精编农业畜牧行业生物化学实验教学大纲四川农业大学课程Word下载.docx
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3、微生物材料的处理
二、分光光度法
1、分光光度法
2、分光光度法在生物化学中的应用
3、常用分光光度计：
721型、752型紫外分光光度计的使用
三、层析法
1、层析法的原理及应用
2、常用的几种层析方法及原理：
（1）纸层析；
（2）薄面层析；
（3）凝胶层析；
（4）亲和层析
四、电泳法
1、电泳的基本原理及应用
2、常见的几种电泳方法
（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳
（2）琼脂糖凝胶电泳
（3）醋酸纤维薄膜电泳
（4）毛细管电泳
3、影响电泳的主要因素
五、离心分离技术
1、离心分离技术的原理和应用
2、常用离心机的使用
六、生物大分子的分离纯化的一般原理和步骤
第二部分生物化学基础实验
实验一蛋白质的两性解离及等电点的测定（2学时）
目的和要求：
认识蛋白质的两性解离性质，了解等电点的意义及其与蛋白质分子沉降的关系，学习蛋白质等电点测定方法。
实验内容：
氨基酸通过肽键连接成多肽链，除N-端和C-端外，还有一定数量的可解离的侧链基团，因此蛋白质也是两性电解质。
蛋白质分子上可解离基因的解离程度与溶液的pH值有关。
在一定pH条件下，就会解离而带电，带电的性质和多少决定于蛋白质分子的结构及溶液的pH。
在某一pH条件下，蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零。
此时蛋白质质点在电场中不移动，溶液的这一pH值称为该蛋白质的等电点（pI）。
如果溶液的pH<
pI，则蛋白质分子结合一部分H+，而带正电荷在电场中就向负极移动。
反之，溶液的pH>
pI，则蛋白质分子会解离一部分H+而带负电荷，此时蛋白质分子在电场中就会向正极移动。
COOHCOO-COO-
+H+-H+
PrPrPr
-H++H+
NH3+NH3+NH2
阳离子两性离子阴离子
pH<
pIpH=pIpH>
pI
在电场中：
带正电，向负极移动不移动带负电，向正极移动
由于各种蛋白质解离基团的种类和数量不同，因此等电点也不相同。
蛋白质在等电点时净电荷为零，溶解度最低，易发生聚沉。
配制不同pH的缓冲溶液，通过观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况，即可大致确定其等电点。
实验二可溶性蛋白质含量的测定—双缩脲法（3学时）
掌握测定可溶性蛋白质含量常规测定的原理和操作方法，熟悉分光光度计的使用。
本实验介绍双缩脲法测定可溶性蛋白质的含量。
双缩脲（H2NOC-NH-CONH2）可由两分子尿素加热至180℃左右生成，它在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色络合物（称双缩脲反应）。
而蛋白质分子中含有两个以上相邻的肽键，其结构与双缩脲类似，因此也能发生双缩脲反应，生成紫红色络合物，其反应后溶液颜色的深浅与蛋白质（浓度）含量在一定范围内呈线性关系，符合比尔定律，而且与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，受蛋白质特异性影响较小，故可利用此反应通过比色法测定蛋白质的含量，该法测定蛋白质浓度范围为1-10g/L。
实验三薄层层析法分离鉴定植物组织中游离氨基酸（3学时供选作）
了解层析技术的一般原理，分类及应用范围。
重点掌握薄层层析法的原理及操作技术，用以分离鉴定植物组织中游离氨基酸组分。
本实验以硅胶G制成薄板来分离鉴定植物组织中的游离氨基酸组分。
硅胶G加有10—15%的煅石膏粉作为粘合剂，是微酸性的吸附剂，以它作为固定相，选择适当的溶剂作流动相，由于各种氨基酸的极性不同，被硅胶G吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。
层析时，点在硅胶G薄板上的混合氨基酸被不同程度地吸附，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。
一般来说，酸性氨基酸和中性氨基酸受吸附力较弱，移动距离较长；
碱性氨基酸所受吸附力较强，移动距离较短。
经过一段时间，即可将混合物中各组分分离开。
展层后用茚三酮溶液显色，将样品各显色斑点的Rf值与同时展层的标准氨基酸的Rf值比较，即可判断样品中含有何种氨基酸。
实验四血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳（3学时）
了解电泳技术的原理、分类和应用范围，重点掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质的原理和基本技术。
醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作为支持物的一种电泳方法。
醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120μm，渗透性强，对分子移动阻力小。
本实验将其用于分离血清蛋白质。
蛋白质分子是两性电解质，在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质分子结合一部分H+而带正电，在电场中向负极移动，在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质分子解离出H+而带负电，在电场中向正极移动。
血清中含有各种蛋白质，将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的醋酸纤维薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质的等电点都小于7.5在此缓冲液中带负电荷，在电场中移向正极，血清中不同蛋白质由于带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同，带电荷多及分子量小者泳动速度快，带电荷少及分子量大者泳动速度慢。
经过一定的时间后，取消电场，将薄膜取出，立即将其浸入氨基黑10B染色液中，使蛋白质固定并染色。
随后将薄膜移入漂洗液中，洗至背景无色为止。
此时薄膜显示出蓝色区带，每条带代表一种蛋白质，按泳动快慢顺序，各区带分别为清蛋白，α1，α2，β和γ-球蛋白。
实验五聚丙烯酰胺凝胶电泳分离预染血清脂蛋白（5学时）
学习了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作与原理，掌握用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、鉴定蛋白质的技术。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamidegelelevtrophoreis,缩写PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作支持物的一种区带电泳，常用于生物高分子物质的分离鉴定。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N’N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合而成，具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物在垂直的玻璃管中进行电泳。
本实验采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定血清中的脂蛋白。
脂蛋白是一类结合蛋白质，血清脂蛋白包括α-脂蛋白、β-脂蛋白、前β-脂蛋白、乳糜微粒等组分。
将预先用苏丹黑染色的血清样品加入凝胶管中电泳后即可直接观察到上述各组分的显色区带，若用光密度扫描仪则可定量测定。
实验六酶促转氨反应（4学时）
利用纸层析方法定性测定植物（动物）组织中转氨酶的活性，掌握分配层析的原理以及层析法研究代谢的基本方法。
本实验以谷氨酸和丙酮酸混合溶液在GPT作用下的反应来观察酶促转氨基作用，其反应式为：
丙氨酸α-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸
反应结果可利用纸层析分离分析鉴定。
实验七影响酶作用的因素（3学时）
了解pH。
温度、抑制和激活剂以及酶浓度对酶的影响，加深对酶的基本性质和特点的认识和理解。
本实验借淀粉酶对淀粉的水解作用来观察，温度、pH值、激活剂等对酶促反应的影响，根据淀粉及其水解产物与碘呈色的不同，指示淀粉的水解程度，作为酶活性大小的指标。
脲酶大量存在于植物组织中，能专一性催化尿素分解。
若体系存在NaH2PO4则反应如下：
O
H2OH2ONaH2PO4
C————→CO2+2NH3———→（NH4）2CO3———→NaHCO3+（NH4）2HPO4
脲酶
NH2NH2
在底物尿素足量时，酶浓度越大，溶液pH升高越快，这可用酚红指示剂（pK=7.81，pH颜色范围6.8—8.4，黄—红）指示。
指示剂变成标准管溶液（pH特定）的颜色所需时间t（秒）越短，1/t可以表示反应速度大小，本实验用目视比色法就可明显地观察到酶浓度与酶促反应速度约成正比例关系。
实验八过氧化氢酶活力测定（3学时）
掌握酶活力测定的方法，加深对酶促反应速度及活力单位的理解
过氧化氢酶能把过氧化氢分解成水和氧，其活力大小以一定时间内一定量的酶所分解的过氧化氢量来表示。
被分解的过氧化氢量可用碘量法间接测定。
当酶促反应进行一定时间后，终止反应，然后以钼酸铵作催化剂，使未被分解的过氧化氢与碘化钾反应放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘。
其反应为：
过氧化氢酶
2H2O2—————→2H2O+O2
钼酸铵
H2O2+2KI+H2SO4————→I2+K2SO4+2H2O
I2+2Na2S2O3————→2NaI+Na2S4O6
反应完后，以样品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的过氧化氢量，即可计算出酶的活力。
五、综合性实验的开设（2选1）
实验项目名称：
SOD的分离纯化、活力测定及同工酶分析
学时：
9学时
1、实验目的：
熟悉从生物样品中提取与纯化酶的一般方法。
掌握超氧化物歧化酶活性测定的原理和方法。
掌握超氧化物歧化酶同工酶活性染色及鉴定
2、实验内容及课时安排
（1）、SOD的分离纯化：
3学时
（2）、SOD活力测定：
（3）、SOD同工酶分析：
3、实验材料、试剂和器材
（1）SOD的提取
①ACD抗凝剂：
柠檬酸10g，柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml.
②0.9%NaCl：
称取NaCl0.9g，溶于100ml蒸馏水中。
③丙酮
④95%乙醇
⑤氯仿
（2）考马斯亮蓝G-250法测蛋白质
①考马斯亮蓝G-250试剂：
称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。
此试剂常温下可保存30天。
②标准蛋白质溶液：
精确称取结晶牛血清白蛋白25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml。
吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。
（3）SOD活力测定
①50mmol/LpH8.3磷酸缓冲液
②10mmol/LEDTA钠盐溶液
③3mmol/L邻苯三酚溶液（用10mmol/L盐酸配制）
（4）SOD同工酶活性染色
实验器材：
紫外分光光度计分析天平离心机（4,000rpm）
高速台式离心机（10,000rpm）电动搅拌机
电泳仪一套（稳压电源及垂直板状电泳槽）40W日光灯
4、操作步骤
SOD的提取：
⑴取新鲜猪血20ml（预先按0.15:
1（V/V）的比例加入ACD抗凝剂），4000rpm，10min，去上层血浆，取下层红血球粘稠液,并量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000rpm，10min，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，4000rpm，10min，得洗净的红血球浓稠液。
⑵向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。
再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，再继续搅拌15min，4000rpm，10min，去变性蛋白沉淀物，得上层液。
将上层液用多层纱布进行粗滤，以除去上层液中的漂浮物，然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15分钟后取出迅速冷却至室温，4000rpm，5min除沉淀，得浅黄色粗酶液。
⑶向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱中静置过液，4000rpm，10min弃上清液，得沉淀。
将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液洗二次，离心收集沉淀，冷冻干燥即得淡蓝绿色成品。
蛋白质含量测定考马斯亮蓝G-250法）：
⑴标准曲线的制作：
取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：
管号
试剂
1
2
3
4
5
6
蛋白质标准液（ml）
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
考马斯亮蓝G-250（ml）
蛋白质含量（ug）
20
40
60
80
100
盖上塞子，摇匀。
注意各管振荡程度尽量一致。
放置10分钟，在595nm波长下比色测定光吸收值，比色应在1小时内完成。
以牛血清白蛋白含量（ug）为横座标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。
⑵样品中蛋白含量的测定
将待测的SOD溶解并稀释到一定浓度，取1支试管，准确加入0.1ml样品提取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。
⑶结果计算
根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（ug）。
SOD活力测定：
⑴邻苯三酚自氧化率的测定
取4.5ml50mmol/LpH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml10mmol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25℃水浴保温20分钟，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/LHCl作空白，325nm波长下每隔30秒钟测光吸收值一次，整个操作在4分钟内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。
要求自氧化速率控制在0.070/min左右。
⑵酶活力测定
操作与⑴基本一致，加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。
⑶酶活性单位的计算
根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：
其中，A0：
为邻苯三酚自氧化率；
Am：
加酶后邻苯三酚自氧化率；
V总：
反应总体积；
V样：
加入样品液的体积；
V定义：
活性单位定义体积1ml；
样品SOD比活力（U/mg）=单位体积活力（U/ml）/Cpr
CPr：
每ml样品液蛋白质含量（mg）。
SOD总活性（U）＝单位活性×
酶原液总体积
⑷SOD结果处理
将测得的数据或计算结果填入下表：
提纯步骤
酶液总体积
ml
蛋白质
mg/ml
酶活性
（U/ml）
总活性
（U）
比活性
U/mg.pr
回收率
（%）
纯化倍数
除血蛋白上清
热变性后上清
丙酮沉淀后的
SOD同工酶鉴定：
（1）样品制备：
取一定浓度（约0.5mgSOD/ml）酶液，按酶液∶40%蔗糖液=1∶1（V∶V）的比例配成样品液，待用。
（2）上样及电泳：
将电泳槽注满电极缓冲液，分别在各样品槽中加10～20μL样品液。
在上槽加入少量0.025%溴酚蓝溶液作指示剂，接通电源（样品侧为负极），调电压至150V电泳，待样品全部进胶后，调电压至200V，至示踪染料下行距胶底1cm处停止电泳，取出玻璃板（含胶）。
（3）显带：
用扁平药匙轻轻揭去一块玻璃板，另一板上的凝胶胶面朝下，再启胶一角注水，使胶缓缓落入培养皿中。
将电泳后的凝胶在严格避光的NBT溶液内浸泡20min，再放在2.8×
10-3mol/L的EDTA-Na2溶液中，40W日光灯下直射，至蓝色背景上出现多条透明酶带为止。
（4）干胶制备：
在浸湿的两张玻璃纸（比胶大）中夹入凝胶，平置在一块玻璃板上，赶除其间的气泡，将玻璃纸四周边缘折向玻璃板底，用另一块同样大小的玻璃板压住，再用铁夹将两块板边缘夹紧，室温下放置至干，修剪后保存。
植物（动物）组织中的DNA的提取和纯度鉴定、DNA的琼脂糖凝胶电泳
1、实验目的
核酸是生命活动最主要的物质基础，不仅通过控制蛋白质合成影响细胞组成成分和代谢类型，而且又以核苷酸在物质代谢中起着活化和载体作用，在揭示生命本质的研究中占有重要地位。
通过从植物组织中提取总DNA，并进行纯度鉴定和凝胶电泳分析，使学生初步系统地掌握从生物材料中获取核酸及其鉴定较为复杂的整个过程，掌握其基本原理和方法，能正确掌握几种仪器的使用，并对实验结果做出综合的分析和判断，为今后更为复杂的核酸操作奠定良好的基础。
（1）、DNA的提取：
（2）、DNA含量测定和纯度鉴定：
（3）、DNA的琼脂糖凝胶电泳：
（1）、材料
以小麦、高粱、玉米、黄豆、胡豆等植物为材料提取DNA。
（2）、试剂
DNA提取液（pH8.0）；
5MKAc；
TE（pH8.0）；
氯仿：
异戊醇（24∶1）；
95%乙醇溶液；
琼脂糖；
DNA染料（GoldenView）；
载样缓冲液；
TBE电泳缓冲液；
分子量标准DNA（λDNA/HindⅢ）。
（3）、器材
研钵、离心机、恒温水浴锅、752紫外光栅分光光度计、制胶板、水平电泳槽、电泳仪、紫外透射检测仪。
（1）、DNA的提取
称取2g植物幼嫩组织剪碎，放入研钵，加入8ml预热的DNA提取液，充分研磨，65℃保温20～30min，不时摇晃以免成团。
加入等体积氯仿/异戊醇（24:
1）充分摇匀3～5min，4000rpm，离心5min。
收集上清，在72℃水浴5min后迅速冰浴，随后加入1/4体积的5MKAC混匀，冰浴20min，4000rpm，离心5min。
收集上清，按2.5倍体积加入95%乙醇，将出现的白色丝状沉淀即DNA转移到另一离心管中，70%乙醇洗DNA2～3次，无水乙醇洗一次。
置于通风橱自然晾干后，加适量TE溶解，4℃保存备用。
向溶解的DNA溶液内加入RNase溶液，使其终浓度为50-75μg/ml，在37℃下保温30min，以除去RNA。
（2）、DNA含量测定和纯度鉴定
采用紫外吸收特性进行测定，取少量样品，加TE溶解，经过稀释进行测定。
一般取0.2mlDNA溶解液，加3.8mlTE溶液，在波长260nm和280nm处测定光吸收值。
纯的DNA OD260/OD280＝1.8，若污染了蛋白和酚，OD260/OD280比值明显低于此值，若OD260/OD280比值大于1.8，则说明有RNA污染。
以下是分光光度法的计算公式：
（L为比色杯厚度，一般为1；
0.020为每毫升溶液内含1微克DNA钠盐时的光密度；
A260为260nm波长处光密度读数）。
（3）、DNA的琼脂糖凝胶电泳
选用0.7%的琼脂糖胶，以GoldenView为核酸染料，制备胶板，自然充分冷却。
取出梳子后，将凝胶槽放入电泳槽，加入TBE缓冲液，直至溶液没过凝胶面。
在洁净的白磁比色盘或封口膜上，将DNA样品或DNAMaker（DNA分子量标准）溶液按比例与溴酚蓝-甘油载样缓冲液混匀。
用微量移液器吸取混合好的样品，小心将样品加入样品槽。
按正负极距离，5V/cm维持电压，DNA样品从负极向正极泳动，电泳1-1.5h。
电泳结束后，将凝胶直接推放在紫外透射检测仪的玻板上，打开紫外灯，观察电泳结果。
电泳结果可用凝胶成像系统拍照保留。
六、考核方法与成绩评定
考试是调动教和学的积极性，也是检验教学质量的关键环节。
改革实验课考核方法，增加了实验设计、口试、实验操作等考核方式，进行了实验操作与口试结合的考核试点，证明这种考核方法能检验学生对实验理论与技能的掌握情况，促进教师改进教学工作，反过来也极大地促进了实验课教学过程中全体学生主动参与、积极动手、反复实践的积极性。
~谢谢阅览~
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