实验报告示范 生化实验PPT技术文档Word文件下载.docx

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当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；

蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

提取的质粒DNA通过对核酸特异性吸附的树脂进行离心过滤纯化。

2、质粒酶切：

限制性内切酶能够识别短的DNA序列并在识别序列内或旁侧特异性切割双链DNA。

对环状DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。

如本次试验使用的限制性内切酶为BamHI酶，识别的序列分别为G↓GATCC（↓表示切割部位）。

3、DNA琼脂糖凝胶电泳：

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

4．重叠PCR合成基因：

本次实验设计了首尾相连长链DNA片段，通过多轮PCR人工合成了转录因子SalL4及其DNA结合域基因。

5、表达载体与基因克隆及其表达：

本实验采用了pET-DsbA融合表达载体，可在大肠杆菌BL21（DE3）中融合表达外源基因。

文献报道DsbA融合有利于实现可溶性表达。

该载体表达产物N端带6个His便于采用Ni2+chelatingsepharose亲和层析纯化目标蛋白。

6、6His－tag融合蛋白的纯化：

在外源基因表达载体相对应表达蛋白的N端或者C端添加6个组氨酸（即6His－tag）实现融合表达。

。

金属鏊合层析，又称固定化金属离子亲和层析（Immobilizedmetalionaffinitychromatography,IMAC）。

该法将通过亚氨基二乙酸（IDA）等将金属离子Ni2+鏊合在琼脂糖凝胶上形成的一种亲和层析介质，利用6His－tag与金属离子Ni2+能够发生特殊的相互作用而较特异地吸附带有6His－tag，吸附的6His－tag融合蛋白可以用高浓度的咪唑竞争性洗脱下来，从而实现目标蛋白即带6His－tag的融合蛋白与杂蛋白的分离。

其它实验步骤：

DNA切胶回收通过对核酸特异性吸附的树脂进行离心过滤纯化；

DNA连接在15°

含ATP溶液里面，DNA连接酶将两个酶切的DNA片段进行连接；

质粒转化采用CaCl2方法进行。

【实验方法与步骤】：

2.1.1菌株和质粒

大肠杆菌JM109，BL21（DE3）为本实验室构建保存；

pMD18-T、pMD19-T载体购于TaKaRa公司，表达载体pET-DsbA为本实验室构建保存。

2.1.2主要仪器设备

PCR仪为德国Biometra公司产品

移液枪为德国Eppendorf公司产品

恒温培养箱为上海一恒公司产品

恒温水浴锅为英国Grant公司产品

水平电泳槽，垂直电泳槽为美国Bio-Rad公司产品

凝胶成像系统为美国Carestream公司产品

微型离心机，台式高速离心机为德国Eppendorf公司产品

恒温摇床为美国NewBrunswickScience公司产品

2.1.3主要试剂

DNA胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒为美国Omega公司产品

LATaqDNA聚合酶、PrimeStarHSDNA聚合酶、PCR专用GCBuffer、dNTP、限制性内切酶（BamHⅠ,HindⅢ）、T4DNA连接酶、DL2000DNAMarker、10×

loadingbuffer均为大连宝生物工程有限公司（Takara）产品

标准蛋白ladder，蛋白loadingBuffer、DTT为加拿大Fermentas公司产品

蛋白胨，酵母粉，琼脂，琼脂糖均为英国Oxiod公司产品

NaCl，NaOH，CaCl2，MgCl2均为西陇化工公司产品

氨苄青霉素为石家庄制药公司产品

核酸染色剂GelView为北京百泰克公司产品

50×

TAE为上海生工公司产品

IPTG、lysozyme为加拿大BioBasic公司产品

30%丙烯酰胺、1.5molTris-HCl（pH8.8）、0.5molTris-HCl（pH6.8）、SDS、过硫酸铵、TEMED、Tris、甘氨酸、考马斯亮蓝染色液均为美国Bio-Rad公司产品

2.2方法

2.2.1引物的设计与合成

根据小鼠的SalL4基因序列（GenBank序列号为CAM21963），及分析其DNA结合区域。

参考大肠杆菌偏爱密码子，采用PrimerPremier5.0软件分别为SalL4（FL）设计11对引物，为SalL4（DBD）设计2对引物。

2.2.1.1SalL4（FL）引物：

F1:

5’-TTTGTGGCCGTGCGTTTACCACCAAAGGCAACCTGAAAGTGCATTATATGACCCATGGC-3’

R1:

5’-TCGCCAGTTTGCGACCACGGCGCGCGCTGTTGTTGTTCGCGCCATGGGTCATATAATGC-3’

F2:

5’-GAACGCACCCATACCGGCGAGAAACCGTTTGTGTGCAACATTTGTGGCCGTGCGTTTAC-3’

R2:

5’-CGTTTGCCTTCCGCGCTCAGCGCCGCCATAGGGTTTTCAATCGCCAGTTTGCGACCACG-3’

F3:

5’-CGGCAAGAACTTTAGCAGCGCCAGCGCGCTGCAGATTCATGAACGCACCCATACCGGCG-3’

R3:

5’-CGCCGGGCTCAGCAGTTCTTTGCTAAACACTTCCGGCGCGCGTTTGCCTTCCGCGCTCA-3’

F4:

5’AGCCACGACGCCAGGCGAAACAGCATTGCTGCACCCGCTGCGGCAAGAACTTTAGCAGC3’

R4:

5’CGCTGGTATACTGGTTCCACGACGCCGGGTCCACGCTCACCGCCGGGCTCAGCAGTTCT3’

F5:

5’-ATGCCGAGTGGTATGCCGCCGCTGCTGGCGAGCCAGCCGCAGCCACGACGCCAGGCGAA-3’

R5:

5’-CTAATTTCGTTGGTTTTCATCGCCAGGCCGCCGTTCAGCACGCTGGTATACTGGTTCCA-3’

F6:

5’-GAAAGTGGAAGTGCCGGGCACCTTTGTGGGCCCGCCGAGCATGCCGAGTGGTATGCCGC-3’

R6:

5’-GCTCACCGGCAGGGTCGGAATGCCGCCGCTCTGAATCACGCTAATTTCGTTGGTTTTCA-3’

F7:

5’-GCCTGCCGCCGACCTTTATTCGCGCGCAGCCGACCTTTGTGAAAGTGGAAGTGCCGGGC-3’

R7:

5’-TGCTAATGGTGCCGTTGCTCACCACGCTGCTCGCGCCCAGGCTCACCGGCAGGGTCGGA-3’

F8:

5’-CTGGCAGAAGCACTGGCGGCGGAAGAACCGGGCCGCACCAGCCTGCCGCCGACCTTTAT-3’

R8:

5’-CTCATCGGCATGCTCACGCCGGTCTGGCTGCCATCCAGTTTGCTAATGGTGCCGTTGCT-3’

F9:

5’-AGGTCAGGGCGAACAGCCGCAGCAGCTGCCGAGCCCGGATCTGGCAGAAGCACTGGCGG-3’

R9:

5’-CGCCATGCCATCCGGCACCGCCAGTTTTTCGCCGTTGCCGCTCATCGGCATGCTCACGC-3’

F10:

5’-GCCGCAAACAGGCGAAACCGCAGCATATTAACTGGGAAGAAGGTCAGGGCGAACAGCCG-3’

R10:

5’-CAATTTTGTTTTCTTCCAGAAAATGCGGAAACTGATGTTTCGCCATGCCATCCGGCACC-3’

F11:

5’-AGGATCCATGAGCCGCCGCAAACAGGCGAAACC-3’

R11:

5’-AAGCTTAGCTCACCGCAATTTTGTTTTCTTCCAG-3’

在第十一对引物引入限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切位点（下划线部分），理论扩增片段大小为848bp，引物的合成由大连宝生物工程有限公司（Takara）完成。

2.2.1.1SalL4（DBD）引物：

5’-TTCTCCTCCGCGTCCGCGCTGCAGATTCATGAACGCACCCATACCGGCGAGAAACCGTT-3’

5’-GCCTTTGGTGGTAAACGCCCTGCCGCAAATGTTGCACACAAACGGTTTCTCGCCGGTAT-3’

5’-AGGATCCGGCTCTTGCACCAGGTGCGGCAAGAACTTCTCCTCCGCGTCCGCGC-3’

5’-AAAGCTTATGGGTCATATAATGCACTTTCAGGTTGCCTTTGGTGGTAAACGCC-3’

在第二对引物引入限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切位点（下划线部分），理论扩增片段大小为153bp，引物的合成由大连宝生物工程有限公司（Takara）完成。

2.2.2目的基因的扩增

第一轮PCR以F1、R1两条引物互为模板，扩增的反应体系如下（表1）：

表1第一轮PCR扩增反应体系

PrimeStarHSDNA聚合酶

0.5μl

10×

HSBuffer

5μl

dNTP

10μl

上游引物

1μl

下游引物

ddH2O

32.5μl

50μl

以后的每轮PCR均以上一轮PCR回收产物为模板，扩增的反应体系如下（表2）：

表2每轮PCR扩增反应体系

模板

PCR反应条件：

95℃3min后用降落（Touchdown）PCR方式[6]进行扩增，第1个循环为94℃45s，59℃50s，72℃1min，重复三次，此后退火温度逐渐下降1℃，每个温度三个循环，当退火温度下降到56℃时，则以94℃45s，57℃50s，72℃1min运行16个循环，再于72℃延伸10min结束。

结果分析：

1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，用DL2000作为DNAMarker。

电泳条件为：

电压90V，时间20min。

电泳完毕在紫外灯下观察并用凝胶成像系统照相。

2.2.3目的基因的回收与纯化

使用Omega公司的胶回收试剂盒[7]回收PCR产物，纯化目的基因。

取1μl回收产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，贮存于-20℃备用。

2.2.4大肠杆菌JM109感受态细胞的制备

将保存于液氮的大肠杆菌JM109解冻后，划线接种于LB培养基平板，37℃恒温培养过夜。

挑取平板上的单个菌落，接种到20mlLB培养基液体37℃振荡培养过夜。

取1%的菌液接种到20ml新鲜LB培养基液体，37℃剧烈震荡，活化3h至OD600为0.5。

活化完得菌液冰上放置15min,使菌液冷却。

7000rpm离心1min，尽量弃尽上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬细胞，7000rpm离心1min，尽量弃尽上清。

用预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬细胞，即得感受态细胞。

每次感受态细胞使用期限为3d。

2.2.5基因的克隆

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并在紫外灯下切胶回收预计片段大小处的DNA条带，PCR产物经过加A处理，反应体系如表3，再进行TA克隆，与pMD-19T连接，连接反应体系如表4，获得重组克隆质粒pMD-19T-SalL4（FL）。

表3PCR产物加A反应体系，反应条件：

72℃，,10min

SalL4（FL）PCR回收产物

7.5μl

LATaq

LATaqBuffer

表4pMD-19T载体连接反应体系，连接条件：

16℃，12h

SalL4（FL）

7μl

pMD-19T

T4ligase

T4ligasebuffe

2.2.6重组质粒的转化与酶切鉴定

在60μl制备好的大肠杆菌感受态细胞JM109中加入5μl连接完毕的质粒，混匀后在冰上放置30min，将管放到42℃恒温水浴热击90s，取出后迅速冰浴5min。

在管内加入100μlLB液体培养基轻轻混匀，37℃，150rpm复苏1h。

取100μl已转化的感受态细胞，涂在含氨苄青霉素的培养皿上，37℃培养过夜。

挑取阳性菌落，提取质粒[8]，经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后，酶切反应体系如表5，阳性克隆送大连宝生物工程有限公司（Takara）测序。

表5BamHⅠ和HindⅢ双酶切酶切反应体系，酶切条件：

37℃，1.5h

重组质粒

16μl

BamHⅠ

HindⅢ

KBuffer

2μl

20μl

2.2.7重组质粒pET-DsbA-SalL4（FL）和pET-DsbA-SalL4（DBD）的构建与鉴定

将已鉴定的重组体pMD-19T-SalL4（FL）pET-DsbA融合表达载体提取质粒，均用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收所需片段，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞JM109涂在含氨苄青霉素的LB平板上。

经过筛选重组质粒的转化子并提取重组质粒，BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定（表6）。

表6pMD-19T载体连接反应体系，连接条件：

pET-DsbA

将已鉴定的重组体pMD-18T-SalL4（DBD）pET-DsbA融合表达载体提取质粒，均用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收所需片段，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞JM109涂在含氨苄青霉素的LB平板上。

经过筛选重组质粒的转化子并提取重组质粒，BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定。

表7pMD-19T载体连接反应体系，连接条件：

SalL4（DBD）

2.2.8重组表达质粒pET-DsbA-SalL4（FL）和pET-DsbA-SalL4（DBD）的诱导表达

2.2.8.1重组质粒pET-DsbA-SalL4（FL）和pET-DsbA-SalL4（DBD）的转化、初步诱导

将鉴定正确的重组质粒pET-DsbA-SalL4（FL）和pET-DsbA-SalL4（DBD）分别转化BL21感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上培养过夜，挑取单菌落接种至含氨苄青霉素0.001g/ml的20ml液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。

将过夜培养菌以2:

100转接至含上述抗生素的200ml新鲜培养基中，37℃、250rpm强烈振荡培养2-3h，培养至菌液的OD600值达到0.6左右时，在剩余菌液中加入IPTG至终浓度为1mmol/L,再补充一半浓度0.0005g/ml的氨苄青霉素32℃诱导6h。

此时各取出1ml菌液为已诱导的电泳检测。

2.2.8.2SDS-PAGE凝胶电泳

配制蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶：

15%分离胶和5%浓缩胶[9]。

取诱导后菌液各1ml，10000rpm，室温离心1min，弃上清；

菌体中加入75μl蒸馏水重悬，各加入20μl5×

loadingBuffer和5μl20×

DTT混匀，取75μl超声上清及超声沉淀重悬液，各加入20μl5×

DTT混匀。

100℃加热5min。

各取5μl上样，设电压为90V，蛋白进入分离胶后电压增至120V，电泳时间约80min。

电泳结束后将胶小心取出，用考马斯亮蓝染色1h。

染色后用脱色液脱色，每隔4小时换一次脱色液，脱色20h。

待脱色完全至背景无色，数码相机拍照保存图片。

2.2.8.3重组蛋白的大量制备与纯化

大量诱导培养：

培养菌液及蛋白诱导与上述初步诱导的方法一样，在活化时将菌液扩大培养，至250ml×

4瓶LB液体培养基，分瓶以利于大肠杆菌生长。

破菌收集上清：

共1L的诱导菌液，离心（4℃，12000rpm，5min）收集菌体，重悬于50ml含40mM咪唑的缓冲液，加少量溶菌酶放置10min，冰浴超声破碎（400W，每次超声5s，间隔10s，40次循环）。

4℃、12000rpm离心30min，收集上清。

过滤上清：

将离心收集的上清液通过0.45um滤膜。

过Ni2＋柱纯化：

用200mMNiSO4处理层析柱，1ml预装填料Ni2＋Chelatingsephraose可以吸附10mg的6His-tag融合蛋白。

已经鏊合了Ni2+层析柱用5个柱体积的ddH2O冲洗，再用含40mM咪唑的平衡缓冲液冲洗10个柱体积以达到平衡。

将过滤后的上清上样，缓慢通过柱子；

用含40mM咪唑的缓冲液，洗去杂蛋白；

用含200mM咪唑的缓冲液进行洗脱，在5只EP管中依次收集500μl洗脱液。

SDS-PAGE分析纯化的蛋白样品（洗脱液）。

检查纯化效果。

【实验结果与分析】：

3.1PCR扩增目的基因的结果

3.1.1SalL4（FL）目的基因的PCR结果

将SalL4（FL）每一步的PCR产物取1μl进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得特异性的目的条带,并与预期大小一致。

图1目的基因SalL4（FL）的分段PCR产物电泳M：

DL2,000DNAMarker；

1：

Sall4F1/Sall4R1；

2：

Sall4F2/Sall4R2；

3：

Sall4F3/Sall4R3；

4：

Sall4F4/Sall4R4；

5：

Sall4F5/Sall4R5；

6：

Sall4F6/Sall4R6；

7：

Sall4F7/Sall4R7；

8：

Sall4F8/Sall4R8；

9：

Sall4F9/Sall4R9；

10：

Sall4F10/Sall4R10；

11：

Sall4F11/Sall4R11

3.1.2SalL4（DBD）目的基因的PCR结果

将SalL4（DBD）每一步的PCR产物取10μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得特异性的目的条带,并与预期大小一致。

图2目的基因SalL4（DBD）的分段PCR产物电泳M:

DL2,000DNAMarker;

1:

Sall4F1/Sall4R1;

2:

Sall4F2/Sall4R2

3.2目的基因序列的酶切鉴定

将SalL4（FL）PCR产物与PMD19-T载体连接,转化JM109感受态菌后,挑取白色菌落,接种于LB（含氨苄青霉素）培养基中,小量提取质粒DNA后,进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，得到850bp左右的条带，酶切结果均与预计完全相同,酶切鉴定结果如图3。

图3pMD-19T-SalL（FL）重组质粒BamHⅠ/HindⅢ双酶切M:

L2,000DNAMarker;

1:

alL4（FL）阳性克隆质粒

将SalL4（DBD）PCR产物与PMD18-T载体连接,转化JM109感受态菌后,挑取白色菌落,接种于LB（含氨苄青霉素）培养基中,小量提取质粒DNA后,进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，得到150bp左右的条带，酶切结果均与预计完全相同,酶切鉴定结果如图4。

图4pMD-18T-SalL（DBD）重组质粒BamHⅠ/HindⅢ双酶切M:

SalL4（DBD）阳性克隆质粒

3.3目的基因序列的测序结果

3.3.1SalL4（FL）基因测序结果

将获得的pMD19-T-SalL4（FL）克隆体转化至大肠杆菌E.coliJM109后，阳性菌落经大连宝生物工程有限公司测序,以通用引物pMD18F、pMD18R为测序引物，对pMD19-T-SalL4（FL）进行双向测序，测序峰图如图5、图6。

读取序列表明，PCR扩增序列正确，片段共848bp。

图5SalL4（FL）正向测序图

图6SalL4（FL）反向测序图

3.3.2SalL4（FL）基因序列BLAST比对

利用PrimerPremier5.0软件将测序所得的核苷酸序列翻译成蛋白质序列（图7），并在NCBI网站上利用BLAST工具进行同源性搜索和分析，结果显示这段序列与鼠源转录因子SalL4蛋白的氨基酸序列同源性为100％（图8）。

图7SalL4（FL）氨基酸序列

图8SalL4（FL）氨基酸序列BLAST比对结果

3.3.3SalL4（DBD）基因测序结果

将获得的pMD18-T-SalL4（DBD）克隆体转化至大肠杆菌E.coliJM109后，阳性菌落经大连宝生物工程有限公司测序,以通用引物pMD18F、pMD18R为测序引物，对pMD18-T-SalL4（FL）进行双向测序。

测序峰图如图9、图10。

读取序列表明，PCR扩增序列正确，片段共153bp。

图9：

SalL4（DBD）正向测序图

图10：

SalL4（DBD）反向测序图

3.3.5SalL4（DBD）基因序列BLAST比对

利用PrimerPremier5.0软件将测序所得的核苷酸序列翻译成蛋白质序列（