整理基因工程笔记.docx
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整理基因工程笔记
1.什么叫基因工程（GeneEngineering），试从理论和技术两个方面谈谈GeneEngineering诞生的基础？
基因工程：
在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原来没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。
理论基础：
①1944年，美国生物学家Avery等通过细菌转化研究，证明DNA是基因载体，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题；
②1953年Watson和Crick建立了DNA分子的双螺旋结构模型，1958年至1972年揭示了先后确立了中心法则，破译了64种密码子
技术基础：
①20世纪60年代末70年代初，限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现使DNA分子进行体外的切割和连接成为可能；
②1972年首次构建了一个重组DNA分子，提出了体外重组的DNA分子如何进入宿主细胞，并在其中进行复制和有效表达等问题。
经研究发现，质粒分子是承载外源DNA片段的理想载体，病毒，噬菌体的DNA（或RNA）也可改造成载体
③1973年大肠杆菌转化体系的建立，这实验结果说明基因工程问世，不仅宣告质粒分子可作为基因克隆载体，能携带外源DNA导入宿主细胞，并且证实真核生物基因可转移到原核生物细胞中，并在其中实现功能的表达（基因工程诞生的元年）
克隆：
作为名词使用时，是指某一个体（或细胞、分子等）通过无性繁殖的方式产生的具有相同遗传背景的后代（或子细胞、分子等）组成的集体（或群体）；作为动词使用时，指产生上述集体或群体的过程。
质粒小量提取中,溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用是什么?
溶液Ⅰ是使细胞完全分散溶液Ⅱ是使细胞壁破裂，DNA变性溶液Ⅲ是使质粒选择性复性，而染色体DNA随同SDS和蛋白质一起沉淀下来
限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）：
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）限制片段长度多态性：
指用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的基因组DNA或某一个基因，会得到不同长度的DNA片段。
可用于基因组图谱构建、致病基因检测、基因定位、生物进化和分类的研究等
v限制性图谱（restrictionmap）:
是指一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。
又称物理图谱（physicalmap）
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性
I类内切酶
II类内切酶
III类内切酶
限制和修饰活性
单一多功能的酶
内切酶和甲基化酶分开
共同亚基的双功能酶
内切酶的蛋白结构
3种不同的亚基
单一成分
2种不同的亚基
限制作用所需要的辅助因子
ATP、Mg2+和SAM
Mg2+
ATP、Mg2+和SAM
寄主特异性位点识别序列
EcoB：
TGA（N）8TGCTEcoK：
AAC（N）6GTGC
回文序列
（IIs型除外）
EcoP1:
AGACC
EcoP15:
CAGCAG
切割位点
在距离识别位点至少1000bp处随机切开一条单链。
位于寄主特异性位点或其附近
距寄主特异性位点3‘端24—26bp处
酶催转换
不能
能
能
DNA易位作用
能
不能
不能
甲基化作用的位点
寄主特异性位点
寄主特异性位点
寄主特异性位点
识别未甲基化的序列进行切割
能
能
能
序列特异的切割
不是
是
是
基因工程中的用途
无用
十分有用
常用的DNA聚合酶的特点共同特点：
把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。
主要区别：
持续合成能力和外切酶活性不同。
2T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。
其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。
3.常用DNA聚合酶的特性比较
DNA聚合酶
3’→5’外切酶活性
5’→3’外切酶活性
聚合速率
持续能力
大肠杆菌DNA聚合酶
低
有
中
低
Klenowfragment
低
无
中
低
T4DNA聚合酶
高
无
中
低
T7DNA聚合酶
高
无
快
高
化学修饰T7DNA聚合酶
低
无
快
高
遗传修饰T7DNA聚合酶
无
无
快
高
逆转录酶
无
无
低
中
TaqDNA聚合酶
无
有
快
高
Taq聚合酶：
TaqDN聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。
最适温度高75-80oC功能缺点，具有5’®3’聚合酶活性和5’®3’外切酶活性，但没有3‘®5’外切酶活性。
因此不能修复错误的碱基配对！
TaqDNA聚合酶的激活剂金属离子敏感（尤其是Mg2+
末端脱氧核苷酸转移酶（terminaltransferase）：
特性：
（1）5’®3’DNA聚合酶活性
①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。
②不需要模板！
③底物可以是单链DNA、是3’—OH突出的双链DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。
④随机添加的dNTPs。
如果只有一种dNTP，就添加上同聚物
末端转移酶的用途
（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。
（2）再生酶切位点，便于回收克隆片断。
（3）非放射性标记DNA片断的3’端催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。
（生物素-11-dUTP等）
S1核酸酶：
特性
（1）高度单链特异性
（2）反应条件：
①低水平Zn2+，②pH4.0~4.3、
S1核酸内切酶的功能
（1）催化单链RNA或DNA降解。
（2）切掉双链核酸中的单链区。
发卡或有缺口的部位。
3）降解限制酶切形成的单链突出端。
（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链
.S1核酸酶的用途
（1）定位RNA内切酶位点不能位于内含子序列中！
（2）用mRNA测定基因中的外显子序列不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。
pBR322：
F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。
（1）元件来源
①复制起点oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点
②Ampr基因pSP2124质粒的Ampr基因
③Tetr基因pSC101的Tetr基因。
（2）长度
（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。
（4）克隆位点24个克隆位点。
其中9个会导致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）3个会导致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。
见图P93
（5）pBR322的优点
①双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞®在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞®在Amp或Tet其中之一中死亡。
外源基因®BamHI：
Amp中存活，但在Tet中死亡外源基因®PstI：
Tet中存活，但在Amp中死亡
②分子小，克隆能力大载体越小越好。
>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy
④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。
不能通过接合转移。
（6）pBR322的缺点保留了转移蛋白（mob）的作用位点。
能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！
（7）PBR322的改进
①删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。
pAT153：
从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。
②改造EcoRI位点pBR325：
使EcoRI也成为插入失活型位点。
在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。
cmlr上也带一个EcoRI位点。
pUC系列
UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。
属正选择载体。
pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19
（3）元件来源
①复制起点：
pBR322的ori
②Ampr基因pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。
③lacZ的启动子：
大肠杆菌
④lacZ’基因：
大肠杆菌lacZ的a-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。
（2）长度约2.7kb
（3）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端
Ti质粒:
存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumorinducingplasmid）
天然Ti质粒作载体的缺点
（1）分子量太大（200kb）！
（2）限制性酶切位点太多。
（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。
（4）在大肠杆菌中不能复制。
.Ti质粒的改造
（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。
（2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。
（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。
（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。
应剔除掉。
（5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。
（6）加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加polyA的信号序列。
改造后的Ti质粒载体模式
双元质粒载体和共整合载体
应用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）：
在体外特异性地扩增某个基因。
可用于目的基因的扩增和分离
Primer设计的一般原则：
1位置：
与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA
2引物长度至少16bp,一般引物设计为长15—30bp
3引物的碱基序列3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对
4引物的碱基组成1）尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力2）避免连续相同碱基排列或内部回文序列.
5避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补
6当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55oC。
实际复性温度选择低于Tm值5oC。
适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现
7引物的浓度一般使用终浓度各0.5mmol/L
8简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。
需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。
这样的混合引物称简并引物
9套嵌引物（nestedprimers）设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。
增加扩增产物的特异性。
PCR技术的原理模板DNA变性
引物DNA复性引物DNA延伸
1）DNA模板变性95oC双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。
（2）DNA模板与引物复性40-65oC
引物（primer）:
人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。
（3）DNA链的延伸72oCDNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。
PCR的过程
（1）第一步变性（denature）94-95oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。
（2）第二步复性（anneal）50-60oC下1分钟，引物优先与模板复性。
①引物的浓度高，②引物的链短。
（3）第三步延伸（extend）72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。
（4）第四步变性（denature）94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。
（5）第五步重复（repeat）
温度循环
95oC5min94oC1min
72oC2min
50oC1min
PCR的特点
（1）特异性强①PCR使用专门合成的DNA引物。
②延伸过程是在高温下进行。
这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。
提高了反映的特异性。
（2）敏感性高需要的模板量极低。
理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！
（3）快速整个PCR过程约4小时即可完成。
（4）简便对模板的纯度要求低，不需要纯化，甚至可以直接用细菌。
已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。
（5）可以扩增mRNA先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。
目的基因的制备：
目的基因：
即供体，准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
主要是编码蛋白质（酶）的结构基因。
是能满足人们特殊需要有价值的基因
目的基因的制备方法：
（已知目的基因序列：
直接分离法，，PCR法，化学合成法;未知目的基因序列：
构建基因（DNA）文库分离法，差别杂交法和差示分析法）
直接分离法:
限制性内切酶法随机片断化（1.限制性内切酶局部消化法2.机械切割法）
化学合成法:
磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。
PCR扩增获得目的基因
1.直接从基因组中扩增
（1）提取基因组DNA作模板
（2）根据目的基因序列设计引物
（3）PCR扩增
适合扩增原核生物基因。
真核生物基因组含有内含子！
2.从mRNA中扩增:
RT-PCR
（1）提取基因组totalRNA
（2）反转录合成总cDNA作模板
（3）根据目的基因序列设计引物
（4）PCR扩增
适合扩增真核生物基因。
原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。
.什么是Genelibrary？
它与cDNAlibrary有何区别？
由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体,称之为基因文库。
一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。
由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库
区别：
①基因组文库克隆的是任何，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。
②基因组文库克隆的的全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育的调控因子的影响。
③基因组文库中的编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；而cDNA克隆的是不含内含子的基因
基因组文库：
构建基因文库的载体选用
载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
（1）对载体的要求载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
λ载体系列：
容量为24kp
cosmid载体：
容量为50kb
YAC：
容量为1Mb
BAC:
容量为300kb
YAC载体
基因组文库的大小
一个完整的基因组文库所需的克隆总数应取决于外源基因组的大小以及切割片段的大小
估算方法：
基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长
例：
某生物基因组总长3*106kb，酶切切后片段平均长15kb，
理论上，基因组文库含的克隆数为3*106/15=2*105
一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。
p:
文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）
f:
插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因
组DNA的百分数
N：
所需的重组载体数（克隆数）
基因文库的质量标准
除了尽可能高的完备性（基因文库的完备性是指：
在构建的基因文库中任一基因存在的概率）外，一个理想的基因文库应具备下列条件:
重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力
克隆载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆
克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序
克隆片段易于从载体分子上完整卸下
重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
Λ噬菌体基因组文库的构建：
Λ噬菌体基因组文库的构建步骤：
获得含目的基因的DNA片段
与Λ噬菌体克隆载体进行重组
连接产物在体外进行包装
基因组文库扩增或目的基因的筛选
（6）列出选定的评价方法，并作简单介绍。
（6）评价结论。
一种方法经过分级分离：
以EMBL3载体构建文库为例
另外,环境影响评价三个层次的意义，环境影响评价的资质管理、分类管理，建设项目环境影响评价的内容，规划环境影响评价文件的内容，环境价值的衡量还可能是将来考试的重点。
3）规划实施的经济效益、社会效益与环境效益之间以及当前利益与长远利益之间的关系。
另一种不经分级分离，通过填充基因组DNA，也是一种较优良的方法（P173
（4）跟踪评价的结论。
cDNAlibrary：
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。
代表特定细胞或组织中mRNA的文库
（一）安全预评价依据
cDNA文库的特点
（1）不含内含子序列。
（2）可以在细菌中直接表达。
（3）包含了所有编码蛋白质的基因。
3.不同等级的环境影响评价要求（4）比DNA文库小的多，容易构建。
专项规划工业、农业、畜牧业、林业、能源、水利、交通、城市建设、旅游、自然资源开发有关的专项规划。
环境影响报告书
RACE法（rapidamplificationofcDNAends）
cDNA末端快速扩增技术，是基于PCR技术由已知的部分cDNA顺序来获得完整cDNA5’和
3‘端的方法，也称锚定PCR和单边PCR书P186
（二）建设项目环境影响评价的工作等级是以mRNA为模板，反转录合成cDNA的第一条链，然后用PCR技术扩增出从某个特定位点到3‘端或到5’端之间的未知核苷酸序列
5.定性、定量评价
cDNA文库的大小：
丰度等级
相应丰度等级的mRNA群体占总mRNA的百分数（%）
在相应丰度等级中所含的不同种类mRNA序列的数目（个）
每个细胞所含的相应丰度mRNA序列的拷贝数（个）
高丰度
22
30
3500
中丰度
49
1090
230
低丰度
29
10670
14
cDNA基因文的大小可按以下理论公式估算：
基因文库中cDNA的克隆数目=细胞中总mRNA的数目/细胞中某种mRNA的拷贝数
例：
获得一个能够代表全部低丰度mRNA的cDNA文库的克隆数为=（30*3500+1090*230+10670*14）/14=35750
但实际上所需构建的cDNA文库的实际值远远超过理论值
估算cDNA基因文库大小的经验公式：
N-cDNA基因文库必须的克隆数
P-文库中含目的基因DNA片段的出现概率
f-某种mRNA的丰度与总mRNA数的比值
例：
以上述生物为例，若p-99%
则N=ln（1-0.99）/ln（1-14/500500）=16000
目前用同聚物加尾法或双衔接物法，每微克cDNA都能产生出1*105-6*105个菌落
cDNA文库对真核生物基因的分析是十分有用的
只含有编码蛋白质的基因文库，减少了无功能基因
•cDNA没有内含子，基因可直接在E.Coli中表达
•对鉴别新基因是十分有用的
•具有组织和细胞类型特异性
一般不用原核生物的mRNA构建cDNA文库
•原核生物的mRNA是很不稳定的
•原核生物的基因组文库包括了所有的基因组序列，而且是比较容易构建的
cDNA文库优越性：
1、cDNA克隆以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒，
2、cDNA基因文库的筛选比较简单易行，一个完整的cDNA基因文库所含克隆数，要比一个完全的基因组文库所含的克隆数少得多
3、cDNA克隆出现的假阳性概率比较低（阳性克隆含有目的基因的序列）
4、cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接用于基因工程的操作
5、cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究
局限性：
1·、cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响
2、cDNA基因文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息
3、在cDNA基因文库中，相应于高丰度的mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来容易，反之
mRNA差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）
mRNAdifferentialdisplayRT-PCR：
分离鉴定差别表达基因P223
mRNA差别显示法的优点：
•放大后，灵敏度高，快速，重复性好，所需材料少
•可以同时比较多种细胞类型，展现所有差异
•可用回收并经扩增的cDNA直接作探针
•缺点：
•需大范围的筛选
•出现漏检，高频率假阳性
•间距小，切割难度大
抑制性减法杂交（SSH）P231
抑制性减法杂交（suppressionsubtractivehybridization,SSH）是RDA技术的发展，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交技术结合为一体的技术。
用于分离两组基因表达差异较小的基因
（2）SSH技术的优点：
•特异性强，假阳性率低
•高灵敏性，保证低丰度mRNA检出
•速度快、效率高
不足之处：
•对起始材料要求较多，一般需要微克量级的的Mrna
•得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不是全长Cdna
•所研究材料的差异不能太大，最好是细微差异
因此，SSH法成为目前寻找有差别表达的基因的适用方法
EST（ExpressedSequenceTags）：
基因表达的短cDNA序列
ST（sequencetag）：
寡核苷酸序列标签
基因表达系列分析法（serialanalysisofgeneexpressionSAGE）用来分离在不同发育阶段和生理状态下差别表达的基因，也可以从大量基因的转录产物进行定量分析，从中找到新基因确定基因表达的种类和丰度。
原理：
一是从转录物某一特定位置上分离得到9—10bp的寡核苷酸序列标签（ST）,它含有确定一个独特转录物的足够信息量，可代表此转录物的特异性
二是多个序列标签（ST）能以锚定酶（AE,识别位点为四碱基的限制性核酸内切酶）识别位点序列相隔相互连成双标签序列的多联体，
将该多联体序列克隆到一个载体中，用连续的方法进行多联体的序列分析，再通过计算机处理，确定每一种序列（ST）代表转录产物的种类和出现频率，由此实现对转录物的高效、快速和大量的分析
顺反子（cistron，又叫作用子）：
功能单位，从功能单位的意义上讲，一个顺反子相当于一个基因的DNA或RNA单元，它的产物是一个完整的肽链或者RNA分子，平均大小约为500-1500bp。
（顺反子是一个必须保存完整才具有正常生理功能的遗传物质最小单位，实际上它是基因的同义词，是一个功能水平上的基因,不是一个突变单位和交换单位。
）
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