生物技术大实验实验指导书.docx

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生物技术大实验实验指导书

《生物技术大实验》实验指导书

生物技术教学部

常平安舒坤贤谢永芳编

重庆邮电学院生物信息学院

2005年3月1日

前言

《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。

该实验课程偏重于分子生物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。

分子生物学实验技术突飞猛进，日新月异。

分子生物学技术的广泛应用，在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用，而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。

分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。

21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。

学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。

而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。

虽然目前的分子生物学实验教材版本众多，但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。

为了加强本学科的教材建设，促进本学科实验课的开设，我们参考了国内外最新的有关分子生物学实验技术的专著，根据我校学生的特点及我们自己现有的基础和条件，特选择了部分实验内容，并结合我们的经验与体会，汇编成了生物技术大实验实验指导书，以供参考。

在使用过程中，可根据不同的层次适当增减。

同时，对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、RNAi技术和蛋白质组研究等，限于我们目前的条件，只能作些演示或作为动态给以介绍，条件一经成熟，即行开设。

由于分子生物学技术和生物技术的快速发展，加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物技术大试验课程，许多工作还处于不断探索的过程中，难免有不妥和疏漏之处，恳切期望读者提出宝贵意见，以利不断修正完善。

编者

2005年3月

实验一质粒的提取和纯化…………………………………………….3

实验二质粒DNA的电泳和纯度检测…………….……………………..6

实验三PCR产物的TA克隆……………………………………………...9

实验四感受态大肠杆菌细胞的制备…………………………………...12

实验五重组DNA转化大肠杆菌…………………………………........12

实验六PCR扩增基因特异片段………………………………………..15

实验七DNA片段的回收及纯化………………………………………..19

实验八PCR法快速鉴定重组载体……………………………………...22

实验九限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒…………………………...24

实验十外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测……………………….28

实验十一RNA的提取及其纯度检测……………………………………32

实验十二逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段…………………..35

实验十三DNA探针制备……………………………………………..…38

实验十四Southern印迹杂交……………………………………………41

实验十五Northern印迹杂交……………………………………………44

实验十六荧光原位杂交（FISH）技术…………………………………47

实验十七外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测…………………...50

实验十八生物芯片技术………………………………………………...53

实验十九RNAi技术……………………………………………………56

实验二十蛋白质组技术………………………………………………...58

附录基因工程基本技术路线…………………………………………….60

实验一质粒的提取和纯化

实验目的：

了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小量制备方法。

实验原理：

质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。

最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法；利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；利用羟基磷灰石在特定的条件下（8mol／L尿素，0.24mol／L磷酸缓冲液pH＝6.8）只吸附双链DNA的羟基磷灰石法（在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链）等。

本实验选做的是碱法。

1.裂解细胞裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。

对于不同的菌要选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法（简称碱法）等。

三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。

常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有TritonX-100等。

2．分离即将质粒DNA和染色体DNA分离。

碱法的分离原理如下：

大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。

当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。

再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。

3．纯化细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。

纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。

RNA可用牛胰RnaseA分解除去。

蛋白质可通过酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇，使蛋白质变性剂而除去，同时，氯仿有强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。

氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。

氯仿／异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。

正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿（（1:

1））一氯仿（或氯仿／异戊醇24:

1），处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿（氯仿／异戊醇）的处理步骤省略掉。

抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。

用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。

实验内容：

试剂

1.LB培养液（1L）

细菌培养用蛋白胨10g

细菌培养用酵母粉5g

NaCl10g

用10mol／LNaOH调至pH7.0，高压蒸气灭菌,4℃贮存.

2．溶液Ⅰ，可成批配置，灭菌后4℃贮存。

葡萄糖

50mmol／L

Tris-C1（pH8.0）

25mmol／L

EDTA

10mmol／L

3．溶液Ⅱ（新鲜配制）

NaOH0.2mol／L

SDS1％

4．溶液Ⅲ

5mol／LKAc

60ml

冰醋酸

11.5ml

水

28.5ml

配制好的溶液Ⅲ含3mol／L钾盐，5mol／L醋酸（pH4.8）

卡那霉素（Kana）:

50mg/ml,过滤除菌.

5．重蒸酚市售苯酚蒸馏纯化（收集179～181℃之间的酚）后，用TE饱和，使水相的pH在7.5以上，4℃保存。

6．氯仿异戊醇（24:

1）

7．无水乙醇

8．RNaseA（10mg／ml）

9．3mol／LNaAc（pH5.2）

10．TE10mmol／LTris-C1（pH8.0）1mmoI／LEDTA

材料

含有质粒（pNTE-EGFP,pEGFPN3）的大肠杆菌DH5a.

操作步骤

1．挑取琼脂培养板上的含有pNTE-EGFP,pEGFPN3质粒的单菌落，接种至5mlLB培养液（含Kana50μg／m1），37℃振荡培养过夜。

2．取出1.5ml培养液至1.5ml离心管中，12000r／min离心2min，弃上清。

3．将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液工中，强烈振荡混匀。

4．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖，轻轻颠倒混匀5次，冰浴5min。

5．加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和振荡10s，冰浴5min。

6．12000r／min室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5m1Eppendorf管中。

7．加入等体积酚／氯仿（1:

1），振荡混匀，12000r／min离心2min，上清转移至另一个Eppendorf管中。

【注意】酚具有腐蚀性，操作时小心。

8．加人等体积氯仿，振荡混匀，12000r／min离心2min，上清转移至另一个Eppendorf管中。

10．加入2倍体积预冷无水乙醇-20℃沉淀10min。

11．12000r／min离心10min，去上清，沉淀用70％乙醇洗涤一次，空气中晾干。

12．加入20μlTE溶解质粒DNA，加入RNaseA，终浓度20μg／m137℃水浴0.5h。

13经0.7％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后观察抽提结果。

【注意】EB为致癌物，操作时一定要戴乳胶或一次性手套。

14．将该管质粒保存于-20℃备用。

注意事项

1．该实验成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净，获得一定得率的质粒DNA。

去掉染色体DNA最为重要，也较困难，因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂解成小片段，从而能与质粒DNA相分离。

这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶液Ⅰ加入时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，加入SDS后，则要注意不能过分用力振荡，温和混匀,但又必须让它反应充分。

加入溶液II混匀之后,一定在冰上放置,不要摇动,对于溶液溶液III,同样处理!

2.加入溶液I之前,注意将离心管倒扣过来,将培养基完全流出.

2．加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖倒翻摇动4～5次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以获得更多的DNA。

3．乙醇沉淀DNA离心后，要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发（可将离心管倒置于滤纸上以尽量让管内液体流出）。

否则，用TE缓冲液溶解DNA时，既困难又不完全。

4．为了得到纯净的DNA样品和清晰的电泳条带，加入1μlRNA酶，将管置50℃水浴箱内30min，消化RNA。

6．抽提产物经电泳分离、EB染色后，在紫外线灯下可观察到三个条带，自前往后分别为：

超螺旋、线性及开环质粒DNA。

【思考题】

碱法提取质粒的原理是什么？

【课外阅读】

高纯度质粒DNA的提取,参阅Qiagen公司说明书,网站:

实验二质粒DNA的电泳和纯度检测

实验目的：

掌握DNA琼脂糖电泳技术，了解紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理。

实验原理：

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。

其中，凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选标准方法。

与蛋白质分子类似，核酸分子也是两性解离分子。

在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。

不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。

所以采用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。

值得注意的是，等长度的单链DNA和双链DNA在中性或碱性凝胶中的迁移率大致相等。

1．影响泳动的四大因素

（1）影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质：

包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构。

一般来说颗粒带电荷的密度愈大，泳动速率愈快；颗粒物理形状愈大，与支持物介质摩擦力越大，泳动速度越小。

即泳动率与颗粒的分子大小，介质粘度成反比；与颗粒所带电荷成正比。

在检测未知DNA分子量时，DNA分子的空间构型不同，即使相同的分子量其迁移率也不同。

如质粒DNA存在闭环（Ⅰ型，CC），单链开环（Ⅱ型，OC）和线性（Ⅲ型，L）。

三者之间的迁移速率，一般为Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型，但是有时也会出现相反的情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及溴乙锭染料含量有关。

当胶浓度较高或电场强度较大时，Ⅰ型DNA与Ⅲ型DNA互换位置，而Ⅱ型DNA总是迁移最慢。

（2）支持物介质：

DNA的凝胶电泳常使用两种支持材料：

琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。

通过这两种介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，分离不同分子量的核酸片段。

琼脂糖凝胶的孔径大，可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子；聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片段（5～500bp）DNA，效果最好。

因此，选用不同的凝胶种类和浓度可以分辨大小不同的DNA片段。

（3）电场强度：

电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。

电场强度愈大，带电颗粒的泳动速率愈快，但凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。

在低电压时，线性DNA分子的泳动率与电压成正比。

一般凝胶电泳的电场强度不超过5V／cm；对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5～1.0V／cm电泳过夜，以取得较好的分辨率和整齐的带型。

电压1000～2000V，电场强度20～600V／cm的电泳为高压电泳，必须用聚丙烯酰胺做介质。

（4）缓冲液离子强度：

缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、pH值、离子浓度直接影响电泳的效率。

Tris.C1缓冲体系中，由于Cl—的泳动速度比样品分子快得多，易引起带型不均一现象，所以常利用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系。

缓冲液的pH值直接影响DNA解离程度和电荷密度，缓冲液pH值与DNA样品的等电点相距越远，样品所携带电荷量越多，泳动速度越快。

DNA电泳缓冲液，常采用偏碱性或中性条件，使核酸分子带负电荷，向正极泳动。

缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般在0.02～0.2之间。

2．指示剂

电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。

核酸电泳常用的指示剂有是溴酚蓝，溴酚蓝呈蓝紫色，分子量为670Da，在不同浓度凝胶中，迁移速度基本相同，它的分子筛效应小，近似于自由电泳，故被普遍用作指示剂。

在0.6％，1％，2％的琼脂糖凝胶中，溴酚蓝的迁移率分别与1kb，0.6kb和0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。

指示剂一般加在电泳上样缓冲液中，为了使样品能沉人胶孔，还要加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。

3．染色剂

核酸需经过染色才能显示出带型，最常用的是溴乙锭染色法。

溴乙锭（ethidiumbromide，EB）是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。

EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍，因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。

通常，可以在凝胶中加入终浓度为0.5μg／m1的EB，这样在电泳过程中可以随时观察核酸的迁移情况，这种方法适用于一般性的核酸监测。

也可以在电泳结束后用0.5μg／m1的EB溶液染色10-15min后进行紫外观察，由于EB在可见光下易分解，故应存棕色瓶中于4℃条件下保存。

[注意]：

EB有潜在的致癌危险，操作时必须戴乳胶手套或一次性手套。

实验内容：

试剂

（1）质粒pNTE-EGFP。

（2）琼脂糖。

（3）10mg／ml溴乙锭溶液。

（4）DNA分子量参照物（marker）。

（5）50×TAE电泳缓冲液。

（6）10×溴酚蓝上样缓冲液。

2．器材

（1）恒温水浴

（2）电泳槽

（3）电泳仪

（4）微波炉

（5）紫外线检测仪

（6）移液器；100-1000μl，10-100μl,0.5-10μl

操作步骤

电泳

（1）称取1.0g琼脂糖，加入100ml1×TAE电泳缓冲液中。

（2）加热或沸水浴后使琼脂糖溶解。

（3）凝胶冷至60℃左右，加入溴乙锭至终浓度为0.5μg／m1。

（4）将琼脂糖溶液倒人模具，凝胶厚度一般为0.3～0.5cm，检查有无气泡。

室温下15～30min后，琼脂糖溶液完全凝固。

（5）连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色。

（6）取掉模具两端的胶布，放入电泳槽，加样孔在负极端。

（7）加入1×TAE电泳缓冲液至电泳槽中，液面高于胶面1mm，小心取出梳子。

（8）取5μl实验一制备的质粒DNA，在DNA样品中加入1／10的上样缓冲液并混匀。

（9）用移液器将DNA样品加入梳孔中。

（10）接通电源，DNA样品往正极移动。

电压选择为3～5V／cm。

注意：

长度以两个电极之间的距离计算。

（11）根据指示剂迁移的位置，判断是否终止电泳；切断电源后，含EB的凝胶可以直接于紫外线灯下观察结果或拍照记录。

浓度和纯度分析：

1取10μlDNA用TE缓冲液稀释至1ml，混匀。

以无DNA的TE为空白，测定样品在260nm和280nm波长下的光密度吸收值，每个样品重复3次，取3次结果的平均值作为最终结果。

2换算出OD260/OD280的比值，较纯的DNA，该值在1.6-1.8之间。

3根据双链DNA1OD260nm=50g，计算出样品DNA的浓度，计算公式为所测的OD260nm×50/10（g/l）

附录一、核酸换算数据

dsDNA

10kb=6.60106Dalton

1OD260nm=50g

ssDNA

10kb=3.30106Dalton

1OD260nm=40g

RNA

10kb=3.45106Dalton

1OD260nm=40g

附录二、琼脂糖凝胶浓度与线性DNA的最适分辨范围

琼脂糖凝胶浓度

线性DNA的最适分辨范围（bp）

0.5%

0.7%

1.0%

1.2%

1.5%

2.0%

1，000-30,000

800-12,000

500-1,000

400-7,000

200-3,000

50-2,000

实验三PCR产物的TA克隆

实验目的：

掌握通过TA连接克隆PCR产物的原理和方法。

实验原理：

通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。

由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：

（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。

（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP），72℃10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。

下图是大连宝生物公司的T载体及其说明书。

pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物（TACloning）的专用载体。

它是TaKaRa独自研究开发，由pUC18载体改建而成的。

在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个“A”的特性,所以使用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

本制品是以最为常用的pUC18载体为基础研制而成，所以它具有同pUC18载体完全相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液LigationSolutionI可以在极短的时间内（30分钟-1小时）完成连接反应，大大地方便了实验操作。

另外，本制品中还含有ControlInsert（500bp），可用于Control反应。

用途：

克隆PCR产物。

对克隆后的PCR产物用M13Primers进行DNA测序。

α互补和蓝白筛选的原理：

许多载体（包括pMD18-T）都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸（α肽链）的片断基因。

宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。

当二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。

由α互补形成的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用X-gal显色测定出来，它能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和蓝色底物。

当外源DNA片断插入到多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽链，而导致不能形成功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色的，而没有插入外源片断的则是蓝色的。

实验内容：

试剂

pMD18-TVector试剂盒，或自己PCR扩增回收纯化的片段，T4DNA链接酶。

IPTG，X-gal，LB培养基等。

200mg/ml的IPTG过滤除菌

20mg/ml的X—gal溶于二甲基甲酰胺，避光保存。

操作步骤

1.在微型离心管中制备下述连接反应液，全量为10l。

*取0.5l进行实验也可得到满意的结果。

实际操作时，可按实验需要使用适量的T载体。

2.16℃反应30分钟（过夜反应也不影响连接效率）。

3.全量（10l）转化至JM109感受态细胞（100l）中。

4.在含有40l20mg/ml的X-Gal、4l200mg/ml的IPTG、50-100g/mlAmp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。

计数白色、蓝色菌落。

5.挑选白色菌落，使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小。

注意事项：

1.LigationSolutionI请于冰中融解。

2.在进行克隆时，VectorDNA和InsertDNA的摩尔比一般为：

2~10。

在本制品中，pMD18-TVector1l（50ng）的摩尔数约为0.03pmol，ControlInsertDNA1l（50ng）的摩尔数约为0.15pmol。

3.克隆时使用的InsertDNA片段（PCR产物）尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。

4.按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20l。

当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。

5.连接反应请在16℃下进行，温度升高（>26℃）较难形成环状DNA。

6.连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。

7.感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞，如：

JM109，DH5a等。