猪瘟活疫苗纯化浓缩研究兽用疫苗国家工程实验室研究开发项目可行性研究报告Word下载.docx

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（三）技术突破对行业技术进步的重要意义和作用

目前有时羊痘弱毒苗疫苗毒可引起皮肤反应或扩散该病。

Abo-shehada报道约旦注射弱毒苗引起羊痘爆发的病例。

国内也经常发生弱毒苗免疫羊群导致羊群发病流产等病例。

说明目前生产中应用的羊痘弱毒苗毒力还是很强。

还有羊痘弱毒苗毒株的培养主要用羔羊睾丸原代细胞。

羔羊睾丸原代细胞的制备需要大量的人力、物力和财力，制备过程繁琐，而且羔羊睾丸不能随时采到，制备的羔羊睾丸原代细胞不能多次传代多次。

而传代细胞如BHK21细胞等在实验室内常用且没有以上原代细胞的缺点，因此用BHK21细胞等培养羊痘弱毒苗病毒可以省时省力，特别是生物制药厂批量培养山羊痘弱毒苗病毒时节省成本、提高产量等方面具有重要意义。

因此研制安全有效的羊痘弱毒苗应用于羊痘的预防和控制，对促进和保障养羊业健康发展，增强金宇保灵生物药品有限公司疫苗产品的竞争力，提高金宇保灵生物药品有限公司的名誉，使金宇保灵生物药品有限公司取得巨大的经济效益和社会效益。

（四）市场需求分析

羊痘已成为我国羊群主要的流行疫病之一，而且我国主要养羊的省区该病的流行逐渐增多，呈现出不断上升的趋势。

到目前为止没有一个很有效和安全的羊痘疫苗用于羊痘的防治。

因此养羊业急需有效安全的羊痘疫苗。

参考文献

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[2]洪艳,谢忠文,施恒豫.人感染山羊痘5例[J].中华传染病杂志,2005,23

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[3]康文玉,徐自忠,高洪,等.羊痘的研究进展[J].畜牧兽医杂志,2005,24（3）:

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[4]SAJVIAM,RAO.R：

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羊痘弱毒疫苗的研究第一报羊痘病毒鸡胚培养的研究[J].畜牧兽医学报，1957，2

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[8]KitchingRP,TaylorWP.Clinicalandantigenticrelationshipbetweenisolatesofsheepandgoatpoxviruses[J].TropAni-umHealthProd,1985,17:

64-74.

二、研究方案

1.研究内容和研究目标，拟解决的关键问题

（1）研究内容

1）蔗糖密度梯度离心法定量CSFV检测技术研究

2）猪瘟活疫苗纯化工艺研究

3）猪瘟活疫苗超滤浓缩工艺研究

4）猪瘟活疫苗PEG沉淀工艺研究

5）猪瘟活疫苗层析工艺研究

6）免疫力产生时间及攻毒保护试验

7）效力检验

（2）研究目标

1）建立CSFV蔗糖密度梯度离心定量检测方法

2）建立猪瘟活疫苗纯化浓缩工艺，研制高效，低副反应的免疫抗原

（3）拟解决的关键问题

1）通过CSFV蔗糖密度梯度离心定量检测方法，建立猪瘟活疫苗企业内控标准

，解决CSFV活疫苗抗原定量的问题。

2）通过澄清，超滤，PEG沉淀等方法，提高单位体积内抗原含量，降低抗原内杂蛋白含量。

2.研究方法、技术路线及可行性分析

（1）研究方法

1）CSFV蔗糖密度梯度离心定量检测：

2）纯化工艺研究：

①深层过滤工艺试验研究

②中空纤维澄清实验研究

3）超滤浓缩工艺研究

4）PEG沉淀工艺研究：

5）层析工艺研究：

6）免疫力产生时间及攻毒保护试验：

用50-100毫升普通肉汤和厌气肉肝汤培养基各2管，各接种0．2毫升，培养72小时，应无细菌生长。

如有细菌生长，可另加适量抗菌素，在0-4℃冰箱内处理24—48小时后，再以同样方法培养，无菌者始可用作毒种。

7）效力检验：

①制苗毒力标准：

②疫苗效力检验：

。

（2）技术路线

CSFV细胞毒

CSFV蔗糖密度梯度离心及鉴定

深层滤器或中空纤维澄清

评价抗原得率，判断是否可行

CSFV蔗糖密度梯度离心定量

中空纤维或膜包超滤浓缩

PEG沉淀浓缩

兔体感染量相关性

实时荧光定量方法相关性

6FF或core700层析

CSFV蔗糖密度梯度离心定量敏感性、特异性、重复性

配苗冻干

效力检测及攻毒保护试验

（3）可行性分析

项目主持人和主要参与人员都主持或参加过同等水平的科学研究并掌握了有关的实验技术。

金宇保灵生物制药厂和兽用疫苗国家工程实验室拥有国内先进的从事微生物学、分子生物学和疫苗开发研究的资金、仪器设备和试验动物研究室。

这些均为该项目的事实和顺利完成奠定了良好基础，可保证预期的研究目标。

三、研究项目的目标及进度

1.项目总体目标

2）建立猪瘟活疫苗纯化浓缩工艺，研制高效，低副反应的免疫抗原

2.实施年限

2015年4月—2016年12月

－5－

3.年度计划安排及具体的考核指标

1）2015.4--2015.10

CSFV蔗糖密度梯度离心定量检测方法的建立

2）2015.10—2016.4

疫苗纯化浓缩工艺研究

3）2016.4—2015.6

疫苗安全性、效力检验、攻毒保护和试验。

4）2016.6—2015.12

产业化试制

4．预期研究成果项目可能取得的专利、技术标准、论文、著作、新产品、新工艺等，以及知识产权分析。

2）建立CSFV疫苗纯化浓缩工艺

3）在中文核心期刊上发表1-2篇论文。

4）申请猪瘟细胞苗高效纯化浓缩方法的专利。

－6－

四、研究基础

1.与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩

主持人和主要参加人参加陕西科技攻关项目及西北农林科技大学青年骨干支持计划，在抗原纯化浓缩、抗原检测等方面具有丰富的经验。

在病毒检测方面，第一作者发表SCI论文一篇（IF=2.01）。

2.已具备的实验条件和资料，尚缺少的实验条件和资料及解决的途径

金宇保灵生物制药厂和兽用疫苗国家工程实验室拥有国内先进的从事微生物学、分子生物学和疫苗开发研究的仪器设备和试验动物研究室。

这些实验条件基本满足本研究所需。

－7－

3.申请者和项目组主要成员研究工作简历，与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究成绩；

近期发表与本项目有关的主要成果、论著目录、获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。

陈光达：

2009年毕业于内蒙古农业大学动物医学专业，获得学士学位。

2012年毕业于西北农林科技大学预防兽医专业，获得硕士学位。

发表的论文有：

1Xin-GangXu,Guang-DaChen（并列第一作者）,YongHuang,LiDing,Zhao-caiLi,De-WenTong,Hung-JenLiu.2012.DevelopmentofmultiplexPCRforsimultaneousdetectionofsixswineDNAandRNAviruses.JVirologicalMethods,183

（1）:

69-74.JVirologicalMethods,2012.

2陈光达，许信刚，童德文，2011，PCV-2、PPV和PRV多重PCR检测方法的建立及初步应用。

西北农林科技大学学报（自然科学版），已接收。

3许信刚，陈光达，童德文，2011，检测CSFV、PRRSV和JEV感染的多重RT-PCR方法的建立及初步应用。

中国兽医学报，已接收。

4丁利，陈光达，许信刚，童德文，2011，猪传染性胃肠炎病毒陕西株的分离鉴定及N基因序列分析.中国兽医杂志，已接收。

5张宽，陈光达，许信刚，童德文，2011，日本脑炎病毒引起细胞凋亡的信号转导通路研究进展.动物医学进展,32（5）:

108-112.

羡东堡：

田志辉：

－8－

项目名称

预算数

用途

1．论证调研费

2．技术资料费

3．试验材料费

665000

购SPF种蛋（1000*20元/枚）、羊（200*3000元/只）、细胞培养试剂、培养基、器皿等

4．分析测试费

5．差旅费

6．试验补助费

33500

试验加班补助费

7．设备购置费

5000

购孵化器

8．评审鉴定费

9．其它费用

10．合计

70.3500

五、经费预算单位：

元

主要仪器、设备、材料清单

设备、材料名称

型号、规格

单价

数量

金额（万元）

孵化器

2500

2

孵化SPF种蛋

－9－

六、兽用疫苗国家工程实验室审批意见

（盖章）

年月日

七、兽用疫苗国家工程实验室管理委员会审查意见

主任委员（签字）