精品第十六章dna的复制与修复王镜岩《生物化学》第三版笔记完美打印版Word下载.docx

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线粒体DNA复制时是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代,呈D环形状.这是因为两条链的复制起点不同，另一条链的起点露出才能复制。

三、有关的酶

（一）反应特点：

以四种dNTP为底物

2.需要模板指导

3.需要有引物3’—羟基存在

4.DNA链的生长方向是5’-3’

5.产物DNA的性质与模板相同

（二）大肠杆菌DNA聚合酶

1.DNA聚合酶I:

单链球状蛋白，含锌。

有聚合酶活性和外切酶活性，其中3’-5’外切酶活性起校正作用，5＇-3＇活性起修复和切除引物作用。

DNA聚合酶I主要起损伤修复作用。

每秒可聚合10个碱基。

切除氨基端5＇-3＇外切酶活性后称为Klenowfragment，用于引物标记等。

2。

DNA聚合酶II:

单链,以切口双链DNA为模板，作用不清楚.

3.DNA聚合酶III:

起DNA复制作用,功能与聚合酶I相似。

全酶共10种亚基,含锌。

每秒可聚合1000个碱基.

（三）真核生物DNA聚合酶：

有a、b、g、δ、ε五种，性质与大肠杆菌的酶相似，多无外切酶活性.a相当于聚合酶III，用于引发、滞后链合成;

b主要起修复作用，γ位于线粒体,δ合成前导链，但前50个碱基由a合成。

（四）DNA连接酶:

使双链DNA切口处的5’—磷酸和3’-羟基生成磷酸二酯键。

需供能，细菌用NAD,动物和噬菌体用ATP，形成焦磷酸键的活化形式,再由3’羟基发动亲核攻击，形成磷酸二酯键。

大肠杆菌的连接酶作用于粘末端，T4的还可作用于平末端。

四、半不连续复制

（semi-discontinuocosreplication）

（一）复制叉由5’向3'

方向连续复制，称为前导链；

另一条链复制叉由3’向5’移动，而DNA复制方向不变，形成许多不连续片段,称为冈崎片段，最后连接成完整的DNA,称为滞后链.

（二）首先由引物合成酶由5’向3’方向合成10个核苷酸以内的RNA引物，然后聚合酶III在引物3’-羟基上合成DNA,再由聚合酶I切除引物，填补空白,最后DNA连接酶将冈崎片段连接起来，形成完整DNA。

（三）复制具有高度忠实性，其错配几率约为10—10，从热力学上考虑，碱基发生错配的几率约为10—2，酶对底物的选择作用和校正作用各使错配几率下降10—2,所以体外合成DNA的错配几率为10-6.体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性，修复系统对错配加以纠正，进一步提高了复制的忠实性。

五、解链

复制时必需解链,如靠旋转,则大肠杆菌DNA要达到每分钟6000转。

其实复制时是用拓扑异构酶和解螺旋酶来解链的。

拓扑异构酶I可切断一条链，牵引另一条链通过切口，再连接起来。

每次可消除一个负超螺旋，不需要ATP。

同转录有关.拓扑异构酶II每次引入2个负超螺旋，需要ATP。

引入负超螺旋可消除复制叉前进带来的张力,促进解链。

解螺旋酶通过水解ATP来解开双链,每对碱基需2个ATP.单链结合蛋白（SSB）可与解开的单链结合，防止复性和水解。

六、DNA复制体的结构

七、与DNA复制有关的酶和蛋白质因子由30多种,他们在复制叉上形成离散的复合物，彼此配合，进行高度精确的复制，这种结构称为复制体。

引物合成酶与另外6种蛋白构成引发体。

在DNA复制叉上进行的基本活动包括：

（一）双链的解开

（二）RNA引物的合成

（三）DNA链的延长

（四）切除引物，填补缺口，连接相邻的DNA片断

（五）切除和修复尿嘧啶和错配碱基.

八、真核生物DNA的复制

（一）真核生物有核小体结构,复制速度慢，复制叉每分钟移动约1000－3000碱基对,而细菌约为50千碱基对。

真核生物有许多复制起点，复制子只有细菌的几十分之一，所以复制时间在同一数量级（E。

coli4.2Mb,酵母、果蝇40Kb，植物300，蛙200,鼠150Kb）。

快速生长的原核生物，其复制起点可连续复制,而真核生物采取多复制起点的方法加速复制。

（二）真核生物复制时,核小体打开,组蛋白直接转移到子代前导链上，滞后链用新合成的组蛋白.所以DNA是半保留的，而组蛋白是全保留的.真核生物冈崎片段长度约为200碱基对（E。

coli1－2Kb）,相当于一个核小体的长度。

（三）真核生物的增殖周期可分为DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有丝分裂期（M期）等四个时相，间期为分裂期作准备,进行生物大分子和细胞器的倍增。

前期合成DNA复制必须的蛋白质和RNA，复制期先复制常染色质DNA，再复制异染色质。

然后进入有丝分裂的准备期.前期变动较大。

分裂期后，有些细胞进入前期,开始下一个周期;

有些失去分裂能力；

有些脱离分裂周期，或进行分化，或进入静止期（G0期）。

成年动物大部分细胞处于静止期.

九、DNA复制的调控

复制有复杂的调控机制。

有正调节，也有负调节.有顺式作用,即以某DNA序列为调控因子;

也有反式作用,即以基因的产物，如蛋白质或RNA为调控因子。

原核生物的复制起点与细胞膜相结合，复制与细胞膜有密切关系。

真核生物复制从核膜开始,与质膜也密切相关。

dnaA浓度决定起始频率。

第二节DNA的修复

一、DNA的损伤

（一）环境作用

物理因素

²

紫外线:

形成嘧啶二聚体,使转录终止，复制受阻。

电离辐射：

αβγX-射线等,主要通过电离作用造成损伤。

可造成多种损伤，如DNA断裂、碱基脱落、杂环破裂、氧化等。

化学因素

烷化剂：

有活泼烷基，可转移到碱基或磷酸上,如硫酸二甲酯、芥子气等。

鸟嘌呤的O6和N7最易烷化,导致错配（GT）或脱落。

磷酸三酯不稳定,易断裂.双功能试剂可造成交联。

碱基或核苷类似物：

FU、BrdU、6—巯基嘌呤等。

可竞争抑制核苷酸合成或掺入核酸导致错配.

亚硝酸盐及亚硝胺：

前者造成脱氨，后者氧化后生成烷化剂和自由基。

代谢活化化合物:

如苯并笓、黄曲霉毒素等。

经混合功能氧化酶催化形成环氧化物，与核酸结合，造成突变。

以上物理及化学因素统称诱变剂.

3.生物因素

DNA、RNA肿瘤病毒可插入基因组，引起突变。

（二）自发性损伤

1.复制时的碱基错配

互变异构:

A＝NH时可形成A=C，G－OH时可形成GT三键配对

3。

碱基脱氨：

C—U，A—I，G-X

4。

碱基丢失：

大肠杆菌每代丢失一个嘌呤，哺乳动物可达一万个。

嘧啶丢失几率只有嘌呤的1／20。

二、光复活

光复活酶可被可见光（300－600纳米，400纳米最有效）激活，分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。

此酶广泛存在,但人体只存在于淋巴细胞和皮肤成纤维细胞,且是次要修复方式。

三、切除修复

（一）细胞内有多种特异的核酸内切酶,可识别DNA的损伤部位,在其附近将DNA单链切开，再由外切酶将损伤链切除，由聚合酶以完整链为模板进行修复合成，最后有连接酶封口.

（二）碱基脱氨形成的尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤可被专一的N—糖苷酶切除，然后用AP（apurinic/apyrimidinic，缺嘌呤或缺嘧啶）核酸内切酶打开磷酸二酯键，进行切除修复。

DNA合成时消耗NADPH合成胸腺嘧啶，可与胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶相区别，提高复制的忠实性.RNA是不修复的,所以采用“廉价"

的尿嘧啶.

（三）切除修复不需光照，也称暗修复.大肠杆菌中有UvrABC系统，可切除修复嘧啶二聚体。

人体缺乏相应系统则发生“着色性干皮病”,皮肤干燥，有色素沉着，易患皮肤癌。

可加入T4内切酶治疗。

四、重组修复

以上修复发生在复制前,称为复制前修复。

复制时未修复的损伤部分会留下缺口，通过遗传重组进行修复:

从完整的母链上将相应序列移至缺口处，用再合成的序列填补母链的空缺。

此过程也叫复制后修复。

重组修复中原损伤没有除去，但若干代后可逐渐稀释，消除其影响.所需要的酶包括与重组及修复合成有关的酶，如重组蛋白A、B、C及DNA聚合酶、连接酶等。

五、诱导修复

DNA严重损伤能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应，包括修复效应、诱变效应、分裂抑制及溶原菌释放噬菌体等。

细胞癌变也可能与应急反应有关。

应急反应诱导切除和重组修复酶系，还诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，加快修复，避免死亡，但提高了变异率。

单链DNA诱导重组蛋白A，可水解LexA蛋白，使一系列基因得到表达,如RecA、UvrABC、SOS修复所需的酶等，产生应急反应。

应急反应可作为致癌物的简易检测方法。

采用缺乏修复系统、膜透性高的E。

coli突变株，并添加鼠肝匀浆液.

六、Ada蛋白

也叫适应性蛋白，可识别甲基化的DNA,将甲基转移到自身的半胱氨酸上，不可逆，故称“自杀修复”。

可修复磷酸及鸟苷上的甲基。

七、真核细胞修复特点

多聚腺苷酸－核糖化:

由多聚（ADP-核糖）聚合酶催化，用NAD合成并转移到相应蛋白上.可增加一些修复酶的活性，如连接酶。

转录－修复偶联:

转录时，若模板链损伤,则转录暂停，转录因子TFIIS使聚合酶退回，CSA/CSB及TFIIE召集修复。

若DNA双链损伤,则模板链优先修复。

第三节逆转录生成DNA

一、逆转录酶

含两个亚基,a亚基是b亚基水解产生的。

含锌。

要求有模板和不少于四个核苷酸的引物,由5’向3’合成DNA。

真核生物的信使RNA加入寡聚dT后可作为模板。

此酶有多种功能，可先合成DNA－RNA杂合分子,再水解RNA（RNA酶H活力）,然后复制其互补链，形成双链DNA。

二、逆转录过程

以前任宿主的tRNA为引物，为复制末端,需要借助末端重复结构进行“跳跃"

。

三、意义

（一）逆转录与细胞恶性转化有关，为肿瘤的研究和防治提供了重要线索。

艾滋病、乙肝等也有逆转录过程。

（二）逆转录病毒经过改造，可作为信息载体，用于肿瘤和遗传疾病的基因治疗。

真核生物的基因组中多含逆假基因，可能是信使RNA经逆转录而整合到基因组中的。

所以真核生物正常细胞也存在逆转录过程

本章名词解释

半保留复制（semiconservativereplication）：

DNA复制的一种方式。

每条链都可用作合成互补链的模板，合成出两分子的双链DNA，每个分子都是由一条亲代链和一条新合成的链组成。

复制叉（replicationfork）：

Y字型结构，在复制叉处作为模板的双链DNA解旋,同是合成新的DNA链。

DNA聚合酶（DNApolymerase）：

以DNA为模板,催化核苷酸残基加到已存在的聚核苷酸3ˊ

末端反应的酶。

某些DNA聚全酶具有外切核酸酶的活性，可用来校正新合成的核苷酸的序列。

Klenow片段（Klenowfragment）:

E。

coliDNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。

该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。

前导链（leadingstrand）:

与复制叉移动的方向一致，通过连续的5ˊ—3ˊ聚合合成的新的DNA链.

滞后链（laggingstrand）:

与复制叉移动的方向相反，通过不连续的5ˊ—3ˊ聚合合成的新的DNA链。

冈崎片段（Okazakifragment）:

相对比较短的DNA链（大约1000核苷酸残基），是在DNA的滞后链的不连续合成期间生成的片段，这是ReijiOkazaki在DNA合成实验中添加放射性的脱氧核苷酸前体观察到的.

引发体（primosome）:

一种多蛋白复合体，E。

coli中的引发体包括催化DNA滞后链不连续DNA合成所必需的，短的RNA引物合成的引发酶,解旋酶。

复制体（replisome）:

一种多蛋白复合体，包含DNA聚合酶,引发酶，解旋酶，单链结合蛋白和其它辅助因子。

复制体位于每个复制叉处进行细菌染色体DNA复制的聚合反应。

单链结合蛋白（SSB）：

一种与单链DNA结合紧密的蛋白，它的结构可以防止复制叉处单链DNA本身重新折叠回双链区.

滚环复制（rolling-circlereplication）：

复制环状DNA的一种模式，在该模式中，DNA聚合酶结合在一个缺口链的3ˊ端绕环合成与模板链互补的DNA，每一轮都是新合成的DNA取代前一轮合成的DNA。

逆转录酶（reversetranscriptase）：

一种催化以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶，具有RNA指导的DNA合成，水解RNA和DNA指导的DNA合成的酶活性。

互补NDA（cDNA）：

通过逆转录酶由mRNA模板合成的双链DNA。

聚合酶链式反应（PCR）：

扩增样品中的DNA量和富集众多DNA分子中的一个特定的DNA序列的一种技术.在该反应中，使用与目的DNA序列互补的寡核苷酸作为引物，进行多轮的DNA合成。

其中包括DNA变性，引物退火和在TapDNA聚合酶催化下的DNA合成。

直接修复（directrepair）:

是通过一种可连续扫描DNA,识别出损伤部位的蛋白质，将损伤部位直接修复的方法。

该修复方法不用切断DNA或切除碱基。

切除修复（excisionrepair）：

通过切除-修复内切酶使DNA损伤消除的修复方法。

一般是切除损伤区,然后在DNA聚合酶的作用下，以露出的单链为模板合成新的互补链,最后用连接酶将缺口连接起来。

错配修复（mismatchrepair）:

在含有错配碱基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢复的修复方式。

这种修复方式的过程是：

识别出下正确地链，切除掉不正确链的部分,然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用，合成正确配对的双链DNA。

遗传学中心法则（geneticcentraldogma）：

描述从一个基因到相应蛋白质的信息流的途径.遗传信息贮存在DNA中，DNA被复制传给子代细胞，信息被拷贝或由DNA转录成RNA，然后RNA翻译成多肽。

不过,由于逆转录酶的反应,也可以以RNA为模板合成DNA.

转录（transcription）：

在由RNA聚合酶和辅助因子组成的转录复合物的催化下,从双链DNA分子中拷贝生物信息生成一条RNA链的过程。

模板链（templatestrand）：

可作为模板转录为RNA的那条链该链与转录的RNA碱基互补（A—U，G-C）。

在转录过程中,RNA聚合酶与模板链结合，并沿着模板链的3′→5′方向移动,按照5′→3′方向催化RNA的合成。

编码链（codingstrand）：

双链DNA中，不能进行转录的那一条DNA链,该链的核苷酸序列与转录生成的RNA的序列一致（在RNA中是以U取代了DNA中的T）。

核心酶（coreenzyme）:

大肠杆菌的RNA聚合酶全酶由5个亚基组成（α2β，βδ），没有δ基的酶叫核心酶。

核心酶只能使已开始合成的RNA链延长，但不具有起始合成RNA的能力，必须加入δ基才表现出全部聚合酶的活性。

RNA聚合酶（RNApolymerase）:

以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷—5′—三磷酸合成RNA的酶。

启动子（promoter）：

在DNA分子中,RNA聚合酶能够结合并导致转录起始的序列。

内含子

（intron）：

在转录后的加工中，从最初的转录产物除去的内部的核苷酸序列。

术语内含子也指编码相应RNA外显子的DNA中的区域。

外显子（exon）：

既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列.术语外显子也指编码相应RNA内含子的DNA中的区域。

终止因子（terminationfactor）:

协助RNA聚合酶识别终止信号的的辅助因子（蛋白质）。

核酶（ribozyme）:

具有像酶那样催化功能的RNA分子。

剪接体（spliceosome）：

大的蛋白质-RNA复合体，它催化内含子从mRNA前体中除去的反应。

RNA加工过程（RNAprocessing）:

将一个RNA原初转录产物转换成成熟RNA分子的反应过程。

加工包括从原初产物中删除一些核苷酸,添加一些基因没有编码的核苷酸和对那些碱基进行共介修饰。

RNA剪接（RNAsplicing）：

从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子,并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。

翻译（translation）：

在蛋白质合成期间，将存在于mRNA上代表一个多肽的核苷酸残基序列转换为多肽链氨基酸残基序列的过程。

遗传密码（geneticcode）：

核酸中的核苷酸残基序列与蛋白质中的氨基酸残基序列之间的对应关系.；

连续的3个核苷酸残基序列为一个密码子，特指一个氨基酸。

标准的遗传密码是由64个密码子组成的，几乎为所有生物通用。

起始密码子（iniationcodon）：

指定蛋白质合成起始位点的密码子.最常见的起始密码子是蛋氨酸密码：

AUG

终止密码子（terminationcodon）：

任何tRNA分子都不能正常识别的，但可被特殊的蛋白结合并引起新合成的肽链从翻译机器上释放的密码子.存在三个终止密码子：

UAG,UAA和UGA。

密码子（condon）:

mRNA（或DNA）上的三联体核苷酸残基序列，该序列编码着一个指定的氨基酸,tRNA的反密码子与mRNA的密码子互补。

反密码子（anticodon）：

tRNA分子的反密码子环上的三联体核苷酸残基序列。

在翻译期间,反密码子与mRNA中的互补密码子结合。

简并密码子（degeneratecodon）：

也称为同义密码子。

是指编码相同的氨基酸的几个不同的密码子。

氨基酸臂（aminoarm）：

也称为接纳茎。

tRNA分子中靠近3ˊ端的核苷酸序列和5ˊ端的序列碱基配对,形成的可接收氨基酸的臂（茎）。

TψC臂（TψCarm）：

tRNA中含有胸腺嘧啶核苷酸—假尿嘧啶核苷酸-胞嘧啶核苷酸残基序列的茎-环结构。

氨酰-tRNA（aminoacyl-tRNA）：

在氨基酸臂的3ˊ端的腺苷酸残基共价连接了氨基酸的tRNA分子。

同工tRNA（isoacceptortRNA）：

结合相同氨基酸的不同的tRNA分子.

摆动（wobble）：

处于密码子3ˊ端的碱基与之互补的反密码子5ˊ端的碱基（也称为摆动位置）,例如I可以与密码子上3ˊ端的U，C和A配对.由于存在摆动现象，所以使得一个tRNA反密码子可以和一个以上的mRAN密码子结合。

氨酰-tRNA合成酶（aminoacyl-tRNAsynthetase）：

催化特定氨基酸激活并共介结合在相应的tRNA分子3ˊ端的酶。

翻译起始复合物（translationinitiationcomplex）：

由核糖体亚基，一个mRNA模板，一个起始的tRNA分子和起始因子组成并组装在蛋白质合成起始点的复合物。

读码框（readingframe）：

代表一个氨基酸序列的mRNA分子的非重叠密码序列。

一个mRNA读码框是由转录起始位置（通常是AUG密码）确定的.

SD序列（Shine-Dalgarnosequence）：

mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。

肽酰转移酶（peptidytranseferace）：

蛋白质合成期间负责转移肽酰基和催化肽键形成的酶。

嘌吟毒素（puromycin）：

通过整合到生长着的肽链，引起肽链合成提前终止来抵制多肽名链合成的一种抗生素。

开放读码框（openreadingframe）：

DNA或RNA序列中一段不含终止密码的连续的非重叠核苷酸密码。

信号肽（signalpeptide）：

常指新合成多肽链中用于指导蛋白质夸膜转移（定位）的N—末端氨基酸序列（有时不一定在N端）。