第十四章 RNA的生物合成Word文件下载.docx
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①底物：
NTP（ATP、GTP、CTP、UTP）
②RNA链生长方向：
5’→3’
③不需引物
④需DNA模板
反应：
1、E.coliRNA聚合酶（原核）
E.coli和其它原核细胞一样，只有一种RNA聚合酶，合成各种RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。
一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子，在任一时刻，大部分聚合酶（5000左右）正在参与RNA的合成，具体数量依生长条件而定。
E.coliRNA聚合酶全酶|（holoenzyme）分子量46万Da，由六个亚基组成，α2ββ’σω，另有两个Zn2+。
无σ亚基的酶叫核心酶，核心酶只能使已开始合成的RNA链延长，而不具备起始合成活性，加入σ亚基后，全酶才具有起始合成RNA的能力，因此，σ亚基称为起始因子。
E.coliRNA聚合酶各亚基的大小与功能：
亚基
亚基数
分子量（KD）
基因
功能
β’
1
160
rpoC
与模板DNA结合
β
150
rpoB
与核苷酸结合，起始和催化部位。
σ
70
rpoD
起始识别因子
α
2
37
rpoA
与DNA上启动子结合
ω
9
----
不详
不同的细菌，β’、β、α亚基分子量变化不大，σ亚基分子量变化较大，44KD~92KD。
σ亚基的功能：
核心酶在DNA上滑动，σ亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数，增加停留时间，使聚合酶迅速找到启动子并与之结合，σ亚基本身无催化活性。
不同的σ因子识别不同的启动子，从而表达不同的基因。
不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但σ亚基有所差别，这决定了原核基因表达的选择性。
RNA聚合酶的催化活性：
RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。
P360图20-1RNA聚合酶的活性中心
核心酶覆盖60bp的DNA区域，其中解链部分17bp左右，RNA-DNA杂合链约12bp。
纯的RNA聚合酶，在离体条件下可转录双链DNA，但在体内，DNA的两条链中只有一条可用于转录，这可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失了σ亚基引起的。
解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内在特性，在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化，活体状况中，可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。
37℃时，RNA聚合酶的聚合速度可达40~100个核苷酸/秒
2、真核生物RNA聚合酶
真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA聚合酶：
RNA聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。
这三种RNA聚合酶分子量都在50万左右，亚基数分别为6-15。
P362表20-3真核生物RNA聚合酶的分类、分布及各自的功能
动物、植物、昆虫等不同来源的细胞，RNApolⅡ的活性都可被低浓度的α-鹅膏蕈碱抑制，而RNApolⅠ不受抑制。
动物RNApolⅢ受高浓度的α-鹅膏蕈碱抑制，而酵母、昆虫的RNApolⅢ不受抑制。
除了细胞核RNA聚合酶外，还分离到线粒体和叶绿体RNA聚合酶，它们的结构简单，能转录所有种类的RNA，类似于细菌RNA聚合酶。
3、噬菌体T3和T7编码的RNA聚合酶
仅为一条分子量11KD的多肽链，这些聚合酶只需要识别噬菌体DNA的少数启动子，并无选择地与其作用，37℃时的聚合速度200nt/秒。
二、RNA聚合酶催化的转录过程（E.coli）
P361图20-2
1、起始
RNA聚合酶结合到DNA双链的特定部位，局部解开双螺旋，第一个核苷酸掺入转录起始位点，从此开始RNA链的延伸。
在新合成的RNA链的5’末端，通常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷（pppG或pppA），即合成的第一个底物是GTP或ATP。
起始过程中，σ因子起关键作用，它能使聚合酶迅速地与DNA的启动子结合，σ亚基与β’结合时，β’亚基的构象有利于核心酶与启动子紧密结合，。
正链：
与mRNA序列相同的两、链。
负链：
模板链。
转录起点是+1，上游是-1。
2、延长
转录起始后，σ亚基释放，离开核心酶，使核心酶的β’亚基构象变化，与DNA模板亲和力下降，在DNA上移动速度加快，使RNA链不断延长。
转录起始后，σ亚基便从全酶中解离出来，然后nusA亚基结合到核心酶上，由nusA亚基识别序列序列。
3、终止
RNA聚合酶到达转录终止点时，在终止辅助因子的帮助下，聚合反应停止，RNA链和聚合酶脱离DNA模板链，nusA又被σ亚基所取代。
。
由此形成RNA聚合酶起始复合物与终止复合物两种形式的循环。
三、启动子和转录因子
启动子：
RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。
转录因子：
RNA聚合酶在进行转录时，常需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，此类蛋白质统称为转录因子。
足迹法和DNA测序法确定启动子的序列结构。
P363
（一）原核启动子结构与功能
分析比较上百种启动子序列，发现不同的启动子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶识别位点和结合位点。
（1）、-10序列（Pribnow框）
在转录起点上游大约-10处，有一个6bp的保守序列TATAAT，称Pribnow框。
此段序列出现在-4到-13bp之间，每个位点的保守性在45%-100%。
频度：
T89A89T50A65A65T100
据预测，Pribnow框中，一开始的TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酶时起十分重要的作用。
目前认为，Pribnow框决定转录方向。
酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物，Pribnow框中DNA序列在转录方向上解开，形成开放型起始结构，它是RNA聚合酶牢固的结合位点，是启动子的关键部位。
RNA聚合酶的结合，诱导富含AT的Pribnow框的双链解开，然后进一步扩大成17个核苷酸长度的泡状物，在泡状物中RNA聚合酶从模板链开始转录RNA产物。
（2）、-35序列（Sexfamabox）（识别区域）
只含-10序列的DNA不能转录，在-10序列上游还有一个保守序列，其中心约在-35位置，称为-35序列，此序列为RNA酶的识别区域。
各碱基出现频率如下：
T85T83G81A61C69A52，其中TTG十分保守。
-35序列的功能：
它是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点。
因此，-35序列对RNA聚合酶全酶有很高的亲和性。
-35序列的核苷酸结构，在很大程度上决定了启动子的强度，RNA聚合酶易识别强的启动子。
-35序列提供RNA聚合酶识别信号，
-10序列有助于DNA局部双链解开，
启动子结构的不对称性决定了转录的方向。
P364图20-4原核型启动子的结构
（二）真核启动子
真核基因的转录十分复杂，对启动子的分析要比原核基因的困难得多。
真核生物有三种RNA聚合酶：
RNA聚合酶I、II、III，分别转录rRNA、mRNA、tRNA和小分子RNA，这三类聚合酶的启动子各有其结构特点。
1、RNA聚合酶Ⅱ的启动子
RNA聚合酶Ⅱ的启动子有三个保守区：
（1）、TATA框（Hogness框）
中心在-25至-30，长度7bp左右。
碱基频率：
T82A97A85A63（T37）A83A50（T37）（全为A-T，少数含有一个G-C对）。
此序列功能：
使DNA双链解开，并决定转录的起点位置，失去TATA框，转录将可能在许多位点上开始。
TATA框的改变或缺失，直接影响DNA与酶的结合程度，会使转录起始点偏移，因此，TATA是绝大多数真核基因正确表达所必需的。
由于RNA聚合酶分子有相对固定的空间结构，同此框的结合位点和转录反应催化位点的距离，决定了起始位点的正确选择。
启动子特定序列和酶的正确结构，这两者把酶置于一种正确的构象中，决定了识别的正确性和转录起始的正确性。
（2）、CAAT框
中心在-75处，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT
功能：
与RNA聚合酶结合。
（3）、GC框
在CAAT框上游，序列GGGCGG，与某些转录因子结合。
CAAT和GC框均为上游序列，对转录的起始频率有较大影响。
2、RNApolⅢ的启动子
RNApolⅢ的启动子在转录区内部。
P365图20-5由RNA聚合酶III转录的三个基因的启动子
四、终止子和终止因子
终止子：
提供转录终止信号的一段DNA序列。
终止因子：
协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。
有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶越过终止子继续转录，称为通读，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。
终止子位于已转录的序列中，DNA的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子识别。
P366图20-6
1、大肠杆菌中的两类终止子
P366图20-6
所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个回文结构，它转录出来的RNA可以形成一个颈环式的发荚结构。
（1）、不依赖于ρ的终止子（简单终止子）
简单终止子除具有发夹结构外，在终止点前有一寡聚U序列，回文对称区通常有一段富含GC的序列。
寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。
（2）、依赖ρ的终止子
依赖ρ的终止子，必需在ρ因子存在时，才发生终止作用。
终止点前无寡聚U序列，回文对称区不富含GC。
ρ因子是55KD的蛋白质，可水解三磷酸核苷。
2、抗终止作用
通读往往发生在强启动子、弱终止子的基因上。
抗终止作用常见于某些噬菌体的时序控制。
早期基因于后基因之间以终止子相隔开，通过抗终止作用可以打开后基因的表达。
λ噬菌体前早期（immediateearly）基因的产物N蛋白就是一种抗终止因子。
它与RNA聚合酶作用使其在左右两个终止子处发生通读，从而表达晚早期（delayedearly）基因。
晚早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止因子，它能使晚早期基因得以表达。
五、转录过程的调节控制
参阅P367转录过程的调节控制、P450基因表达的调节
基因的表达是受到严格的调节控制的，转录水平的调控是关键的环节，转录调控主要发生在起始和终止阶段。
时序调控：
生长、发育、分化、时间程序。
适应调控：
细胞内外环境改变。
可位于基因的上游或下游区或内含子中。
操纵子：
原核生物基因表达的协调单位，包括结构基因、调节基因及由调节基因产物所识别的控制序列（启动子、操纵基因）。
增强子：
真核生物、病毒的基因组内，对转录起增强作用的一段DNA序列。
它具有长距离效应，与方向无关，只作用于同一条DNA链上的启动子。
转录水平的调控取决于调节因子（RNA或蛋白质）与启动子、增强子、终止子之间的相互作用。
（一）原核生物的转录调控
1、操纵子模型
调节基因的产物可以是负调节物（如阻遏蛋白），也可以是正调节物，它们与操纵基因作用，关闭或打开结构基因的表达
2、cAMP能促进许多原核生物的基因表达
cAMP可以活化环腺苷酸受体蛋白（cAMPreceptorprotein，CRP），CRP作为一种广谱性的正调节物，结合于被调控的启动子上，促进RNA聚合酶与启动子的结合，从而促进转录的进行。
葡萄糖效应：
培养基中葡萄糖含量较高时，细菌首先利用葡萄糖，阻遏利用其它底物的酶类的合成。
原因：
葡萄糖的降解物可以抑制腺苷酸环化酶的活力，并激活磷酸脂酶，因而降低cAMP的水平，使这些酶的基因不能转录。
因此，CRP又称降解物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein,CAP）。
受cAMP-CRP调节的操纵子（既代谢降解物敏感的操纵子）包括许多负责糖类分解代谢的诱导性启动子，如乳糖操纵子，半乳糖操纵子。
，阿拉伯糖操纵子等，以及负责氨基酸合成代谢的可阻遏的操纵子，如Ile-Val操纵子（iLV）。
调节子：
受一种一种调节蛋白所控制的几个操纵子系统，这些操纵子通常都属于同一个代谢途径或与同一种功能有关。
综合性调节子：
一种调节蛋白控制几个不同代谢途径的操纵子，如cAMP-CRP对各种分解代谢和合成代谢的调控系统。
3、衰减子的调控作用
（二）真核生物的转录调控
第二节RNA转录后的加工
RNA聚合酶合成的原初转录产物，要经过剪切、修饰、拼接等过程，才能转变成成熟的RNA分子，此过程称RNA转录后的加工。
（1）、原核、真核的tRNA、rRNA（稳定的RNA）
细胞内的tRNA、rRNA相对稳定，半衰期一般为几个小时。
所有的tRNA、rRNA都不是原初转录产物，都要经过一系列的加工才能成为有活性的分子。
a.原初转录产物的5’是三磷酸（pppG、pppA），而成熟的tRNA、rRNA，5’是单磷酸。
b.成熟tRNA、rRNA分子都比原初转录物小。
c.所有的tRNA分子，都有原初转录物所没有的稀有碱基（A、G、C、U以外的碱基）。
（2）、真核的mRNA
单顺反子，多内含子。
寿命比原核mRNA的长。
内含子、内元（intron）：
在原初转录物中，通过RNA拼接反应而被去除的RNA序列，或基因中与这种序列对应的DNA序列。
外显子、外元（exon）：
原初转录物通过RNA拼接反应后，而保留于成熟RNA中的序列，或基因中与成熟RNA对应的DNA序列。
（3）、原核mRNA
多顺反子，半衰期只有几分钟。
这是原核生物重要的调控机制，如果一种酶或蛋白质不再需要时，只需简单地关闭其mRNA的合成就行了。
二、原核生物RNA的加工
在原核生物中，rRNA基因与某些tRNA基因组成混合操纵子，可提高效率、节省空间（增加有效信息）。
其它的tRNA基因也成簇存在，并与编码蛋白质的基因组成操纵子，它们在形式多顺反子转录物后，断裂成为rRNA和tRNA的前体，然后进一步加工成熟。
1、原核rRNA前体的加工（E.coli）
P370图20-7E.colirRNA前体的加工
E.coli共有三种rRNA
5SrRNA120b
16SrRNA1541b
23SrRNA2904b
rRNA原初转录物含6300个核苷酸，约30S。
大肠杆菌有7个rRNA的转录单位（操纵子），它们分散在基因组的各处。
每个转录单位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNSA以及一个或几个tRNA基因所组成。
每个操纵子中tRNA基因的种类、数量和位置都各不相同。
RNAaseⅢ是一种rRNA、多顺反子mRNA加工的内切酶，识别特定的RNA双螺旋区。
RNAaseE也可识别P5（5SrRNA前体）两端形成的双螺旋区。
2、原核tRNA前体的加工
P371图20-8
E.coli染色体基因组有60个tRNA基因，即某种a.a.的tRNA基因不止一个拷贝。
tRNA基因大多成簇存在，或与rRNA基因，或与蛋白质基因组成混合转录单位。
tRNA前体加工步骤
a.核酸内切酶（RNAaseP、RNAaseF）在tRNA两端切断。
b.核酸外切酶（RNAaseD）从3’端逐个切去附加序列。
c.在tRNA3’端加上-CCA-OH。
tRNA核苷酰转移酶
d.核苷的修饰（修饰酶）：
甲基化酶/S-腺苷蛋氨酸（SAM），假尿苷合成酶。
（1）、RNAaseP
能识别空间结构，很干净地切除tRNA前体的5’端。
含有蛋白质和RNA（M1RNA）两部分。
M1RNA含375nt，在某些条件下，（提高[Mg2+]、或加入胺类），RNAaseP的RNA能单独地切断tRNA前体的5’端序列。
（2）、RNAaseF
不干净地切除tRNA前体的3’端序列，需要RNAaseD进一步修剪。
3、原核mRNA前体的加工
由单顺反子构成mRNA，一般不需加工，一经转录，即可直接进行翻译。
有些多顺反子构成的mRNA，须由核酸内切酶切成较小的mRNA，然后再进行翻译。
例：
核糖体大亚基蛋白L10、L7、L12与RNA聚合酶β、β’亚基的基因组成混合操纵子。
它在转录出多顺反子mRNA后，由RNAaseⅢ将核糖体蛋白质基因与聚合酶亚基基因的mRNA切开，然后各自翻译。
该加工过程的意义：
可对mRNA的翻译进行调节，核糖体蛋白质的合成必须适应于rRNA的合成水平，而细胞内RNA聚合酶的合成水平则要低得多。
两者切开，有利于各自的翻译调控。
三、真核生物RNA的加工
真核rRNA、tRNA前体的加工过程与原核的很相似，但mRNA的加工过程与原核的有很大不同。
1、真核rRNA前体的加工
真核生物核糖体的小亚基含：
16-18SrRNA，大亚基含：
26-28SrRNA、5SrRNA、5.8SrRNA（特有）。
真核rRNA基因拷贝数较多，几十至几千个之间。
真核rRNA基因也成簇排列在一起，18S、5.8S、28SrRNA基因组成一个转录单位，彼此被间隔区分开，由RNA聚合酶I转录生成一个长的rRNA前体。
5SrRNA基因也成簇排列，间隔区不被转录，由RNA聚合酶III转录后经适当加工。
哺乳动物：
45SrRNA前体，含18S、5.8S、28SrRNA
果蝇：
38SrRNA前体，含18S、5.8S、28SrRNA
酵母：
37SrRNA前体，17S、5.8S、26SrRNA
rRNA在成熟过程中可被甲基化，位点主要在核糖2’-OH上。
真核rRNA甲基化程度比原核的高，约1-2%的核苷酸被甲基化。
真核生物的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所，大、小亚基分别组装后，通过核孔转移到胞质中参与核糖体循环。
2、真核tRNA前体的加工
真核tRNA基因的数目比原核tRNA的要多的多。
例如，E.coli有60个tRNA基因，啤酒酵母250个，果蝇850个，爪蟾1150个，人1300个。
真核tRNA基因也成簇排列，被间隔区分开，tRNA基因由RNA聚合酶Ⅲ转录。
真核tRNA前体的剪切、修饰过程与原核相似。
3、真核生物mRNA前体的加工
mRNA原初转录物是分子量很大的前体，在核内加工过程中形成分子大小不等的中间产物，它们被称为核内不均一RNA（hnRNA）。
其中，约有25%可转变成成熟的mRNA。
hnRNA半寿期很短，比细胞质中的mRNA更不稳定，一般在几分钟至1小时。
而细胞质mRNA的半寿期为1-10小时，神经细胞mRNA最长可达数年。
hnRNA转变成mRNA的加工过程主要包括：
a.5’末端形成帽子结构
b.3’末端切断并加上polyA
c.剪接除去内含子对应的序列
d.甲基化
（1）、5’末端加帽
反应步骤P374
RNA三磷酸酶，mRNA鸟苷酰转移酶，mRNA（鸟嘌呤-7）甲基转移酶，mRNA（核苷-2’）甲基转移酶。
由于甲基化的程度不同，有三种类型的帽子：
CAPO型，CAPI型，CAPII型。
★5’帽子也出现于hnRNA，说明加帽过程可能在转录的早期阶段或转录终止前就已完成。
★5’帽子的功能
a.在翻译过程中起信号识别作用，协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。
b.保护mRNA，避免5’端受核酸外切酶的降解。
（2）、3’端加polyA
hnRNA链由RNAaseⅢ切断，由多聚腺苷酸聚合酶催化，加上polyA，ATP为供体。
加尾信号：
AATAAA、YGTGTGYY（Y为嘧啶）。
高等真核生物和病毒的mRNA在靠近3’端区都有一段非常保守的序列AAUAAA，这一序列离多聚腺苷酸加入位点的距离在11-30nt范围之内。
核内hnRNA的3’端也有多聚腺苷酸，表明加尾过程早在核内已经完成。
hnRNA中的poly（A）比mRNA略长，平均150-200nt。
polyA的功能
a.防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解，起缓冲作用。
b.与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。
3’脱氧腺苷（既冬虫夏草素）是多聚腺苷酸化的特异抑制剂，但它不抑制hnRNA的转录。
（3）、mRNA甲基化
某些真核mRNA内部有甲基化的位点，主要是在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。
四、RNA的拼接和催化作用（内含子的切除）
多数真核基因是断裂基因，其转录产物通过拼接，去除内含子，使编码区（外显子）成为连续序列。
有些内含子可以催化自身的拼接（self-splicing）,有些内含子需要在有关酶的作用下才能拼接。
1、tRNA前体的拼接
酵母tRNA约有400个基因，有内含子的基因约占1/10，内含子长度14-46bp，没有保守性。
切除内含子的酶识别的是tRNA的二级结构，而不是什么保守序列。
拼接过程：
第一步切除内含子，第二步RNA连接酶将两个tRNA半分子连接。
P375图20-9酵母tRNAPhe及其前体的结构
P376图20-10酵母和植物tRNA前体的拼接过程
2、四膜虫rRNA前体的自我拼接
四膜虫35SrRNA前体，经加工可以生成5.8S、17S和26SrRNA。
某些品系的四膜虫在其26SrRNA基因中有一个内含子，35SrRNA前体需要拼接除去内含子。
该拼接过程只需一价和二价阳离子和鸟苷酸（提供3’-OH），无需能量和酶。
P377图20-11四膜虫rRNA的拼接
3、mRNA前体的拼接
真核生物所有编码蛋白质的核结构基因，其内含子的左端均为GT，右端均为AG。
此规律称GT-AG规律（对于mRNA就是GU-AG，此规律不适合于线粒体、叶绿体的内含子，也不适合于tRNA和某些rRNA的核结构基因）
酵母核基因的内含子在靠近3’端还有一个保守序列，与5’端序列互补，称为TACTAACbox，也与拼接有关。
真核细胞内存在许多种类的小分子RNA，大小在100-300
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