法医物证学重点.docx

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法医物证学重点

第一章绪论

法医物证学：

法医物证学是应用多种学科的理论知识和技术研究并解决涉及法律方面

有关生物性检材的检验与鉴定的一门学科。

应用的学科包括：

医学、生物学、遗传学、免疫学、血型血清学、生物化学及分子生物学等。

法医物证学：

是以法医物证为研究对象，以提供科学证据为目的，研究应用生命科学技术解决案件中与人体有关的生物检材鉴定的一门学科。

法医物证学是法医学的分支学科，其研究内容属于法医学中的物证检验部分，是法医学研究的主要内容之一。

法医物证是一门应用科学，研究的方法涉及多种学科包括：

①化学，②物理学，③电

子计算机，④形态学，⑤免疫血清学，⑥生物化学，⑦分子生物学，⑧遗传学等方法。

法医物证的特点：

①法医物证的稳定性受环境条件的影响；②法医物证属于“科学证

据”。

第二章法医物证分析的遗传学基础

1、何谓遗传标记？

个体的单位遗传性状作为标志用于法医物证分析时，这种遗传性状就成为遗传标记GM。

2、何谓基因、基因型和表型？

1）基因型：

是指个体一个或多个基因座上等位基因的组合，是生物体可见性状的实际

基因组成。

2）表型：

是指生物体某特定基因所表现的性状。

表型由基因型决定

3、Hardy-Weinberg平衡定律的前提条件和意义

1）前提条件：

群体无限大、随机婚配、没有突变、没有大规模的迁移和没有选择因素的影响。

2）结论：

群体中的基因频率和基因型频率在逐代传递中保持不变。

3）意义：

4）反映基因频率和基因型频率的关系（纯合子基因型频率=基因频率的平方，杂合子=该两基因频率乘积的二倍）

5）群体样本的检验

4、非父排除概率（P23）

PE是指孩子的非亲生父亲的男子，能够被某个遗传标记系统排除的概率。

PE用于评估某一遗传标记系统在亲权鉴定案件中的实用价值。

5、何谓个人识别概率？

（P22）

个人识别概率（DP是指在群体中随机抽取两个体，两者的遗传标记表型不相同的概率。

DP是评价该遗产标记系统识别无关个体效能大小的指标，DP越高，效能越强。

第三章DNA多态性的分子基础

1、何谓DNA多态性？

（P37）

1）在基因组DNA中，由不同碱基结构的等位基因所形成的多态性叫做DNA多态性。

2）按照DNA遗传标记的结构特征，DNA多态性可分为长度多态性和序列多态性。

2、何谓VNTR？

（P37）

小卫星DNA中的可变数目串联重复序列称为VNTR

3、何谓STR？

微卫星的可变数目串联重复序列称为短串联重复序列，STR。

第四章DNA长度多态性

1、RFLP

2、Amp-FLR

3、DNA旨纹图谱的基本特征？

1）遗传方式：

孟德尔规律、所有片段独立遗传

2）个体的组织同一性：

稳定一致

3）群体遗传学特征：

4）突变率：

配子细胞形成时重排、重组与交换

4、DNA纹印图谱的基本特征？

1）高多态性

2）遗传规律：

共显性

3）个体组织同一性：

一致

4）群体遗传学特征：

5）高突变率：

配子细胞形成时重排、重组、交换

5、何谓扩增片段长度多态性分析？

Amp-FLR采用PCF技术扩增VNTR或STR基因座等位基因进行DNA长度多态性分析的方法。

6RFLP与Amp-FLP技术有何异同？

（P74）

7、STR分型用于法医物证鉴定的主要优点？

1）高灵敏度：

适用于微量降解检材

2）高鉴别能力：

节约检材、试剂和提高效率

3）标准化分型：

实现数字化结果，利于实验室间数据交换，建立数据库

8、何谓miniSTR?

miniSTR分型有何法医学应用价值？

1）miniSTR：

通过重新设计引物，使其结合在更靠近核心重复区的侧翼序列，从而降低扩

增产物的大小，进一步提高灵敏度和分型成功率，这种技术称为短片段STR分型或

miniSTR分型。

2）miniSTR法医学应用价值：

STR基因座的扩增片段较短，灵敏度更高，尤其适用于微量或降解生物检材的DNA

分型；

等位基因片段长度范围较窄，不易发生因小等位基因的优势扩增而造成的等位基因丢失现象；

可对多个STR基因座进行复合扩增，从而节约检材、降低成本，提高单次检测的信息量

9、何谓多基因座复合扩增？

1）在一个PCF体系中同时扩增多个靶基因座的方法叫做复合扩增。

2）复合扩增可提高单次检测的信息量，提高个人识别率，也可降低成本和检材的消耗。

10、丫-STR有何法医学应用特点？

1）丫染色体为男性特有

2）Y-STR呈父系遗传特征

3）单倍体遗传：

在减数分裂过程中，丫-特异性区不发生重组，所有丫-STR基因座均呈连锁遗传，等位基因频率不能以相乘方法计算

4）GD=PE

5）结果不具有唯一性，不能认定

11、Amelogenin基因（名解）

牙釉基因（AMG：

位于X染色体Xp22,编码牙原基质牙釉质蛋白，故命名牙釉基因。

在人丫染色体中心粒附近有一类牙釉基因（AMG：

与牙釉基因的碱基序列有90%C源性。

用一

对特异性引物可同时扩增AMGSAMG序列片段，X特异性片段长度为977bp,丫为788bp

扩增后，男性可获得两条带，女性只观察到一条带。

但是其扩增产物较长，不适合腐败血痕、过于陈旧血痕的性别鉴定。

第五章STR自动分型

1、简述STR自动分型技术的主要步骤

1）DNA自动化提取

2）PCF多色荧光标记STR复合扩增

3）PCF产物电泳前处理

4）自动毛细管电泳结合激光诱导的荧光检测

5）自动数据采集并分型

在分型图

2、何谓off-ladder

1）在STR分型图谱中，常会遇到部分样本的少量片段峰未被程序化数字命名,

谱中被标识为off-ladder

2）漂移作用和新等位基因都可标识为off-ladder

3、何谓LCN

LCN基因组含量小于100pg的样本称为低拷贝DNA（lowcopynumber）。

第六章DNA序列多态性

DNA多态性（DNApolymorphisms）:

基因水平上的多样性来自基因的突变，当基因突

变以等位基因形式在群体中得以保留，并能够从亲代遗传给子代，可形成个体间的遗传差异。

不同个体间的遗传差异形式是不同的等位基因组成。

等位基因之间的差异可以是点突变引起的|序列不同|，也可以是因为碱基的插入或缺失引起的片段|长度不同|，都能构成具有个体特征的DNA遗传标记。

DNA遗传标记可以出现在编码区，也可以存在于非编码区。

在基因组DNA中，这种由不同碱基结构的等位基因所形成的多态性叫做DNA多态性。

DNA长度多态性（DNAlengthpolymorphisms）:

是指同一基因座上各等位基因之间的

DNA片段长度差异构成的多态性。

DNA长度多态性靶序列主要是指可变数目串联重复序列（VNTR,VNTR既存在于小卫星DNA中，也存在于微卫星DNA中。

由于命名习惯和为了便于区分，通常小卫星DNA中的可变数目串联重复序列称为VNTR而把微卫星的可变数目串联重复序列称为短串联重复序列（STR。

DNA序列多态性（sequeneepolymorphisms）:

是指一个基因座上，因不同个体DNA序列有一个或多个碱基的差异而构成的多态性。

可以理解为该基因座上所有等位基因DNA长

度相同，但是它们之间的序列存在差异。

在基因组DNA中，无论是编码区或者非编码区，

单碱基替换是最基础的突变形式。

在人类基因组范围内，如果任何单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基，其中最少的一种在群体中的频率不少于1%就形成单核苷酸多态

性（singlenucleotidepolymorphisms，SNP9。

限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP:

RFLP

分析是一种传统的分子生物学检测技术，广泛应用于突变分析、基因诊断、基因定位等各

个方面。

法医物证鉴定应用RFLP技术主要是对人类基因组中的VNTRS因座进行分型，其技术核心是DNA分子杂交，决定RFLP分析图谱个体特异性的因素是限制性核酸内切酶的特

异性和探针的特异性。

检测所用的探针多是由人类基因组DNA中筛选出的小卫星序列，选

择特异性不同的探针，在不同的杂交条件下，可以只检出单个VNTR基因座，也可同时检出

多个VNTR基因座，前者称为DNA纹印，后者称之为DNA旨纹，检测所用的相应探针分别被

称为单基因探针（single-locusprobe）和多基因探针（multi-locusprobe）

Southern印迹杂交：

是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。

一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

其基本原理

是：

具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。

由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。

Southern印迹杂交

（Southernblot）是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物

分析等方面有重要价值。

Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛

吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。

凝胶中DNA片

段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标

记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在

众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

（琼脂糖凝胶电泳一硝酸纤维素膜吸印）。

限制性内切酶常见的有那些?

限制性内切酶（restrictionendonuclease）:

一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA

的内切酶。

I型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA勺水解；

而U型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解

合成引物的要点，PCR的反应组成

标准的PCR反应体系

10X扩增缓冲液

10^1

4种dNTP昆合物

200卩1

引物

10〜100^1

模板DNA

〜2^g

TaqDNA聚合酶

卩1

Mg2+

L

加双或三蒸水

100卩1

模板DNA②寡核苷酸引

PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即：

①

物，③dNTP,④反应缓冲液，⑤TaqDNA聚合酶

PCR基本原理：

PCF技术是模拟生物体内DNA的半保留复制，在体外合成DNA链的方法，在模板、

DNA引物、dNTPTaq酶存在的条件下经过：

“高温变性一低温退火一中温延伸”三步循环，获得大量扩增片段。

合成引物的要点:

引物合成是通过测定引物的0D值，溶解引物，最终合成引物的一个完善的过程。

目前

引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'一5'磷酸二酯键连接。

第一步，是将预先连接在固相载体CPGE的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT获得游离的5'-羟基。

第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应（少于

2%）,用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

常染色体STR与性染色体STR有什么不同？

常染色体STR短串联重复序列（STR）是广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列。

它由2〜6个碱基对构成核心序列，呈串联重复排列，其长度多态性主要由核心序列拷贝数目的变化而产生。

一般认为,人类基因组平均每6〜10kb就有1个STR基因

座,为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因座的丰富来源。

与限制性片段长度多态性产生的DNA指纹相比,用聚合酶链反应技术（PCR）扩增STR基因座产生的DNA纹印具有更高的灵敏度。

STR扩增片段较短（100〜300bp）,对于常见含部分降解DNA的陈旧斑痕,PCR扩增STR比DNA旨纹分析更容易成功。

性染色体STR人类Y染色体属于近端着丝粒染色体，由长臂Yq和微小的短臂Yp组成，DNA长度约60MbY-DNA中大致有五类多态性遗传标记：

卫星DNA小卫星DNA微卫星DNA插入或缺失及SNPY染色体STR基因座（Y-STR是其中一种重要的遗传标记。

与常染色体STR基因座相比，大多数丫-STR基因座具有复杂的串联重复结构：

一个基因座内常含有两种以上不同的重复单位，恒定重复序列和可变重复序列同时存在。

与常染色体STR基因座比较，Y-STR分型的法医学应用具有以下特点：

①丫染色体为男性所特有，②Y-STR呈父系遗传特征，只能有父亲传递给儿子，③在减数分裂过程中，Y-特异性区不发生重组，

④评估丫-STR鉴别能力的指标是遗传差异度，⑤和mtDNA一样，丫-STR分型结果不具有唯一性，其法医学应用价值在于排除，而不能认定。

X-STR基因座具有伴性遗传的特征，X-STR的遗传特征既不同于常染色体，也不同于丫染色体，表现为性连锁特征。

进行分型检测时，男性个体X-STR显现一条片段，女性杂合子则显示两条等位基因片段。

低拷贝DNA（lowcopynumber，LCN:

是指基因组含量小于100pg的样本。

PCR循环测序的基本原理：

PCR技术能够快速、特异性地扩增靶DNA应用PCR技术测定DNA序列分为两个步骤：

先利用PCRT增靶序列片段，制备测序模板，然后再利用PCR

直接测定序列。

PCR测序采用了热循环高效合成DNA的特性并结合双脱氧核苷酸终止法，使引物链终止的延伸产物数量在热循环过程中得到增加，因此称为循环测序。

每个测序循环包括：

①PCR扩增制备的模板DNA变性成单链形式：

②标记引物与其中的一条链上的互补序列退火；③退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应。

本次循环产

生的模板链与延伸终止链形成的双链的产物，在下一轮测序循环中，再次被变性，释放出模板链，作为又一轮引发反应的模板，同时积累下一轮循环产生的链终止产物。

上述循环步骤重复20~40次，使链终止产物以线性方式获得扩增。

DNA自动测序技术：

DNA自动测序技术是以4种荧光染料基团分别作为4种ddNTP终止链的标记物，于20世纪80年代末期建立的一种高效、快速、自动化的序列测定技术。

4

种荧光染料分别作为测序反应中4种ddNTP终止链的标记物，即4种被双脱氧核苷酸终止的DNA片段分别带上4种不同的颜色。

这些DNA片段的混合物同时加在一个样品槽中电泳展开，相互间仅差1个碱基的DNA片段形成一条具有4种颜色的阶梯分布图像。

阶梯中的每-DNA片段由标记在该片段上的特征性荧光基团发出的荧光所指示。

荧光染料基团作为标记物的基本要求是经过激光诱发的吸收光谱波长在可见光波长范围内，不影响延伸反应，不影响标记后DNA片段的电泳性质。

其次要求4种荧光的吸收和激发光波长要有足够的差异，便于检测。

荧光染料的掺入的方式有两种：

一种是将荧光染料预先标记在测序反应通用引物的5'端。

4种荧光标记形成4种标记引物，测序反应分4个反应管进行，特定的荧光染料与相应的ddNTP是对应关系，例如荧光示踪染料JOE标记

的通用引物总是与ddATP加在同一个反应管内，因此由ddATP终止的所有延伸链都带有JOE这种方式被称为Dye-Primers。

另一种是将荧光染料基团连在ddNTP上,4种荧光染料分别与4种ddNTP底物连接，反应产生的4组DNA片段分别由特定ddNTP所终止，并且标记有4种不同的荧光发色基团，A、CG和T分别携带有绿、红、蓝、黄4种荧光。

这种方式被称为Dye-Terminators。

两种方式各有特点，不过前者要求A，G,C,T分4个反应进行，而后者的4组反应可以在同一管中完成。

上述两种方法都能确定4种荧光与4种ddNTP所

终止的DNA片段之间的对应关系，这是后来从电泳中检测标记物信号以及最终读序的基础。

自动测序仪器无论是变性PAG平板凝胶电泳还是毛细管电泳，都配置有激光束激发系统和荧光信号收集检测系统。

当DNA片段电泳通过检测窗口时，在激光束的激发下，片段

的电泳时间和被激发荧光的波长、强度等信号都被记录，由计算机自动作数据处理，最后在屏幕上显示每一样品的各终止片段电泳分离的模拟图像。

不同颜色的峰标示各自标记的碱基及其排列顺序（如图所示）：

MVP（minisatellitevariantrepeat）序列：

称为具有变异核心序列的小卫星DNA是—

类既有长度多态性又有序列差异的DNA重复序列。

第七章线粒体DNA多态性

1、人类核DNA与mtDNA勺比较（P179）

2、mtDNA勺特点？

1）唯一的核外DNA来源

2）拷贝数多和异质性（当两种不同的mtDNA序列存在同一个细胞、组织或者个体时称之为异质性）

3）母系遗传

4）抗外切酶的环状结构有助于分子稳定性，对高度降解检材奏效

5）瓶颈效应和复制分离

6）阈值效应

3、mtDNA分型的优点？

1）高变区作为遗传标记用于法医鉴定，高变区又称D-环区

2）当细胞核DNA量不足而无法进行分型时，线粒体DNA技术分析是唯一可以利用的技

术

3）生物检材中的毛发、骨干、牙齿和其他严重降解的检材也依赖线粒体DNA分析

4）简单易操作、检材灵敏度高

5）所需模板DNA减少

6）减少DNA二级结构干扰

4、mtDNA分型的主要方法？

1）mtDNAg取（抽提）

2）PCR

3）纯化PCR产物

4）循环测序反应原理ddNTicore,only1primer

5、mtDNA分型的特殊问题？

1）mtDNA属于母系遗传，凡属同一母系的后代，mtDNA序列都是相同的。

序列一致只能说

明不排除同一个体的可能；

2）mtDNA能够提供的信息量有限（单倍型）一排除同一性（真正价值）

3）mtDNA勺异质性违背同一个体mtDNA序列必然是一致的前提条件，给个体识别鉴定增加

了变数；（如果多份检材异质性出现在同一位置的同一碱基贬义，反而对认定同一个体

检材有利）

6mtDNA分型的法医学应用局限性

1）分型技术要求高，耗时耗力耗钱

2）识别力相对较低：

非个体唯一，共有单倍体（母系遗传）

3）异质性

4）数据库规模：

易高估其识别能力

5）无法进行混合斑的检测

第八章红细胞血型

1、何谓ABO血型的正反定型？

1）正定性试验：

根据RBC与特异性抗体的反应来分型，即用抗A抗体判定A抗原，用抗B抗体判定B抗原。

2）反定型试验：

依据血清中的凝集素与标准型RBC膜上的凝集原反应的性质，即用标准的A型RBC判定抗A抗体，用标准的B型RBC判定抗B抗体，同时也应用抗H抗体判定H抗原。

2、试述ABO血型的DNA分型方法

1）PCR-SS序列特异性引物PCF技术：

特异性强、重复性好2）PCR-RFLP3、中和试验的基本原理？

1）不完全Ab

2）遮断作用

3）判断不完全Ab是否与Ag凝集

4、Oh型血清学特点？

1）在RBC上及唾液中均无ABH抗原，即不被抗A、抗B及抗H所凝集

2）血清中有抗A、抗B及抗H凝集素，可分别凝集A、B、0型RBC

第九章白细胞血型

1、HLA抗原的分布

1）HLA-I类抗原：

分布广发，几乎存在于所有的有核细胞表面，以淋巴细胞上的密度最高。

2）成熟RBC上没有HLA-AB、和DR抗原，幼稚RBC却有。

3）HLA-II类抗原：

密度最高者为DC单核细胞，一些吞噬细胞亚群及B细胞；

4）II类抗原作为一种分化抗原在不同细胞上表达，大多数骨髓分化细胞具有HLA-II类抗原。

2、HLA命名原则

1）以大写字母A、DC....表示HLA遗传区域中的座位

2）HLA抗原特异性用数字表示

3）为防止与补体组分命名相混淆，HLA-C抗原特异性以Cw为字首命名

4）HLA基因命名一般以4位数字表示，其中前2位数字表示对应最相近的HLA抗原特异性，后2位数字则用于表示亚型的等位基因，如A*0101

5）如果出现第五位数字，则代表“沉默取代”，即该基因虽发生了个别碱基的替换，但新密码子与原密码子属简并密码，不影响所编码的氨基酸序列

6）第6、7位数字代表相应的启动子序列的多态性

7）末尾加英文字母N表示无效基因或不表达基因

8）在不能区分等位基因时，可允许最前面的2位或4位数字表示该HLA的特异性

3、HLA遗传特征

1）共显性遗传：

每个HLA基因座表达一对抗原，人类HLA每个基因座上有众多等位基

因。

故如果血清学方法分型时，个体只检测出了一个抗原则有三种可能：

该抗原的

纯合子、HLA血清板不完全、存在一种至今尚未发现的抗原。

2）单倍型遗传：

单倍体是指一条染色体上HLA各基因座的基因紧密连锁组成的基因遗传单位。

3）连锁不平衡：

HLA在实际群体调查发现，各基因座的基因并非完全随机组成单倍型，

有些单倍型观察频率高于期望频率或低于期望频率，这种现象称为连锁不平衡。

处

于连锁部平衡状态说明HLA不同基因座的基因之间存在关联，具有一同遗传的趋向。

4）HLA高多态性

4、微量淋巴细胞毒性试验原理（血清学分型）

1）微量淋巴细胞毒性试验或称补体依赖的细胞毒性试验，其分型原理为

2）Ag-Ab-C:

淋巴细胞膜上的HLA抗原与已知HLA血清中相应抗体结合后，形成抗原抗体

复合物，再结合补体。

3）C激活、破坏Lc:

被激活的补体系统产生细胞毒性，攻击淋巴细胞，淋巴细胞膜破坏。

4）死细胞着色:

经过染色，染料进入破损细胞内着色，为阳性结果。

5）计数:

在倒置相差显微镜下观察，计数着色细胞所占细胞数目的百分比。

5、HLA抗血清与交叉反应

成功的关键是HLA抗血清的质量

根据与抗原决定镞的反应，可把HLA抗体分为2组：

1）抗体仅与一种HLA基因产物反应

2）抗体能与不止一种HLA基因产物结合

6斑点杂交（PCR-SS（分型方法）

将PCFT增片段制成斑点，用等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO杂交，通过探针放射自

显影结果进行HLA分型。

反向斑点杂交（RDB:

把探针预先固定在膜上，标记PCF引物。

7、比较HLA血清学分型和DNA分