乳酸测定方法的初步研究.doc

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乳酸测定方法初步研究

摘要

乳酸是重要的生化产品，广泛应用于食品、医药、环保等各领域，目前L-乳酸的主要生产方法为微生物发酵法。

近年来由于其可用于合成可降解塑料——聚乳酸的性质而受到众多的关注，具有广阔的市场前景。

本研究利用薄层色谱、EDTA和对羟基联苯法建立了乳酸的定性定量检测方法，并对实验条件范围进行了研究，结果如下：

1、得到了分离提纯精制L-乳酸的具体参数：

实验分别在55℃、60℃、65℃、70℃四个温度下直接用50%的稀硫酸酸解浓缩的乳酸钙溶液，用0.1%甲基紫溶液作为指示剂对粗L-乳酸进行了精制。

在此范围内均可得到纯度大于90%的乳酸，精制后的乳酸颜色清澈，对精制的乳酸进行第二次分子蒸馏得到了结晶乳酸。

采用分子蒸馏技术精制L-乳酸，在操作压力为0.1Pa，蒸馏温度为70℃效果最好，同时实验发现适宜的蒸馏温度应低于75℃。

2、确定了乳酸的薄层定性分析条件，实验结果表明，定性分析方法效果良好；方法简单，精确度高，显色稳定，重复性好，可应用于乳酸含量的测定。

3、确定了利用EDTA法测定乳酸的可行性。

在消除其他离子干扰的前提下，钙离子可迅速与乙二胺四乙酸二钠反应，以钙—经酸为指示剂，用EDTA标准溶液滴定，溶液成纯蓝色为滴定终点，用滴定消耗的EDTA体积和摩尔浓度可求得乳酸钙的含量。

4、在一定浓度范围内，乳酸含量与565nm处波长吸光度呈线性关系，因此，可以通过测定565nm处的吸光度来测定乳酸的含量。

通过实验证明此方法可行并且快速有效。

5、用DNS法测定残糖含量中。

以葡萄糖的浓度Y（mg/ml）对540nm分光光度值，进行线性回归，其回归方程为Y=1.4163X+0.0255，相关系数为0.9988。

为以后测定发酵液中残糖含量奠定了基础。

关键字：

L-乳酸，精制，测定，分离，含量

目录

前言 -2-

第一章文献综述 -2-

1.1乳酸的性质 -2-

1.1.1乳酸的分子结构 -2-

1.1.2乳酸的理化性质 -3-

第二章乳酸测定方法研究 -3-

2.1引言 -3-

2.2发酵液中L-乳酸的分离精制 -4-

2.2.1仪器与方法 -4-

2.2.1.1仪器及试剂 -4-

2.2.1.2实验方法 -4-

2.2.1.3结果与讨论 -5-

2.3同型、异型乳酸发酵的确定（薄层色谱） -6-

2.3.1仪器与方法 -6-

2.3.1.1仪器及试剂 -6-

2.3.1.2实验方法 -6-

2.3.1.3结果与讨论 -7-

2.4乳酸含量测定 -8-

2.4.1EDTA滴定法确定乳酸含量仪器与方法 -8-

2.4.1.1仪器及试剂 -8-

2.4.1.2实验方法 -9-

2.4.1.3结果与讨论 -9-

2.4.2分光光度法标准曲线确定乳酸含量仪器与方法 -9-

2.4.2.1仪器及试剂 -9-

2.4.2.2实验方法 -10-

2.4.2.3结果与讨论 -10-

2.5残糖含量的确定（DNS法） -12-

2.5.1仪器与方法 -12-

2.5.1.1仪器及试剂 -12-

2.5.1.2实验方法 -12-

2.5.1.3结果与讨论 -12-

第三章结论 -13-

3.1结论 -13-

参考文献 -13-

致谢 -14-

前言

乳酸是重要的生化产品，广泛应用于食品、医药、环保等各领域，目前L-乳酸的主要生产方法为微生物发酵法。

乳酸发酵液的成分复杂，并且因原料和发酵工艺不同而各不相同。

除乳酸外，发酵液中还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、胶体、有机杂酸、无机盐等多种杂质，因此从乳酸发酵液中提取乳酸是比较困难的。

要得到精制乳酸就必须对其进行再加工，除去其中含有的有机物杂质。

在国际上食品级的乳酸价格在52美分/磅，而精制的乳酸价格在1美元/磅，两者的价格差很大。

本文围绕上述问题进行了一系列的研究。

首先，进行了细菌乳酸发酵的提纯分离精制的研究，特别是温度对提纯过程的影响，其次，利用薄层色谱法、EDTA法、DNS法、分光光度法进行了对发酵液中乳酸测定研究，为实验室规模分析和制备高纯L-乳酸的工艺的提供了实验和理论依据。

第一章文献综述

1.1乳酸的性质

1.1.1乳酸的分子结构

乳酸，英文名Lacticacid，学名为α-羟基丙酸（α-hydroxypropanoicacid），分子式为C2H5OCOOH，分子量90.08，是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。

乳酸分子内含有一个不对称的C原子，因此具有旋光性，从而具有D-型和L-型两种构型。

L-乳酸为右旋，D-乳酸是左旋的，DL-乳酸为消旋性，其结构式如下：

1.1.2乳酸的理化性质

乳酸异构体的理化性质如表1-1所示：

表1-1乳酸异构体的理化性质

乳酸易与水互溶，很不容易结晶出来。

乳酸浓度达60%以上有很强的吸湿性，商品乳酸通常为60%溶液，药典级的乳酸含量为85.0%~90.0%，食品级的乳酸含量为80%以上。

通常乳酸为无色透明或浅黄色糖浆状的粘性液，几乎无臭或微带有脂肪酸臭，味酸。

与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙酮混溶，它几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯，相对密度1.249，沸点122℃（2KPa），常压沸点190℃。

在67~133Pa的真空条件下反复分馏，可以得到高纯度的乳酸，进而获得单斜晶体的结晶乳酸。

但乳酸属热敏性物质，为保证乳酸无明显的分解，蒸馏温度不能超过130℃。

由于乳酸含有一个羟基和一个羧基，因此它可以参与许多反应。

如氧化反应、还原反应、缩合反应和酯化反应等。

第二章乳酸测定方法研究

2.1引言

乳酸易与水互溶，很不容易结晶出来。

乳酸浓度达60%以上有很强的吸湿性，商品乳酸通常为60%溶液，药典级的乳酸含量为85.0%~90.0%，食品级的乳酸含量为80%以上通常乳酸为无色透明或浅黄色糖浆状的粘性液，几乎无臭或微带有脂肪酸臭，味酸。

与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙酮混溶，它几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯，相对密度1.249，沸点122℃（2KPa），常压沸点190℃。

由于乳酸含有一个羟基和一个羧基，因此它可以参与许多反应。

如氧化反应、还原反应、缩合反应和酯化反应等

目前，国外主要是以细菌为主，开展L-乳酸的发酵生产和研究，原因在于细菌厌氧发酵可大规模降低能耗，减少乳酸的生产成本。

乳酸细菌发酵机理如图所示。

细菌乳酸发酵代谢途径图解

A----同型乳酸发酵B----异型乳酸发酵C----混合酸乳酸发酵

2.2发酵液中L-乳酸的分离精制

2.2.1仪器与方法

2.2.1.1仪器及试剂

分子蒸馏装置、水浴锅、离心机、旋转蒸发仪

50%稀硫酸溶液、0.1%甲基紫溶液

2.2.1.2实验方法

乳酸发酵液的成分复杂，除乳酸外，发酵液中还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、其他有机酸和无机盐等多种杂质。

这些杂质来源于发酵的原料、未消耗的营养盐或发酵的中间副产物。

从乳酸含量约10%-20%成分复杂的发酵液中提取高纯度的乳酸是比较复杂的工艺，方法主要有：

钙盐法、萃取法、吸附法、膜法、普通蒸馏法、分子蒸馏法等

①乳酸的参数

L-乳酸的熔点：

52.8-54.0℃，分子量：

90.08。

外消旋DL乳酸的熔点为16.8℃，沸点为122℃（14mmHg），相对密度1.249.与水完全互溶，不易结晶。

60%以上浓度的乳酸溶液有很强的吸湿性，乳酸能随热水蒸气挥发，常压蒸馏则分解，浓缩至质量分数为50%时部分转变成乳酸酐，含量为80%-90%乳酸产品一般含有10%-15%乳酸酐。

②实验流程简述

发酵液的主要成分是乳酸钙，实验采用乳酸钙直接酸解工艺制备粗乳酸，酸解所得的粗乳酸直接用旋转蒸发仪浓缩到几乎无水的状态，再将该浓缩乳酸加入分子蒸馏设备进行精制。

③实验具体步骤

（1）取出成熟发酵液及时升温至90-100℃，并同时加入石灰乳碱化处理，将pH调至9.5-10（不可再高，否则残糖与氨基酸易发生褐色反应），搅匀后，静止4-6h，使菌体等悬浮物沉降下来，该澄清过程应保温55℃。

（2）将上清液倒出，再趁热过滤下部含较多沉淀的液体，将两部分液体合并，得到乳酸钙溶液。

（3）将得到的乳酸钙溶液加到旋转蒸发仪中，在温度为70℃，真空度为0.2个大气压条件下浓缩脱水，当乳酸钙的浓度达到25%-28%时停止。

（4）控制温度为70℃左右，直接用50%的稀硫酸酸解浓缩的乳酸钙溶液。

用0.1%甲基紫溶液作为指示剂，早点板上检测酸解终点，刚好酸解完全时呈菊黄色，乳酸钙过量呈紫色，稀硫酸过量成绿色。

硫酸过量可以相应地补加适量的Ca（oH）2，酸解完全静止1-2h使CaSO4充分析出。

（5）再经减压抽滤，除去CaSO4滤渣，得到粗的L-乳酸溶液再经旋转蒸发器浓缩脱水（温度70℃，真空度0.2个大气压），尽可能脱去水分。

（6）最后将抽滤浓缩的L-乳酸加入到分子蒸馏设备中进行L-乳酸精制（设定条件为：

操作压力为0.1Pa，蒸发温度为55-70℃，转子速率120r/min，进料速率为90ml/h）

2.2.1.3结果与讨论

实验分别在55℃、60℃、65℃、70℃四个温度下对粗L-乳酸进行了精制。

在此范围内均可得到纯度大于90%的乳酸，精制后的乳酸颜色清澈，对精制的乳酸进行第二次分子蒸馏得到了结晶乳酸。

采用分子蒸馏技术精制L-乳酸，在操作压力为0.1Pa，蒸馏温度为70℃效果最好，同时实验发现适宜的蒸馏温度应低于75℃，可以避免重组分堵塞设备造成设备清洗困难。

采用分子蒸馏技术精制L-乳酸，原料可以是未经脱色处理的含水量较少的粗乳酸，直接用分子蒸馏方法进行蒸馏就可得到各种浓度需要的L-乳酸产品。

需要注意的是粗乳酸中糖含量应尽可能的降低，含糖过高时料液会粘在蒸发面上使整流操作无法进行。

2.3同型、异型乳酸发酵的确定（薄层色谱）

2.3.1仪器与方法

2.3.1.1仪器及试剂

离心机、分液漏斗、减压蒸馏装置、硅胶板、展开槽

硫酸、乙醚、甲醇、乙醇、双蒸水、乙酸乙酯、氨水、甲酸、乙酸、氯仿、丙酮

2.3.1.2实验方法

①乳酸发酵液预处理及标准品溶液的配制

乳酸发酵液预处理：

各样品先用0.5mol/L硫酸调节pH至2，离心除去沉淀后，用10ml蒸馏水分两次洗沉淀，洗液归并入离心所得上层清夜中，将清液移至分液漏斗中，用乙醚提取乳酸，每次用量与清液体积相等，提取四次。

然后放置于减压蒸馏上，使乙醚挥发完后，用10ml乙醇来溶解，作为供试液。

标准品溶液配制：

用双蒸水稀释88%的分析纯乳酸配制得浓度为20g/L的乳酸标准溶液，用0.45um滤膜过滤，置于冰箱中备用。

②展开剂的选择

展开剂一般现用现配，选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，剧烈震荡，使混合液充分混合。

根据研究对象的极性，本文选择的展开剂主要有以下几种：

展开剂1乙酸乙酯—2.5%氨水（95：

5，v/v）

展开剂2氯仿—乙酸乙酯—甲酸（5：

4：

1，v/v/v）

展开剂3乙酸乙酯—乙酸—水（50：

12：

10，v/v/v）

展开剂4氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸（7：

1：

1.5：

0.5，v/v/v/v）

③点样

在薄层板上距底端约0.5cm处划出点样线（原线），再用铅笔每隔约0.5cm作一圆点，标记为点样处。

用玻璃制的毛细管吸取适量样液点样，若样品为水溶液，需边点样边加热干燥，防止斑点扩散，样点直径控制在2~3mm范围内，勿损伤薄层表面。

④展开

展开前先将适量混合均匀的展开剂倒入层析缸，密闭15~30分钟，用凡士林封口，使溶剂蒸汽饱和。

将上样后的薄层板放入层析缸中，采用直立上行一次展开或二次展开，展距约为3cm时，取出放于通风橱晾干。

⑤显色方法的选择

显色方法10.5%溴酚蓝酒精溶液喷雾后于105℃烘箱烘10分钟左右，显色

显色方法2碘蒸汽显色

2.3.1.3结果与讨论

1）吸附剂的选择

薄层色谱简写作TLC（ThinLayerChromatography），它是在吸附色谱的基础上发展起来的，包括有吸附、分配、离子交换、透析等作用，既有物理作用，兼有某些化学作用，并不是一种单一的机制。

但对不同的色谱方法来说，总有一种占主要地位；移动相是液体，固定相是固体时，吸附和解吸附占主要地位；移动相和固定相都是液体的薄层色谱，则分配规律占主导地位。

实践证明，不论是水溶性的糖、氨基酸或脂溶性的脂肪油、挥发油等都可以在吸附薄层上展开。

吸附薄层常用的吸附剂有硅胶、氧化铝和聚酰胺等。

硅胶略带酸性，适用于分离酸性及中性的物质，氧化铝带碱性，适用于碱性物质和中性物质的分离。

聚酰胺只对黄酮等某几类化合物分离效果较好。

故本文选用硅胶作为吸附剂。

（2）展开剂的选择

①溶剂系统的选择

在吸附层析中，当所用吸附剂已定，则对同一化合物的解吸能力与展开剂的极性有关。

展开剂一般是2~3种低沸点有机溶剂组成的多元溶剂系统。

展开剂选择的基本原则是：

能溶解待测组分；能使待测组分与杂质分开，达到基线分离；使待测组分斑点集中；使待测组分的Rf值（即比移值，表示物质在薄层色谱图谱上的相对位置）在0.3~0.85之间，比移值的计算方法为：

Rf=OS/OF

其中，OS为从原点到斑点中心的距离，OF为原点到展开剂前沿的距离。

本文所选择的四种展开剂实验结果如下：

展开剂1：

展开后薄层板上成一条直线，说明其分离度不够；

展开剂2：

各斑点仍留在原线，说明极性太弱；

展开剂3：

未形成斑点，成为和溶剂前沿几乎平行的一条带，说明极性太强；

展开剂4：

各发酵液样品基本都能分离出大小合适的斑点，其中较大的斑点Rf值与88%纯度的乳酸分析纯Rf保持一致。

②氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸展开剂组分配比的研究

根据实验结果，氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸基本能达到分离的要求，但是还存在少许拖尾现象，这可能是由于冰醋酸加入量偏少的原因，冰醋酸在此展开系统中的作用主要是减少拖尾现象，因此，本文适当提高了氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸展开剂中冰醋酸的含量，对以下的不同配比作了研究：

配比二氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸（7：

1：

1.5：

0.5）

配比二氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸（7：

1：

1.5：

0.8）

配比三氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸（7：

1：

1.5：

1.0）

结果表明，配比二的综合效果最好，配比一中冰醋酸含量较低，非极性溶剂所占比重较大，而待测物质乳酸极性强，两者之间作用力较弱，导致拖尾现象，层析效果差；配比三中冰醋酸含量较多，容易脱酸不彻底，使乳酸显色受到影响。

所以，氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸体积为7：

1：

1.5：

0.8是最佳展开剂配比。

③显色条件的选择

薄层色谱的定位方法有物理检出法、化学检出法、生物与酶检出法、放射显影法。

由于乳酸分子内没有共轭的发色基团，不适合用紫外线显色，而乳酸呈酸性，可考虑采用pH指示剂溴酚蓝；元素碘是一种非破坏性显色剂，能检出大量的化合物，且价廉易得，显色迅速、灵敏，故本文对指示剂溴酚蓝和碘显色两种方法进行了研究。

结果表明，溴酚蓝显色反应很灵敏，但在配制溴酚蓝酒精溶液时应将溶液pH值调到溶液刚好呈兰紫色，否则显色反应不灵敏；操作时喷雾应均匀适度，量小显色不清楚，量大则可能溶解乳酸，使斑点扩大；高温显色时须控制好时间，溴酚蓝遇酸显色为化学变化，长时间高温会使有色物质分解，造成乳酸斑点无法辨认，影响分析效果。

用碘显色材料易得、操作简单，碘显色后在酸斑点存在的位置为黄色或无色，无色可能是因为乳酸分子中的双键的存在，使得两种物质发生了不可逆的加成反应，使显色效果不明显。

为方便操作，在后续的研究中都采用碘蒸气作为显色剂。

按照以上所确定的薄层层析分析条件，取乳酸发酵液样品进行薄层分析，结果如图2.1。

由图2.1可知，发酵液中以乳酸产物为主。

123123

1—乳酸发酵液A2—乳酸发酵液B3—乳酸标准品

溴酚蓝显色效果碘蒸气显色效果

综上所诉，确定了乳酸的薄层层析定性分析条件,以薄层层析硅胶为固定相，氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸（7：

1：

1.5：

0.8）为展开剂，0.5%溴酚蓝酒精溶液喷雾显色或碘蒸气显色都得到了良好的分析效果，但碘蒸气法更简单明显。

2.4乳酸含量测定

2.4.1EDTA滴定法确定乳酸含量仪器与方法

2.4.1.1仪器及试剂

氢氧化钠（分析纯）溶液:

20%（m/v）

三乙醇胺（分析纯）1:

1水溶液

钙混合指示剂:

钙一轻酸指示剂1克与99克氯化钠（GB1266一77，分析纯）混匀研细，棕色瓶保存

盐酸轻胺（HG3一967一76）:

分析纯

乙二胺四乙酸二钠（GB1401一78）标准溶液，0.05mol/l

2.4.1.2实验方法

乳酸钙可在热水中迅速溶解，并离解成钙离子和乳酸离子，而磷酸氢钙和石灰等钙离子不溶于水，在消除其他离子干扰的前提下，钙离子可迅速与乙二胺四乙酸二钠反应，以钙—经酸为指示剂，用EDTA标准溶液滴定，溶液成纯蓝色为滴定终点，用滴定消耗的EDTA体积和摩尔浓度可求得乳酸钙的含量。

称取样品1克（准确至0.0002克）于100ml杯中，加水80ml，在电炉上加热至近沸，继续加热5分钟（小心不要溶液溢出），冷却，定

容100ml，待溶液澄清后（或过滤），吸取上清液（滤液）10ml于锥形瓶中，加三乙醇胺10ml、蒸馏水50ml、氢氧化钠溶液10ml、0.5克盐酸轻胺摇匀后，再加钙混合指示剂少许，立即用乙二胺四乙酸二钠标准溶液滴定，溶液呈现纯蓝色为滴定终点。

2.4.1.3结果与讨论

乳酸钙（%）=乳酸浓度（g/L）=90.08×C×V

v一滴定所消耗乙二胺四乙酸二钠标准溶液体积（ml）

C一乙二胺四乙酸二钠溶液浓度（mol/l）

M一称样重量（g）

0.2182一每毫摩尔分子乳酸钙的克数

90.08一乳酸的摩尔质量

V2一定容的样液体积（ml）

V1一吸取液的体积（ml）

每个试样取两个平行样测定，以其算术平均值作为结果。

当乳酸钙含量在25%以上，允许相对偏差为1%;乳酸钙含量在10%—25%，

允许相对偏差为2%;乳酸钙含量在10%以下，允许相对偏差为3%。

2.4.2分光光度法标准曲线确定乳酸含量仪器与方法

2.4.2.1仪器及试剂

UV-2100型紫外分光光度计、UV-240紫外可见扫描仪、振荡器、水浴锅、离心机、

无水乳酸锂、对羟基联苯、钨酸钠、硫酸铜、氢氧化钙、浓硫酸均为分析纯试剂；

钨酸溶液：

0.667M硫酸及10%（W/V）钨酸钠溶液等体积混合，现配现用

20%（W/V）硫酸铜：

称取硫酸铜20g，加蒸馏水定容至100ml。

1.5%对羟基联苯溶液：

称取对羟基联苯1.5g溶于0.125mol/L氢氧化钠100ml中（配时加热助溶，溶后为澄清液体）。

贮于棕色瓶中，保存于4度冰箱，可使用一个月。

乳酸标准储存液（0.5mg/ml）：

精确称取五水乳酸锂53.25mg，溶于50ml蒸馏水中，加0.5M硫酸10ml，后加蒸馏水定容至100ml。

混匀后保存于4度冰箱。

2.4.2.2实验方法

①发酵样品预处理

取适量发酵液样品5000r/min离心10min，以除去菌体和碳酸钙沉淀，吸取上清液0.5ml置于洁净离心管中，加入等体积1mol/L硫酸，静置约二十分钟后10000r/m离心十分钟，以除去硫酸钙。

取上清液适当稀释，吸取稀释液2.00ml于洁净离心管中，加入2.00ml钨酸溶液，混匀，室温静置至溶液出现明显絮状物出现（约45min），10000r/m离心10min,取上清置于10ml洁净离心管中，60℃水浴保温0.5h，冷却待用。

②最大吸收波长的确定

ⅰ精确吸取5ml待测液于具塞试管中，加入0.1g氢氧化钙，混匀，然后加入0.2ml20%硫酸铜，迅速混匀，沸水浴3min，水浴冷却，3000r/m离心5min，取上清液0.5ml入比色管中。

ⅱ加入6ml浓硫酸，混匀，沸水浴加热5min，取出后冰水浴冷却。

ⅲ加入1.5%对羟基联苯溶液0.1ml，充分混摇，静置30min。

ⅳ置于沸水浴中加热90s，冰水浴冷却，在400~700nm波长范围内进行扫描，蒸馏水为空白做参比液，确定最大吸收波长。

③最佳显色条件的确定

以氢氧化钙、硫酸铜、浓硫酸、对羟基联苯溶液用量，静置显色时间，最后加热显色时间作为考察因素，采用正交设计选择最佳显色条件。

④乳酸标准曲线的制作

用0.5mg/ml乳酸标准液，与发酵液同样预处理后，取0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.70、0.80、1.00ml处理液分别置于15支预先编好号的试管，各加水补足体积至5ml，按第三步中所确定的最佳显色条件操作，分别测定吸光度。

以乳酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，作出标准曲线。

2.4.2.3结果与讨论

在乳酸发酵的过程中乳酸通常以乳酸钙的形式存在，通过去除发酵液中的葡萄糖和蛋白质，并加入适当浓度硫酸酸化，钙离子转化成难溶的硫酸钙沉淀，使溶解度不高的乳酸钙全部转变为乳酸。

乳酸在铜离子的催化下，与浓硫酸作用生成乙醛，乙醛能与对羟基联苯作用生成在565nm处有特征吸收的紫色物质。

在一定浓度范围内，乳酸含量与565nm处波长吸光度呈线性关系，因此，可以通过测定565nm处的吸光度来测定乳酸的含量。

（1）最大吸收波长的确定

乳酸发酵液样品显色后，扫描结果见图2.2，表明，最大吸收波长为565nm。

最大吸收波长的确定

（2）最佳显色条件的选择

结果表明，氢氧化钙和浓硫酸的加入量对显色反应影响显著，其余因素的作用不显著，最佳显色条件为A2B3C2D1E1F3，即氢氧化钙0.05

g，20%硫酸铜0.8ml，浓硫酸6ml，对羟基联苯0.125ml，静置时间15min，加热显色时间5min。

（3）乳酸标准曲线的制备

乳酸标准应用液浓度在10~80μg/ml范围内与吸光度值基本呈线性关系，当浓度大于等于60μg/ml时吸光度值大于1，考虑到仪器误差的因素，故制备标准曲线时浓度范围取在15、20、25、30、35、40、45、50μg/ml，得到如图2.4的乳酸标准曲线，求得标准曲线回归方程为A=0.0189C－0.0808（A为吸光度值，C为乳酸浓度，n=8），r=0.9989，在15~50μg/ml范围内呈良好线性关系。

乳酸标准应用液浓度与吸光度值之间的关系

乳酸标准曲线

本实验对发酵液进行预处理，排除蛋白质和葡萄糖的干扰，使测定结果更接近真实值；优化了显色条件，使测定时操作简便，精确度高，显色稳定，准确度高，适合于发酵液中乳酸含量的测定。

2.5残糖含量的确定（DNS法）

2.5.1仪器与方法

2.5.1.1仪器及试剂

UV-2100型紫外分光光度计、振荡器、水浴锅、离心机、

3,5-二硝基水杨酸

2.5.1.2实验方法

在碱性条件下，还