1＝h
E1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，那么所吸收的光的频率愈高〔即波长愈短〕，反之那么所吸收的光的频率愈低〔即波长愈长〕。
由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。
因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差异较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。
分子转动能级级差小，△E＜0.05电子伏特〔ev〕，分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。
振动能级纵间的差异较大，E＝0.05～1.0ev，振动光谱出现在中红外区。
电子能级的级差更大，E＝1～20ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。
可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道〔即成键轨道〕，吸收了光能量跃迁到高能级轨道〔称为反键轨道〕。
与吸收光谱有关的三种电子是：
⑴二个原子的电子沿其对称方向相互形成的共价键〔即单键〕，称σ键，构成键的电子称σ电子，如C－C、C－H键。
⑵平行于二个原子轨道形成的价键〔即双键〕，称π键，形成π键的电子称为π电子，如C=C键。
⑶未共享成键的电子，称n电子。
各种电子跃迁所需能量大小的顺序是：
n→π*＜π→π*≤n→σ*＜π→σ*＜σ→π*＜σ→σ*
紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共轭双键中的π电子和未共享的电子对的激发所产生的。
所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目和未共享电子对的共轭情况等。
如下表所示：
电子跃迁类型与紫外吸收波长（nm）关系表
电子跃迁类型例子紫外吸收波长围
σ→σ*C－H100～150nm
π→π*（非共轭）C＝O＜200nm
π→π*（共轭）＝C－C＝200～300nm
n→π*C＝O～300nm
π→π*跃迁：
此类跃迁所需能量较小，吸收波长在紫外区的200～300nm，不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发生这类跃迁，氨基酸、蛋白质与核酸均含有大量共轭双键，因而200～300nm的紫外吸收测定，在生化实验技术中有极广泛的用途。
假设逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度〔吸光度“A〞或光密度“O.D〞〕或透射程度〔透光度“T〞〕，以波长λ作横坐标，“A〞或“T〞为纵座标，画出连续的“A~λ〞或“T~λ〞曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。
吸光度A
D
C
B
λmaxλmin波长（nm）
由上图可以看出吸收光谱的特征：
⑴曲线上“A〞处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以λmax表示。
⑵曲线上“B〞处有一谷，称最小吸收，它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以λmin表示。
⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C〞，称肩峰。
⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D〞处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。
λmax是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。
吸收光谱中，λmax、λmin、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的构造而异，所以是物质定性的依据。
测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。
常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验公司编制的“Sadtler〞紫外标准图谱集，到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。
由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进展化合物定性鉴定时，应注意：
化合物一样，其紫外光谱应完全一样；但是紫外光谱一样不一定化合物就一样，可能仅是存在某些一样的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。
由于电子跃迁的同时也引起分子的转动和振动光谱，要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是不可能的，因此我们常见的紫外吸收光谱是由一个或几个宽的吸收谱带所组成。
紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色效应。
发色团：
但凡与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、π→π*、n→σ*等电子跃迁的基团称为发色团。
例如：
C＝C、C＝O等发色团。
助色团：
助色团是一些具有非共价键的基团〔如OH、NH2、SH等〕。
这些基团在波长＞200nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移〔或浅色效应〕，红移的同时吸收带的强度增加。
假设助色团与发色团相连接，产生n→π*跃迁，使吸收波长向短波移动，称为兰移〔或深色效应〕。
增色效应〔hyperchromiceffect〕:
核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即ε值〔吸光系数或称消光系数〕显著升高，此现象称为增色效应。
此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在260nm处测量。
减色效应〔hypochromiceffect〕:
在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时ε值又明显减少，回复到原来的核酸分子ε值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。
2.光吸收定律：
朗伯——比尔〔Lambert－beer〕光吸收定律：
A＝－lgT＝εbc
A——吸光度，又称光密度“O.D〞。
T——透光度，T＝I/I。
，I。
——为照射到吸收池上的光强，I——为透过吸收池的光强。
ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数〔L?
mol－1?
cm－1〕。
b——样品光程〔cm〕，通常使用1.0cm的吸收地，b=1cm。
C——样品浓度〔mol/L〕。
由上式可以看出：
吸光度A与物质的吸光系数“ε〞和物质的浓度“C〞成正比。
摩尔吸光系数：
，是物质对某波长的光的吸收能力的量度。
ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。
ε值越大，说明电子跃迁的几率大，通常ε＝10～105：
一般认为ε＞104为强吸收；ε＝103～104为较强吸收；ε＜102为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。
因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A＝0.001,所以，当b＝1cm,
ε＝105时，可检测的溶液最小浓度是C＝10-8mol/L。
常用的吸光系数还有一种百分吸光系数，即在某一波长下，溶液浓度为1%〔W/V〕，液层厚度b＝1cm时的吸光度，以E1%λmax表示。
C——百分浓度〔W/V〕。
L——液层厚度，吸收杯光径长度。
A——吸光度。
最大吸收波长λmax时的ε和E1%λmax值可用下式换算：
ε＝E1%λmax×分子量/10
吸光度“A〞有一个重要性质是其具有加和性：
A＝ε1C1b1＋ε2C2b2＋ε3C3b3＋……＝
即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。
这是多元混合物分光光度法定量分析的根底。
假设溶液中各溶质的吸光系数ε一样，那么各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。
例如，离子交换柱层析别离核苷酸实验中可利用吸光度计算回收率：
m＝C?
V，∵，∴
m——溶质的量C——溶质浓度
V——溶液体积A——吸光度
ε——吸光系数b——吸收池光径
∴回收率〔100%〕
〔上式中假设ε总和各核苷酸的ε近似相等〕
例一：
尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定260nm处的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，其摩尔吸光系数=8.2×103M－1cm－1〔M＝mol/L〕。
∵A＝εbC∵A＝〔溶剂加样品的吸光度〕－〔溶剂的吸光度〕
∴A＝0.650－0.070＝0.580∵b＝1cm∴C==7.1×10－5mol/L
例二：
1%〔W/V，10mg/ml〕酪氨酸酶溶液的吸光度为24.9〔1cm吸收池，280nm〕，计算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的浓度。
由于这两种酶溶液的百分吸光系数“E1%1cm，280nm〞是一样的，因此可用正比例法计算浓度。
∵∴∴C未知＝0.01％＝0.1mg/ml
6.2分光光度计的组成和构造：
1.组成：
各种型号的紫外/可见分光度计，不管是何种型式，根本上都由五局部组成：
〔1〕光源；〔2〕单色器〔包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统〕；〔3〕样品室；〔4〕接收检测放大系统；〔5〕显示或记录器。
光源单色器样品室检测放大系统显示器
国产分光光度计近年来已有很大的开展，各种档次的分光光度计都已更新升级换代，可见光系列有：
721、722、723等型号，紫外/可见光系列有：
751、752、753、754、756等型号，主要生产厂为分析仪器总厂等。
我系1985年购置的瑞士KONTRON康强公司生产的UNICON860型紫/可见光分光光度计，是双光束、快速自动扫描、荧屏显示的高档分光光度计。
这种双光束分光光度计的特点是来自光源的连续光谱经凹面全息光栅分光后，由出射狭缝得到单色光，经过由电机带动的25周/秒左右的旋转镜分解为“样品〞、“参比〞光束，顺序分时通过参比池和样品吸收池，照射到光电倍增管上，由于两条光路是几乎同时测量，参比信号又不断与标准电压比拟，使参比信号恒定，所以由光源、单色器、外界杂光、光电倍增管以及电源电压等带来的影响，仪器均能自动消除。
最快波长扫描速度为1200nm/min，有五种测量功能和五种数据处理功能。
我系2000年购置的德国耶拿〔蔡司〕公司生产的SPECORD200型高档紫外/可见光分光光度计的光路原理图如下：
SPECORD200分光光度计的样品和参比光路，分别有各自的带温控的光电二极管检测器，因而取消了电机带动的旋转镜，大大提高了仪器的稳定性及各项检测指标，其波长围是190nm～1100nm，吸光度测定围是0～3A，可变狭缝宽度为1nm、2nm和5nm，仪器使用微机控制时，扫描速度最高可达6000nm/min，宽大的样品室可以安装各种附件，仪器性能优良，适合教学、科研使用。
该仪器的使用说明详见附录。
2.构造：
⑴光源：
理想光源的条件是：
①能提供连续的辐射；②光强度足够大；③在整个光谱区光谱强度不随波长有明显变化；④光谱围宽；⑤使用寿命长，价格低。
用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，现在最常用的是卤钨灯〔Halogenlamp〕，即石英钨灯泡中充以卤素，以提高钨灯的寿命。
适用波长围是320～1100nm。
由于能量输出的波动为电压波动的四次方倍，因此电源电压必须稳定。
用于紫外光区的是氘灯〔Deuteriumlamp〕，适用波长围是195～400nm，由于氘灯寿命有限，国产氘灯寿命仅五百小时左右，要注意节约灯时。
⑵单色器：
单色器是分光光度计的心脏局部，它的作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。
它的主要组成部件
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