基因工程复习笔记.docx
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基因工程复习笔记
第一章
一、电泳
电泳（eletrophorosis）:
带电荷的分子在电场中以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动.移动速度称为电泳迁移率。
影响因素：
1电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。
2.电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。
3当电场强度一定,电泳介质相同,电荷相同的分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状（构型）。
4分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关:
分子量越大，移动越慢。
指示剂：
溴酚蓝（Bb）：
常用指示剂。
分子量670，分子筛效应小，近似于自由电泳，呈蓝紫色。
二甲苯青（Xc）：
分子量554.6，呈蓝色，迁移速度比Bb慢。
染料：
溴化乙锭（EB）
1、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：
比琼脂糖凝胶的分辨率高的多；回收DNA样品纯度高，无色透明，韧性好，银染的凝胶干燥后可长期保存；能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA。
2、SDS-PAGE原理：
SDS是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上相同密度负电荷。
SDS与蛋白质结合使蛋白质构象改变，成为形状近似雪茄状的长椭圆棒，SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。
蛋白质-SDS复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒的长度，即蛋白质分子量有关。
二、PCR技术
定义：
聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，以DNA为模板，在引物、dNTPs、Taq酶的作用下，经变性－退货－延伸反复循环，使某个基因在体外特异性地扩增。
PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。
影响因素：
（1）TaqDNA聚合酶（具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配对）。
（2）引物（primer）一般引物设计为长15—30bp；位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA；引物的碱基组成：
尽可能提高G+C含量，避免连续相同碱基排列或内部回文序列，避免形成引物二聚体。
（3）引物的Tm值：
实际复性温度选择低于Tm值5oC。
（4）dNTPs含量适中
（5）Mg2+的浓度
（6）对照实验
三、PCR技术的扩展：
反向PCR：
不对称PCR：
差异显示PCR。
反向PCR原理：
扩增两个引物外侧的未知序列，使引物的外侧序列“转变”成内侧序列。
扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。
不对称PCR：
用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。
mRNA差别显示技术：
对组织特异性或诱导专一性表达基因进行分离的有效方法之一。
将mRNA逆转录和PCR技术相互结合发展起来的一种获得差异表达基因的RNA指纹图谱技术，也称为DDRT-PCR（差别显示RT-PCR）。
四、分子杂交
分子杂交（简称杂交,molecularhybridization）其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的DNA（或RNA）片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子（heteroduplex）。
五、Blotting（印迹）：
凝胶电泳分离的DNA或RNA在杂交之前通过毛细管虹吸作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按照其在凝胶中的位置原地“复印”上去，这一过程叫印迹。
六、常用的分子杂交类型（south与north的区别）
1、Southernblotting：
用DNA（RNA）探针检测DNA。
基本过程：
样品DNA样品→酶切→电泳→碱变性→转膜→固定（80度或紫外线照射）→杂交→洗涤→放射自显影
2、Northernblotting：
用DNA（RNA）探针检测mRNA样品。
提取完整mRNA；进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，破坏RNA的局部双螺旋；其它步骤的原理与Southern印迹相似。
与Southernblotting相比，Northernblotting条件较严格，特别是RNA易降解，前期制备和转膜要防止Rnase的污染。
不需酶切。
3、原位杂交（Situhybridization）：
细胞及染色体上检测特异DNA或RNA序列的一种技术，是一种直接，简便的研究基因定位和表达的方法。
组织原位杂交（tissueinsituhybridization）和菌斑原位杂交
4、蛋白质免疫印迹（Western-blotting）
七、DNA序列分析
1、Sanger双脱氧终止法*
原理：
双脱氧核苷酸，2’、3’都脱氧，3’无-OH，后续核苷酸不能连接，核苷酸链不能延伸。
最后得到一系列小片段，电泳。
（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。
脱氧核糖的连接是以3’→5’磷酸二脂键
（2）复制反应可以在体外进行。
（3）反应体系中包括：
单链模板、dNTPs、合适的引物、一定比例的2´,3´-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）以及若干种适量的无机离子。
（4）2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。
（5）凝胶电泳分离DNA单链片段时，小片段移动快，大片段移动慢。
2、Maxam-Gilbert化学修饰法（化学降解法）
八、基因芯片（GeneChip）
在固体支持物上高度密度排列的DNA片段或寡核苷酸链，又称DNA微阵列或寡核苷酸微阵列。
技术原理：
一种大规模集成的固相杂交，指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面形成阵列，然后与标记的样品杂交。
通过杂交信号检测样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。
基因芯片的应用：
①DNA测序
②基因表达分析
③基因诊断
④基因突变：
⑤药物研究与开发
九、基因突变技术
基因突变（genemutation）:
基因组DNA分子在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，并引起个体表型的改变，而使生物体发生遗传变异。
特异性突变：
寡核苷酸介导的基因突变；盒式突变；PCR点突变；基因合成。
1、寡核苷酸介导的基因突变（p38）
原理使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作为引物，启动单链M13噬菌体DNA进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成DNA子链的一个组成部分，新合成的子链便具有发生突变的碱基序列。
2、盒式诱导突变（cassettemutagene）----片段取代法（p39）
以各种双链质粒DNA为载体，采用人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段置换待改造基因中两个不同限制酶切点之间的序列，在转化的大肠细菌中可形成数量众多的突变体。
这些合成的突变片段就好像不同的盒式录音磁带，可随时插入准备好的质粒中，称为盒式突变。
3、PCR点突变技术
PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。
第二章
一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并在相关位置切割DNA双链的核酸内切酶。
限制性内切酶的类型：
I型、II型、III型限制性内切酶。
II型酶就是通常所说的DNA限制性核酸内切酶。
限制性内切酶的命名原则：
基本名称：
微生物的属名第一个字母大写斜体，种名的前两个字母小写斜体。
取变种或品系的第一个字母。
该微生物中发现的酶的顺序按照罗马字母顺序编写I、II、III等。
（填空题）
同裂酶：
异源同工酶:
来源不同，但具有相同的识别序列的限制性内切酶。
同尾酶（Isocaudamer）来源不同，识别序列不同，但是切割DNA分子所得的DNA片段具有相同的粘性末端。
杂交位点（hybridsite）：
同尾酶切割DNA产生的末端连接后所形成的新的位点。
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。
识别位点在DNA分子中的频率计算：
理论上有n个核苷酸的识别序列的酶出现概率为1/4n。
星号活力（Staractivity）:
在非标准条件下，切割一些与特异识别序列类似的序列，降低酶切反应的特异性，这种现象称为酶的星号活性记作:
EcoRI*。
影响限制性内切酶活性的因素：
1.DNA的纯度：
①纯化DNA②加大酶的用量1ugDNA用10U酶③延长保温时间④扩大反应体积（>20μl）
2.DNA的甲基化程度：
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株
3.温度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。
大多数是37oC，少数要求25-30oC或50-65oC
4.缓冲液：
商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。
二、连接酶
基因克隆实验中常用的DNA连接方法：
（P102）
a、同聚物加尾连接用末端转移酶在载体和双链DNA的3'端各加一段寡聚核苷酸,制成人工粘性末端
b、衔接物连接法原理：
（1）T4DNA连接酶连接linker与克隆DNA片段。
（2）限制性内切酶消化具有衔接物的DNA分子和载体分子，产生出互补粘性末端，进行粘性末端的连接。
c、接头连接法原理：
接头平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。
d、黏末端连接e、平末端连接
连接酶连接作用发生在双链DNA上切口处的磷酸二酯键。
而不能连接两条单链DNA或双链DNA中缺失了核苷酸的缺口。
三、DNA聚合酶
DNA聚合酶I的主要用途：
切口平移（nicktranslation）法标记DNA（制备DNA探针）：
原理:
双链DNA在DNA酶I的作用下行成单链切口，DNA聚合酶I利用5’→3’外切活性从切口的5’端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用切口的3’游离羟基逐个加上相应的核苷酸，使得切口向下移动。
这种切口移动的现象称为切口平移。
如果反应中使用的单核苷酸底物是用同位素标记过的，则产物DNA分子既可作为带放射性的DNA分子杂交探针。
（利用DNA聚合酶I的5’→3’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性。
）
Klenowfragment（Klenow聚合酶）由DNAPolI经枯草杆菌蛋白酶处理产生的。
性质:
具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。
T4DNA聚合酶的性质：
5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性（降解单链更快）。
逆转录酶：
依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。
作用：
具有5’→3’聚合酶活性；具有RNaseH活性，双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链。
Ø用途：
构建cDNA文库
四、DNA修饰酶
1、S1核酸酶特点：
高度单链特异性：
降解单链DNA或RNA，降解DNA速度大于RNA速度；内切或外切；需pH4.0-4.3环境，Zn2+激活
2、碱性磷酸酶：
来自于小牛肠（CIP）或大肠杆菌（BAP），用于去掉DNAorRNA分子的5’端的磷酸基团。
功能：
防止线性化的载体份子自我连接
3、T4多核苷酸激酶（T4-PNKorT4-PNP）催化γ磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。
用途：
DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。
（1）正向反应
（2）交换反应。
4、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）不需要模板的DNA聚合酶，在DNA分子的3’末端
增加一个或多个脱氧核苷酸。
特点：
①需要3’—OH。
②不需要模板！
③底物可以是单链DNA、3’--OH端突出的双链DNA、平末端DNA。
④随机添加的dNTPs，如只有一种dNTP，则添加同聚物。
第三章基因工程载体
1、载体（Vectors）在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
2、基因工程对载体的要求：
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori
（2）有选择性标记Ampr、Tetr、Kanr等。
（3）多克隆位点：
外源基因插入的单一限制酶位点
（4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段
（5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。
（6）具有对受体细胞的可转移性
（7）具有较好的安全性，不能任意转移
3、质粒载体
质粒（plasmid）独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子（CovalentlyClosedCircularDNA,cccDNA）。
质粒（plasmid）的基本特征：
1、自主复制性松弛型复制质粒（relaxedplasmid）和严紧型复制质粒（stringentplasmid）2、可转移性这种转移依赖于质粒上的mob基因产物。
3.质粒的不相容性（incompatibility,又称不亲和性）4、携带特殊的遗传标记
质粒的CCC分子可有不同的构型：
SC构型，OC构型和L构型
质粒的分离纯化P60
（1）.CsCl密度梯度离心法原理：
1.EB能够嵌入DNA的碱基对之间，不同构型DNA分子结合EB的量不同，从而密度不同。
2.完整的超螺旋质粒没有自由末端,解链比较困难，结合EB的量少，密度较大.线形的DNA和开环的质粒DNA由于松弛，可以结合较多的EB分子，则密度小.3.EB浓度达到饱和时，超螺旋质粒DNA分子密度大于线形和开环的质粒DNA，从而分开。
（2）、沸水浴法制备的质粒不纯，收率低，制备规模小，但快速，特别适用小量提取质粒。
（3）.碱裂解法
质粒构建原则：
1、选择合适的出发质粒
2、正确获得构建质粒载体的元件：
酶切、PCR
3、组装合适的选择标记基因
4、选择合适的启动子
5、提高外源DNA的容量
6、需要灭活出发质粒上的某些编码基因
7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单
质粒载体的类型的选择：
（1）高拷贝数的质粒载体：
适合大量增殖克隆基因
（2）低拷贝数的质粒载体：
适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。
减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。
（3）失控的质粒载体：
一些低拷贝基因是温度敏感型
（4）插入失活型质粒载体：
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
外源DNA片段插入会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmr等）失活。
（5）正选择的质粒载体：
质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。
（6）表达型质粒载体：
含有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便外源基因在受体细胞内的高效表达。
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
经典的大肠杆菌质粒载体：
1.pSC101天然质粒，属严紧型低拷贝质粒
2.ColE1质粒载体天然质粒，属松弛型、高拷贝质粒，6.3Kb。
选择标记：
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）
3.pBR322：
pBR322的构建元件是来源于三个亲本质粒：
pMB1:
出发质粒（ColE1）；pSF2124:
Ampr；pSC101:
Tetr（填空题）
pBR322的优点：
①双抗生素抗性选择标记②分子小，克隆能力大③高拷贝数
④安全⑤具有较多的单一酶切位点
4、pUC质粒载体组成：
a.ori来自pBR322质粒的复制起点b.标记基因（ampr）:
pBR322的Ampr基因c.lacz’基因d、克隆位点（MCS）
v菌落蓝白选择的原理：
在基因克隆时，细菌在含有IPTG和x－gal的培养基中进行培养。
IPTG诱导质粒的lacz’基因产生α-肽，同时诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片段。
两种片段形成有功能的半乳糖苷酶，从而使x－gal水解，产生蓝色物质，使非重组菌落呈现蓝色。
当外源基因插到质粒的多克隆位点后，使lacz’失活，不能表达α-肽，破坏了互补作用，细胞内无有活性半乳糖苷酶，使带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。
4、λ噬菌体载体的构建
λcos位点：
线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链（粘性末端，cohesive-endsite），称λcossite，粘性末端粘连接变成环状DNA。
λ-DNA载体的构建（野生型改造成目的载体）：
1、缩短长度，裂解所不必需的，切除便提高装载量。
2、酶切位点的删除或增加3、灭活某些与裂解周期有关的基因，将无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因。
4、加装选择标记，选择标记主要有两类：
免疫功能类标记和颜色反应类标记（蓝白斑筛选）。
5、建立λ-噬菌体的体外包装系统
5、柯斯质粒（cosmid）
定义：
一类人工构建的含有λDNA两端cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。
组成：
抗性标记、质粒复制起始部位、限制型内切酶切位点、cos粘性末端
特点：
1、具有λ噬菌体的特性2、具有质粒载体的持性
3、具有高容量的克隆能力4、便于筛选
5、便于克隆6、不能体内包装，不裂解受体细胞
6、M13DNA载体的特点
1、克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，在DNA定向突变中非常有用.
2、M13重组体筛选简便可以利用菌落的蓝白斑筛选转染的转化子
3、制备的单链DNA、双链RF-DNAM13噬菌体，不经体外包装，可以转染大肠杆菌受体
4、缺点：
包装能力有限，仅包装克隆DNA为1.5kb。
7、噬菌粒载体的特点
Ø像质粒那样在受体细胞中自主复制，克隆双链DNA；
Ø能像M13DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞，制备单链DNA
Ø装载量比M13系列要大很多（10kb）
重组操作简便，筛选容易
8、人工染色体克隆载体（artificialchromosomevector）
定义：
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体
特点：
含有质粒克隆载体所必需的第一受体（大肠杆菌）的质粒复制起始点；含有质粒克隆载体所必需的第一受体（大肠杆菌）的质粒复制起始点；合适的选择标记基因。
酵母人工染色体（YAC）的组成：
酵母4号染色体的复制起点（ARS）、着丝粒序列（CEN）、选择标记基因序列、端粒（TEL）、sup4基因（含有克隆位点）
细菌人工染色体（BAC）
9、重组体的筛选：
（作业）7大类方法，简答，论述or选择
第四章DNA分子克隆
基因克隆的一般步骤：
目的基因片段的获得；体外重组；重组DNA导入受体细胞扩增或表达；重组子的筛选
转化（transformation）：
感受态的大肠杆菌捕获和表达质粒DNA的过程。
转染（transfection）：
感受态大肠杆菌捕获和表达噬菌体DNA的过程。
转导（transduction）：
噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。
重组体导入细胞方法---CaCl2转化法的原理：
感受态细胞（Competentcells）:
受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为最适摄取和容纳外源DNA的生理状态。
CaCl2转化法基本原理;
0℃低渗的CaCl2处理使大肠杆菌进入“感受态”（膜磷脂在低温下形成液晶结构，细胞吸水膨胀），外源DNA与Ca2+形成复合物粘附在表面，而热休克使内外膜温度不平衡，细胞膜出现空隙，这样DNA得以进入细胞，然后进行转化子的筛选。
直接转化法：
a、电击法（electroporation）or电穿孔法基本原理：
将待转化的重组质粒加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加短时高压电场，细胞壁和细胞膜产生缝隙，在细胞膜双脂层上形成瞬时微孔，重组质粒DNA可进入细胞。
b、显微注射法（microinjection）使用极细的毛细管在显微镜下将目的DNA注射到动物细胞或植物原生质体的一种直接方法;直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上.
C、基因枪法（genegun）将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒（0.6-1um）表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞整合到染色体上并表达，实现基因的转化。
第五章目的基因的获取
化学合成法从反应机理上分为：
磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、自动化合成法
操作过程：
液相合成固相合成
亚磷酸三酯法合成过程：
1核苷酸的保护2核苷酸活化3缩合反应4盖帽反应5氧化反应6多次循环和释放
基因组装战略3种方法：
1、小片段粘接法2、补丁延长法3、大片段酶促法
反转录PCR：
RT-PCR，以mRNA逆转录合成的cDNA第一条链为模板的PCR。
反向PCR：
根据已知DNA区的序列设计引物，以包含已知区和未知区的环化DNA分子为模板来扩增未知DNA区序列的PCR技术。
基因库（genepool）：
特定生物体全基因组的集合（天然存在）。
每个种群都具有其独特的基因库。
基因文库（genelibraryorgenebank）通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA保存于适当宿主菌中形成的转化子群。
所有重组DNA组合代表该基因组的全序列。
根据构建方法的不同，基因文库分为：
基因组文库和cDNA文库
在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N=ln（1-P）/ln（1-f）；P=任一基因被克隆（存在于基因文库中）的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小。
基因组文库（genomiclibrary）：
包含某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段，通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体中，这个群体称为这种生物的基因组文库。
基因组文库的构建程序：
1、基因组DNA的制备和切割2、载体和受体的选择3、DNA片段和载体的相连4、重组体转化宿主细胞，构建形成了基因组文库的初库（primarybank）5、初库扩增形成终库
常用载体容量：
λ-DNA-----25kb，考斯质粒------45kb，YAC----400kb，BAC----500kb，质粒---15kb
cDNA文库的构建
定义：
某生物mRNA反转录产生cDNA片段分别与合适的克隆载体相连，通过转化贮存在一种受体菌的群体之中，把这种包含某生物基因组全部基因cDNA的受体菌群体称为该生物cDNA文库。
cDNA文库的特点：
（1）不含内含子序列
（2）可以在细菌中直接表达（3）包含了所有编码蛋白质的基因。
（4）比DNA文库小的多，容易构建。
构建过程：
1、总RNA的提取2、mRNA的纯化3、双链cDNA的合成（cDNA第一链的合成，cDNA第二链的合成）4、双链cDNA的克隆
cDNA第二链的合成最常用的3种方法：
自身引导法，置换合成法（RNase），引导合成法（末端转移酶：
TdT）
转座子标签法（transposontagging）原理：
将转座子插入到欲克隆基因的内部或附近，使得目的基因发生突变，然后利用转座子DNA为探针筛选突变株的基因组文库，钓出含有转座子的DNA片段。
然后再用筛选到的阳性克隆中目的基因片段为探针，筛选野生型生物基因文库分离目的基因。
图位克隆（mapbasedcloning）获得目的基因-
------染色体步移（ChromosomeWalking）利用与目的基因紧密连锁的分子标记DNA片段为探针筛选基因组文库，用已获得的阳性克隆DNA的末端片段为探针继续筛选，直到获得含目的基因两侧序列为止。
染色体步移的基本过程：
1）用遗传作图将目标基因定位在染色体的特定位置;
2）找到与目标基因紧密连锁的分子标记;
3）构建含有大插入片段的基因组文库（ＢＡＣ库或ＹＡＣ）;
4）以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;
5）用获得阳性克隆构
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