九、流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制.ppt

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CD4绝对计数的原理、方法和质量控制,张子宁卫生部艾滋病免疫学重点实验室,HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义,淋巴细胞在免疫应答中起核心作用。

CD4+T淋巴细胞对细胞免疫和体液免疫平衡的维持具有枢纽的功能。

CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。

HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用感染细胞-未感染细胞形成合胞体程序性细胞死亡自身免疫机制特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用,HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细胞数量的缺失，最终引起感染者免疫功能缺陷。

HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化,CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降T细胞亚群比例倒置，CD4/CD81.0CD4+细胞功能受损,外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案以及评价治疗效果的实验室标准指标。

2-6weeks,meanof10years,Asymptomaticphase,Flu-likeDisease,Symptom-aticphase,AIDS,Infection,Seroconversion,Death,CD4Tcelldepletion,HAART,成人及青少年艾滋病分期标准（CDC，美国，1993年）,CD4200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为进入艾滋病期。

如表中A3，B3，C1-3期。

判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防,艾滋病诊断与治疗指导方案（试行，2002年）,确定抗HIV药物治疗开展的时机及进行疗效评价,艾滋病诊断与治疗指导方案（试行，2002年）,虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具，但是单独的CD4+T细胞数减少不是HIV感染的诊断检验。

其它的免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细胞数量减少的结果:

-丙球蛋白缺乏症-胸腺发育不全（DiGeorge氏综合症）-严重的联合免疫缺陷,提示,CD4+T细胞计数的方法,非FCM技术,FCM技术,-设备昂贵-试剂昂贵-需要熟练技术人员操作,缺点,-低通量-难于质控,缺点,仪器的选择,1、中央级、省级、研究所、高校、医院：

流式细胞仪（FACSCalibur、Coulter）2、地区级及示范区：

专门的流式细胞计数仪（FACSCount、Guava）3、现场及乡镇卫生院：

（手工方法：

如Dynabeads）4、除此之外，在不具备CD4检测的实验室，WHO建议用总淋巴细胞来代替。

（当总淋巴细胞小于1000/ul时，强烈预示CD4细胞小于200/ul。

非流式细胞技术,免疫聚合磁珠Dynabeads（利用光镜和免疫荧光染色）细胞球Cytosphere（利用计数板和光镜）,Dynabeads技术计数CD4细胞,原理用抗CD4单克隆抗体（mAbs）包被的磁化粒子捕获与分离全血中CD4T淋巴细胞方法将125l新鲜血液，放入EDTA管，加350lPBS，再加入25lmAbs磁化悬浮粒子，在摇床（DynalMechnicalRotator）上置室温10分钟混和，以便去掉血液中的单核细胞。

磁化粒子用专门的磁性浓度计分离，并用PBS洗涤2次，加入50lLysing溶液，着色，用epifluorescent显微镜计数。

价格：

3美元/人份,流式细胞术（flowcytometry,FCM）,流式细胞仪,BDFACSVantage,BD-Calibur,对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选,FCM的特点,保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏从分子水平获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选,功能特点

（1）多参数定量分析每一个细胞；

（2）细胞分选；高纯度：

99%以上；可分析小于1/10000比例的稀有细胞群；单细胞克隆等。

（3）高通量（分析分选）分析150，000个/秒分选100，000个/秒,流式细胞仪内部结构,光学系统激光光源光收集系统液流系统流动室液流驱动系统电子系统光电转换数据处理系统细胞分选系统,流体动力学聚焦,流动室,激光聚焦,1、液流系统,包裹样本流使之位于喷嘴中心,光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。

2、光学系统：

激光光源、分色反光镜、光束成形器、透镜组、滤片、光电倍增管,数据处理系统,FSCSSCFL1FL2FL3,对数线性线性线性对数,脉冲处理，模数转换,光信号,电信号,记录数据，显示结果,（面积，峰高，宽度）,基本工作原理,非荧光信号,颗粒度,细胞大小,散射光的测定,散射光信号区分裂解后的外周血细胞群,荧光测量,荧光染料被激发而发射的光信号多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量,线性放大：

信号强度变化范围较少、生物学线性过程对数放大：

信号强度变化范围较大、光谱信号复杂,数据的显示与分析,参数FSSSFL,单参数直方图一维参数（荧光或散射光）与颗粒技术（Count）构成，反映同样荧光强度的颗粒数量的多少横坐标：

光信号波长相对值（信道）纵坐标：

被测细胞的相对数量,数据显示方式,双参数直方图点图二维等高图：

等高线连接相同细胞数的点密度图假三维等高图,三参数直方图,流式细胞仪的多参数分析,Region设置指在同一张单参数或双参数直方图上根据信号的强弱划定分析区域，从而计算分析区域内的细胞数量。

CD45FITC（log）,CD14PE（log）,Gate设置是指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。

双平台法：

单平台法：

流式细胞技术检测CD4+T细胞,流式细胞技术传统的FCM:

双平台法,需要两台仪器需要几个制备和分析步骤分析能力低结果受多个因素影响昂贵,传统的FCM:

单平台法,只需一台仪器较少的制备和分析步骤非常昂贵,美国CDC推荐（2003）,单平台测定CD4+T细胞绝对数指南-FDA批准的商业荧光微球计数试剂以CD45设门三或四色流式细胞仪三色组合1）CD3/CD4/CD452）CD3/CD8/CD453）CD3/CD19/CD45四色组合1）CD45/CD3/CD4/CD82）CD45/CD3/CD19/CD16和/或CD56,FACSCaliburTM系统选配BDBTritest/TruCOUNTTM试管,WWW.BDBIOSCIENCES.COM,样本制备（Lyse/No-wash技术）,50L抗凝全血,涡旋,室温避光孵育15分钟,获取和分析,20LTriTEST试剂,450LFACS溶血液（1x）,TruCOUNTTM试管,TriTEST试剂:

a）CD3/CD4/CD45,b）CD3/CD8/CD45,室温避光孵育15分钟,CD45PerCP,SSC,BDBMultiSETTM软件,MMWR,2003:

52（RR02）;1-13,CD4绝对计数结果,内置微处理器实现数据自动分析,自动打印质控与病人的检测结果,简单易用的系统控制面板,配套的样本制备工作台,简捷的样本制备方法，避免细胞损失,BDBFACSCountTM系统,仪器性能,样本稳定性制备后室温（20250C）储存48小时全血稳定性采集后室温（20250C）储存48小时,仪器性能,范围CD4+:

50-2000个细胞/uLCD8+:

100-2000个细胞/uLCD3+:

100-3500个细胞/uL,检测试剂盒组成（50人份/盒）荧光试剂2个组合/人份CD4PE/CD3PE-CY5CD8PE/CD3PE-CY5固定液效期280C储存6个月,质控试剂盒（50人份/盒）零，低，中，高4种靶值微球效期280C储存1个月,使用简单方便,安装简便，一体式设计，无需外源计算机即开即用，无需调试校准全自动软件自动识别分析淋巴细胞群体自动错误报警,实验报告,CD3CD4CD8CD4/CD8CD4/CD3CD8/CD3,报告项目,自动设定分析区域,CD3,Size,CD3,CD4,内参微球,设定分析群体,CD3,CD4,CD3,CD8,CD8管分析,绝对计数公式,举例,#2,#1,X,#获取微球数,mL全血,=,CD4细胞,mL全血,CD3,CD4,绝对计数计算,CD4,质控微球,绝对计数计算,CD4+T细胞检测的质量控制,质量控制是指在每一次实验过程中为确保实验工作正常进行而必须采取的各种措施。

实验前质量控制采集标本前病人的准备；正确的标本采集方法；准确及时的运送标本；实验前正确地处理和保存标本。

实验中质量控制质控品的准备；试剂的评价选择仪器的校准开展Levey-Jennings质控图质控（或“即刻法”质控）。

实验后质量控制实验后准确填写检验结果；及时发出报告；正确地解释检验结果的临床意义文件管理,实验前质量控制,特别注意运输温度：

室温运输时间：

双平台6小时，单平台24小时样品处理：

专人，及时，规范。

实验中质量控制,质控品：

质量和价格，长期使用试剂选择：

不推荐混用不同厂家的试剂仪器校准：

厂家定期，实验室质控图：

每天要做,淋巴细胞免疫分型的质控品,室间质评室内质控,我国,全国CD4+T淋巴细胞检测实验室能力验证,TruCOUNTcontrols对整个绝对计数过程的质控，结果超出标准值的时候，提示吸样过程、绝对计数珠、仪器等出现问题。

流式细胞术检测的质控图,试剂选择,不同厂家的试剂在抗原决定族的特异性（F/P和蛋白纯度）是不同的,不建议使用组合不同厂家的试剂.,仪器校准校准,移液器校准：

流式细胞仪校准：

移液器校准,时间：

一年至少应该标定或校准二次方法：

吸取有色溶液进行光谱分析、*吸取蒸馏水称量校准、吸取放射性同位素计数校准使用配套校准盒等等。

设备维修与校准,*吸取蒸馏水称量,仪器参数可以由FACSComp和CaliBRITETM微球,仪器调控软件自动设置.,FACSCalibur校准,流式细胞术检测的质控图,流式细胞术检测的质控图,实验后质量控制,实验者填写报告负责人审阅报告结果报告备案正确解释结果操作者的技术,实验后质量控制,保留所有原始、最终、和修正后报告定期做计算机备份定期抽检检验申请和结果报告定期考核检测人员能力,实验后质量控制,培训提高人员能力实验人员应该具有HIV以及AIDS的相关知识。

要定期培训提高专业能力。

实验室管理人员对实验室检验人员定期作出评价，包括工作的准确性、工作效率、操作的安全性和职业道德不建议经常更换操作人员。

实验后质量控制,实验记录和文件管理记录详细如：

记录实验室温度、试剂厂名称和批号。

详细的记录是分析、统计、总结的基础。

文件和试验记录存档时间：

一般35年保存：

按一定方式编号，建立借阅制度，专人保管完整资料将为科研和法律诉讼提供可靠的证据。

CD4T细胞检测文件和文件管理,

（1）标准操作程序文件（SOP）

（2）实验原始记录表（3）CD4T细胞检测程序（4）填写检测结果表（5）标本的登记记录除按照HIV检测规范要求外，CD4T淋巴细胞检测要记录采血时间和使用抗凝剂的名称，运输温度等。

CD4T细胞检测文件和文件管理,（6）建立实验室安全措施参见规范（7）文件存档原始记录，热敏打印结果不易保留，可复印一份保留。

计算机保留仪器设备维修和校准记录重要记录都应该妥善存档保存15年以上。

CD4绝对数产生误差的可能性13%（CD4200/ul血球记数仪WBC变异系数（CV）9.3%-17.6）.自动记数淋巴细胞CV1.9%-5.3%正常样品CD4+T细胞百分比率和绝对值5.1%7.0%,流式细胞术检测CD4和CD8T细胞的经验,流式细胞仪维护日常维护、月维护异常细胞群体分析染料量,CD4+T细胞实验室检测技术,培训目的掌握应用流式细胞仪进行CD4+T细胞检测的原理、操作及结果分析。

掌握应用流式细胞仪进行CD4+T细胞检测的生物安全保障措施。

掌握应用流式细胞仪进行CD4+T细胞检测的质量保障措施。

熟悉流式细胞仪的仪器校准。

培训应用仪器,FACSCount,FACSCalibur,谢谢！