SOD工程菌的构建实验报告.docx
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SOD工程菌的构建实验报告
生物工程综合实验
--SOD工程菌构建
实验报告集
班级生物工程1411学号
实验室学生守则
一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员
的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、
准确地完成实验任务，实事地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操
作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪
动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室
外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室抽烟和
吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管
理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、
水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室外的清洁卫生工作，
经指导老师许可后，方可离开。
预习报告
名称
SOD工程菌构建
日期
201712.11-12.13
实验目的和要求：
工程菌是利用基因工程的方法，将外源基因导入到适当的受体细胞株中，使其得到高效表达。
这种经改造后的细胞株称为工程菌。
工程菌在基因工程药物、污染治理、生物能源能多方面具有重要作用。
SOD（超氧化物歧化酶），是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新代谢过程中产生的有害物质。
人体在不断地补充SOD后会具有抗衰老的特殊效果，被卫生部批准为具有药物功能的物质。
因此，采用工程菌的原理和方法，体外大量合成SOD，有利于降低其生产成本，扩大使用围。
了解PCR的原理和实验流程。
了解质粒提取的原理和方法。
了解酶切的原理和方法，单双酶切的区别，粘性末端连接和平端连接的差异。
了解CaCl2法制备大肠杆菌DH5α感受态及转化的原理。
了解SDS-PAGE检测蛋白质的原理和方法。
实验材料：
pCM-T-SOD质粒、TaqDNA聚合酶、SOD特异性引物、dNTPsPET-32A质粒、质粒提取试剂盒SOD基因（PCR回收产物）、PET-32A质粒、EcoRV和HindIII限制性切酶大肠杆菌DH5α，1M预冷的CaCl2溶液，LB培养基，30%甘油，氨苄青霉素转化成功的菌液，蛋白上样缓冲液，Tris-Hcl，10%SDS，TEMED，10%AP（过硫酸铵），30%丙烯酰胺单体（29：
1）
主要仪器：
PCR仪水平凝胶电泳仪摇床、超净工作台、离心机、干燥培养箱垂直电泳系统、水浴锅
主要步骤：
一.PCR扩增SOD基因及胶回收纯化
PCR扩增
1.在PCR管中，加入如下PCR反应物：
名称
体积（μl）
10×Taqbuffer
5
SOD上游特异性引物
1
SOD下游特异性引物
1
dNTPs
1.5
质粒模板
3
Taq聚合酶
0.5
无菌水
38
总体积
50
2.PCR反应条件
95℃
5min
95℃
30s
30个循环
55℃
30s
72℃
1min
72℃
10min
4℃
Pause
2.1%TAE凝胶电泳
A.胶回收PCR产物
1）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若得到目的条带可进行大批量PCR，回收目的片段；
2）通过把切取含DNA片段的琼脂凝胶装在1.5mL小离心管中，称其重量近似地确定其体积，每100mg琼脂凝胶相当于100μL体积。
称量每次切取含DNA片段的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液BD；
3）55～65℃水浴7～10min直至胶完全融化，期间振荡3次，琼脂糖必须完全融化；
4）将溶液置于DNA纯化柱中，静置2min，12000rpm离心60s；若一次加不完，可分两次离心，弃滤液；
5）加入500μL溶液PE（初次使用前用无水乙醇按1：
4稀释）于离心柱中，12000rpm离心60s，弃滤液；
6）用溶液PE500μL再洗一遍，12000rpm离心60s，弃滤液；12000rpm再次离心2min，以甩干剩余液体；
7）将离心柱置于新的离心管中，加入60℃预热的30～100μL溶液Eluent于纯化柱中（硅胶膜中央），静置2min，12000rpm离心60s，管底即为回收DNA
8）重复步骤7；
9）无菌水溶解DNA，贮存于-20℃。
二．PET-32A质粒提取
1.取过夜菌1.5毫升，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。
再重复一次，每管共收集3毫升 过夜菌沉淀。
2.每管加入250微升溶液I，重悬细菌沉淀。
确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。
3.每管加入250微升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。
4.每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。
5.最高速（13,000rpm左右）室温离心10分钟。
6.将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱。
最高速离心30-60秒，倒弃收集管液体。
7.在质粒纯化柱加入750微升溶液IV，最高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管液体。
8.最高速再离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
9.将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上，加入50微升溶液V至管柱面上，放置1分钟。
10.最高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。
11.0.8%TAE凝胶电泳检测质粒完整性。
三．双酶切SOD基因和PET-32A质粒的双酶切及连接
A.SOD基因和PET-32A质粒的双酶切
1.在EP管中，加入如下双酶切体系
名称
加入体积（ul）
10×BufferM
2
EcoRV限制性切酶
1
HindIII限制性切酶
1
SOD基因/PET-32A质粒
8
无菌水
8
总体积20ul
2.上述反应体系，37℃反应2h。
B.酶切产物的回收
C.酶切片段连接
1.在EP管中，加入如下反应体系
名称
体积（ul）
10×T4DNA连接酶buffer
2
SOD基因酶切片段
5
PET-32A质粒酶切片段
5
T4DNA连接酶
1
无菌水
7
总体积20ul
2.16℃，反应过夜。
四．DH5α感受态制备及转化
A.感受态制备
1.LB培养基配制：
称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，调节pH至7.2，定容至1L。
高温高压灭菌。
2.转移0.1mlDH5α菌液于一只装有5-8mlLB的试管中.于37°C下，250rmp振荡培养2到2.5小时（检测OD600，控制其在0.4-0.5之间）。
3.室温下，4000rpm离心5分钟收集对数期细胞。
弃培养基，保留细胞沉淀。
4.加入5毫升冰冷的CaCl2溶液，并轻微打匀。
5.4°C下，4000rpm离心10分钟收集细胞。
6.加入0.5ml（每25ml初始培养物加入1ml）冰冷的0.1M的CaCl2溶液，并轻微打匀。
冰浴放置20min。
7.此时的感受态细胞可直接进行转化操作，也可以分装,加入1/10体积的30%甘油后于-70°C冰冻保藏。
B.转化
1.向事先灭菌，并经冷处理的1.5mlEP管中转移100ul感受态细胞悬浮液。
向每个转化管中加入10ul连接产物。
细心混匀管中成份。
于冰浴放置30到40分钟。
2.把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。
（此时不能摇动转化管）
3.把EP管迅速转移至冰浴2到3分钟。
随后向每个EP管中加入500ulLB培养基。
37°C200rmp摇菌45min，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。
4.上述反应物4000rmp离心2min，吸弃部分培养基，使剩余体积不超过200ul，吹打混匀，随后涂布于含有amp的LB-琼脂平板上。
5.37℃放置平板直到其上液体被吸收。
6.于37°C倒置平板培养。
转化克隆应该于12-16小时区间出现。
7.挑取单菌落，置于6ml含有amp的LB液体培养基中，37℃250rmp摇菌培养8h。
五．SDS-PAGE检测SOD蛋白的表达
1.取4ml转化成功的菌液，加入1ml蛋白上样缓冲液，100℃裂解10min。
2.4℃，12000rmp离心5min，收集上清。
3.将玻璃板、样品梳冲洗干净，晾干，随后组装玻璃板。
4.按如下体积配制10%分离胶8ml，混匀：
双蒸水
3.0ml
1.5MTris-HClpH8.8
2.1ml
30%Acr-Bis
2.8ml
10%SDS
100ul
10%AP
50ul
TEMED
5ul
5.向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层双蒸水，大约30min后胶即可聚合。
6.按如下体积配制4%浓缩胶3.0ml，混匀：
7.将上层双蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。
8.装好电泳系统，加入点击缓冲液，上样15ul。
9.调节电压至80V，待溴酚蓝跑如分离胶时，调节电压至120V，电泳至溴酚蓝刚跑出分离胶。
10.卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色2h，加入脱色液，置于摇床中，脱色。
期间每30min更换一次脱色液，至完全脱净。
教师签名：
实验报告
SOD工程菌构建
一、目的：
了解PCR的原理和实验流程。
了解质粒提取的原理和方法。
了解酶切的原理和方法，单双酶切的区别，粘性末端连接和平端连接的差异。
了解CaCl2法制备大肠杆菌DH5α感受态及转化的原理。
了解SDS-PAGE检测蛋白质的原理和方法
二、原理：
工程菌是利用基因工程的方法，将外源基因导入到适当的受体细胞株中，使其得到高效表达。
这种经改造后的细胞株称为工程菌。
工程菌在基因工程药物、污染治理、生物能源能多方面具有重要作用。
SOD（超氧化物歧化酶），是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新代谢过程中产生的有害物质。
人体在不断地补充SOD后会具有抗衰老的特殊效果，被卫生部批准为具有药物功能的物质。
因此，采用工程菌的原理和方法，体外大量合成SOD，有利于降低其生产成本，扩大使用围。
三、实验材料与方法
1、实验材料与试剂：
pCM-T-SOD质粒、TaqDNA聚合酶、SOD特异性引物、dNTPsPET-32A质粒、质粒提取试剂盒SOD基因（PCR回收产物）、PET-32A质粒、EcoRV和HindIII限制性切酶大肠杆菌DH5α，1M预冷的CaCl2溶液，LB培养基，30%甘油，氨苄青霉素转化成功的菌液，蛋白上样缓冲液，Tris-Hcl，10%SDS，TEMED，10%AP（过硫酸铵），30%丙烯酰胺单体（29：
1）
2、实验仪器：
PCR仪水平凝胶电泳仪摇床、超净工作台、离心机、干燥培养箱垂直电泳系统、水浴锅
3、实验方法：
一．PCR扩增SOD基因及胶回收纯化
PCR扩增
胶回收PCR产物
1）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若得到目的条带可进行大批量PCR，回收目的片段；
2）通过把切取含DNA片段的琼脂凝胶装在1.5mL小离心管中，称其重量近似地确定其体积，每100mg琼脂凝胶相当于100μL体积。
称量每次切取含DNA片段的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液BD；
3）55～65℃水浴7～10min直至胶完全融化，期间振荡3次，琼脂糖必须完全融化；
4）将溶液置于DNA纯化柱中，静置2min，12000rpm离心60s；
5）加入500μL溶液PE于离心柱中，12000rpm离心60s，弃滤液；
6）用溶液PE500μL再洗一遍，12000rpm离心60s，弃滤液；12000rpm再次离心2min，以甩干剩余液体；
7）将离心柱置于新的离心管中，加入60℃预热的30～100μL溶液Eluent于纯化柱中（硅胶膜中央），静置2min，12000rpm离心60s，管底即为回收DNA
8）重复步骤7；
9）无菌水溶解DNA，贮存于-20℃。
二．PET-32A质粒提取
1.取过夜菌1.5毫升，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。
再重复一次，每管共收集3毫升 过夜菌沉淀。
2.每管加入250微升溶液I，重悬细菌沉淀。
确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。
3.每管加入250微升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。
4.每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。
5.最高速（13,000rpm左右）室温离心10分钟。
6.将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱。
最高速离心30-60秒，倒弃收集管液体。
7.在质粒纯化柱加入750微升溶液IV，最高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管液体。
8.最高速再离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
9.将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上，加入50微升溶液V至管柱面上，放置1分钟。
10.最高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。
11.0.8%TAE凝胶电泳检测质粒完整性。
三．酶切SOD基因和PET-32A质粒的双酶切及连接
SOD基因和PET-32A质粒的双酶切
在EP管中，加入如下双酶切体系
名称
加入体积（ul）
10×BufferM
2
EcoRV限制性切酶
1
HindIII限制性切酶
1
SOD基因/PET-32A质粒
8
无菌水
8
总体积20ul
上述反应体系，37℃反应2h。
酶切产物的回收
四．DH5α感受态制备及转化
感受态制备
1.LB培养基配制：
称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，调节pH至7.2，定容至1L。
高温高压灭菌。
2.转移0.1mlDH5α菌液于一只装有5-8mlLB的试管中.于37°C下，250rmp振荡培养2到2.5小时（检测OD600，控制其在0.4-0.5之间）。
3.室温下，4000rpm离心5分钟收集对数期细胞。
弃培养基，保留细胞沉淀。
4.加入5毫升冰冷的CaCl2溶液，并轻微打匀。
5.4°C下，4000rpm离心10分钟收集细胞。
6.加入0.5ml（每25ml初始培养物加入1ml）冰冷的0.1M的CaCl2溶液，并轻微打匀。
冰浴放置20min。
7.此时的感受态细胞可直接进行转化操作，也可以分装,加入1/10体积的30%甘油后于-70°C冰冻保藏。
转化
8.向事先灭菌，并经冷处理的1.5mlEP管中转移100ul感受态细胞悬浮液。
向每个转化管中加入10ul连接产物。
细心混匀管中成份。
于冰浴放置30到40分钟。
9.把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。
（此时不能摇动转化管）
10.把EP管迅速转移至冰浴2到3分钟。
随后向每个EP管中加入500ulLB培养基。
37°C200rmp摇菌45min，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。
11.上述反应物4000rmp离心2min，吸弃部分培养基，使剩余体积不超过200ul，吹打混匀，随后涂布于含有amp的LB-琼脂平板上。
12.37℃放置平板直到其上液体被吸收。
13.于37°C倒置平板培养。
转化克隆应该于12-16小时区间出现。
14.挑取单菌落，置于6ml含有amp的LB液体培养基中，37℃250rmp摇菌培养8h。
五．SDS-PAGE检测SOD蛋白的表达
1.取4ml转化成功的菌液，加入1ml蛋白上样缓冲液，100℃裂解10min。
2.4℃，12000rmp离心5min，收集上清。
3.将玻璃板、样品梳冲洗干净，晾干，随后组装玻璃板。
4.按如下体积配制10%分离胶8ml，混匀：
5.向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层双蒸水，大约30min后胶即可聚合。
6.按如下体积配制4%浓缩胶3.0ml，混匀：
7.将上层双蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。
8.装好电泳系统，加入点击缓冲液，上样15ul。
9.调节电压至80V，待溴酚蓝跑如分离胶时，调节电压至120V，电泳至溴酚蓝刚跑出分离胶。
10.卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色2h，加入脱色液，置于摇床中，脱色。
期间每30min更换一次脱色液，至完全脱净。
四、实验结果与分析：
1.SOD基因和PET-32A质粒的双酶切产物电泳图
2.SOD表达产物电泳图
3.转化平板图
4.PCR产物凝胶电泳图
分析：
经过提取质粒、PCR扩增SOD基因、酶切连接SOD基因和PET-32A质粒、制备感受态及转化和SDS-PAGE检测SOD蛋白的表达等过程，理论上来说是可以构建出含有SOD的工程菌，但实验最后菌落没有生长，应该是人为操作失误，可能是在接种时，未等接种环完全冷却就去接种，导致菌最后死亡。
五、结论
工程菌是用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系，是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点，同时也在生产方面得到了大量的应用。
本次实验通过学习最基本的SOD工程菌的构建，从而让我们掌握了基因工程相关的基本操作和数据分析，。
虽然本次实验最终没有得到相应的SOD工程菌，但是实验的过程才是最重要的。
参考文献：
[1]海玲,超,程欲等.超氧化物歧化酶重组酵母的构建及其发酵条件的优化[J].食品与生物技术学报,2017,36（9）:
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10.3969/j.issn..
[2]建荣,晓瑜,步得志等.国产和进口培养基发酵培养重组人SOD工程菌的比较研究[J].中国医药生物技术,2007,2（4）:
260-265.DOI:
10.3969/j.issn.1673-713X.2007.04.005.
[3]母茜,蔡勇,王肇悦等.采用自克隆技术构建高SOD、低双乙酰的啤酒酵母工程菌[J].食品科学,2009,30（19）:
248-251.DOI:
10.3321/j.issn:
1002-6630.2009.19..
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