Neuro2a细胞替代神经元原代培养进行神经轴突测量实验研究.docx
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Neuro2a细胞替代神经元原代培养进行神经轴突测量实验研究
Neuro-2a细胞替代神经元原代培养进行神经轴突测量实验研究
马志奎;赵炜疆
【摘要】目的建立使用小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞替代原代培养神经元进行神经轴突测量的方法,用于神经损伤研究.方法使用浓度200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L过氧化氢处理Neuro-2a细胞12h,戊二醛固定,生物染色,在光学显微镜下手动测量突起长度.结果过氧化氢可剂量依赖性引起神经突起逐渐回缩变短,1000μmol/L过氧化氢处理组光镜下见不到明显突起,突起测量数据显示,过氧化氢处理后突起长度与未经处理细胞有显著差异.结论Neuro-2a细胞在一定程度上可替代原代培养神经元进行轴突测量研究,该测量方法可用于神经轴突再生研究.
【期刊名称】《中国实用神经疾病杂志》
【年（卷）,期】2012（015）010
【总页数】3页（P4-6）
【关键词】Neuro-2a;轴突测量;过氧化氢
【作者】马志奎;赵炜疆
【作者单位】汕头大学医学院神经科学中心,汕头515041;汕头大学医学院神经科学中心,汕头515041
【正文语种】中文
【中图分类】医药卫生
4•中国实用神经疾病杂志2012年5月第15卷第10期ChineseJournalofPracticalNervousDiseasesMay2012,V。
l.15No.10Neurσ2a细胞替代神经元原代培养进行神经轴突测量实验研究马志奎赵炜疆A汕头大学医学院神经科学中心汕头515041E摘要】目的建立使用小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞替代原代培养神经元进行神经轴突测量的方法，用于神经损伤研究。
方法使用浓度200µmol/L、500µmol/L、1000µmol/L过氧化氢处理Neur『2a细胞12h，戊二酸固定，生物染色，在光学显微镜下子动测量突起长度。
结果过氧化氢可剂量依赖性引起神经突起逐渐回缩变短，I000µmol/L过氧化氢处理组光镜下见不到明显突起，突起测量数据显示，过氧化氢处理后突起长度与未经处理细胞有显著差异。
结论Neuro-2a细胞在一定程度上可替代原代培养神经元进行轴突测量研究，该测量方法可用于神经轴突再生研究。
E关键词】Neuro2a；轴突测量；过氧化氢E中图分类号】R332【文献标识码】AE文章编号】1673-5110（2012）10-0004-03Neuro-2acellsasasubstituteforprimaryneuroncultureinneuritemeasurementMaZhikui,ZhαoWe11zang.NeuroscienceCenter,MedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou515041,CuaηgdongProvince,China[Abstract>ObjectiveToinvestigatetheutilizationofmouseneuroblastomaNeuro-2acellsasasubstituteforprimaryneuroncultureinneuritemeasurementanditsapplicationinneuronalinjuryinvitro.MethodsHydrogenperoxide（H,02）at200µmol/L,500µmol/Land1000µmol/LwereadministeredtoNeuro-2acellsfor12hours.Cellswerefixedwithglutaraldehydeandstainedforthelengthmeasurementofneuritesmanuallyunderthelightmicroscope.ResultsAdministrationofhydrogenperoxidecandosedependentlyresultintheshringkageofneurites,andneuriteswereunmeasurableincellstreatedwithH,02at1000µmol/L.OurdatademonstratedasignificantdifferenceinneuritelengthsbetweenH,02treatedcellsandthoseun treated.Conch且sionNeurcγ2acellscanbeusedasapartialsubstituteforprimaryneuroncultureinneuritemeasurementandappliedinvitroneuronalinjurystudy.[Keywords]Neuro-2a;Neuritemeasurement;Hydrogenperoxide（H,02）神经元在发育过程中，延伸出神经突起，逐渐形成可识别的具有一定功能的轴突，最终与其他神经元形成突触，因此神经轴突或突起测量是神经再生研究中的重要实验方法和评价指标。
·3），体外实验通常采用海马或皮层神经元原代培养进行测量，对实验技术要求较高，本研究应用神经母细胞瘤Neuro2a细胞替代原代培养神经元进行突起测量，为神经再生研究中轴突测量提供有益参考。
1材料与方法1.1细胞系及主要试剂神经母细胞瘤Neura-2a购自中国科学院细胞库（CTCC，上海），DMEM低糖培养基CHyClone，北京）、胎牛血清（四季青，杭州）、青链霉素（碧云天，江苏）、甲苯胶蓝（toluidineblue,AMRESCO）、甲基蓝（meth yleneblue，索来宝，北京）、多聚赖氨酸（PDL，碧云天，江苏）、30%过氧化氢CH,02按9.79mol/L计算，西陇，汕头），其他常用试剂均为国产分析纯。
1.2Neura2a细胞培养和接种Neuro-2a细胞37℃，5%co，条件下培养于含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基中，为单层贴壁形态。
取15代以内细胞，待细胞密度达到培养皿70%～80%面积时收集细胞，以1000基金项目：
国家自然科学基金（81171138）资助A通讯作者·赵炜疆，男，副研究员，E-mail:
neuromancn@yahoo.co肌en个细胞／孔接种到预先包被0.01%POL的96孔培养板中，每孔100µL培养基（同上），培养24h后，换成无血清DMEM培养基继续培养，再培养36h后，换新无血清DMEM培养基，同时分别加入200µmol/L、500µmol/L、1000µmol/1，过氧化氢处理12h,1.3细胞固定和染色各孔加入25%戊二醒水溶液，使戊二醒终浓度为2.5%，室温固定30～90min，去离子水洗3～4次。
加入染色液（］%甲苯胶蓝和1%甲基:
ii溶于1%四砌酸纳，0.45µm滤膜过滤），室温染色1h，去离子水洗3～4次，室温晾干。
1.4图像采集和突起测量相差显微镜（OlympusIX51）采集图像，每实验组各取50个独立细胞（突起不与其他细胞接触），应用lmageProPlus软件测量，以突起长度大于细胞胞体直径为选择测量标准。
1.5统计学方法采用统计学软件SPSS17.O对数据进行处理，应用独立样本t检验进行分析，结果以均数士标准差ex士。
表示，P《0.05为差异有统计学意义。
2结果2.1过氧化氢对Neuro-2a细胞突起生长的影晌Neuro-2a细胞在血清饥饿条件下发出突起，48h后突起平均长度（83.34士5.28）µm（图lA，图2），应用较低浓度过氧化氢处理后（200µmol/L），细胞突起回缩变短，平均长度（64.11±4•中国实用神经疾病杂志2012年5月第15卷第10期ChineseJournalofPracticalNervousDiseasesMay2012,V。
l.15No.10伤研究。
方法使用浓度200µmol/L、500µmol/L、1000µmol/L过氧化氢处理Neur『2a细胞12h，戊二酸固定，生物染色，在光学显微镜下子动测量突起长度。
结果过氧化氢可剂量依赖性引起神经突起逐渐回缩变短，I000µmol/L过氧化氢处理组光镜下见不到明显突起，突起测量数据显示，过氧化氢处理后突起长度与未经处理细胞有显著差异。
结论Neuro-2a细胞在一定程度上可替代原代培养神经元进行轴突测量研究，该测量方法可用于神经轴突再生研究。
E关键词】Neuro2a；轴突测量；过氧化氢中图分类号】R文章编号】1673-5110（2012）10-0004-03Neuro-2acellsasasubstituteforprimaryneuroncultureinneuritemeasurementMaZhikui,ZhαoWe11zang.NeuroscienceCenter,MedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou515041,CuaηgdongProvince,China[Abstract>ObjectiveToinvestigatetheutilizationofmouseneuroblastomaNeuro-2acellsasasubstituteforprimaryneuroncultureinneuritemeasurementanditsapplicationinneuronalinjuryinvitro.MethodsHydrogenperoxide（H,02）at200µmol/L,l/Land1000µmol/LwereadministeredtoNeuro-2acellsfor12hours.Cellswerefixedwithglutaraldehydeandstainedforthelengthmeasurementofneuritesmanuallyunderthelightmicroscope.ResultsAdministrationofhydrogenperoxidecandosedependentlyresultintheshringkageofneurites,andneuriteswereunmeasurableincellstreatedwithH,02at1000µmol/L.OurdatademonstratedasignificantdifferenceinneuritelengthsbetweenH,02treatedcellsandthoseun treated.Conch且sionNeurcγ2acellscanbeusedasapartialsubstituteforprimaryneuroncultureinneuritemeasurementandappliedinvitroneuronalinjurystudy.[Keywords]Neuro-2a;Neuritemeasurement;Hydrogenperoxide（H,02）神经元在发育过程中，延伸出神经突起，逐渐形成可识别的具有一定功能的轴突，最终与其他神经元形成突触，因此神经轴突或突起测量是神经再生研究中的重要实验方法和评价指标。
·3），体外实验通常采用海马或皮层神经元原代培养进行测量，对实验技术要求较高，本研究应用神经母细胞瘤1材料与方法1.1细胞系及主要试剂神经母细胞瘤Neura-2a购自中国科学院细胞库（CTCC，上海），DMEM低糖培养基CHyClone，北京）、胎牛血清（四季青，杭州）、青链霉素（碧云天，江苏）、甲苯胶蓝（toluidineblue,AMRESCO）、甲基蓝（meth yleneblue，索来宝，北京）、多聚赖氨酸（PDL，碧云天，江苏）、30过氧化氢CH,02按9.79mol/L计算，西陇，汕头），其他Neura2a细胞培养和接种Neuro-2a细胞37℃，5%条件下培养于含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基中，为单层贴壁形态。
取15代以内细胞，待细胞密度达到培养皿70%～80%面积时收集细胞，以1000每孔100µL培养基（同上），培养24h后，换成无血清DMEM培养基继续培养，再培养36h后，换新无血清DMEM培养基，同时分别加入200µmol/L、500µmol/L、1000µmol/1，过氧化氢处理12h,细胞固定和染色各孔加入25%戊二醒水溶液，使戊二醒终浓度为2.5%，室温固定30～90min，去离子水洗3～4次。
加入染色液（］%甲苯胶蓝和1%甲基:
ii溶于1%四砌酸纳，0.45µm滤膜过滤），室温染色1h，去离子水洗3～4次，室温晾干。
1.4图像采集和突起测量相差显微镜（OlympusIX51）采集图像，每实验组各取50个独立细胞（突起不与其他细胞接触），应用lmageProPlus软件测量，以突起长度大于细胞胞体直径为选择测量标准。
1.5统计学方法采用统计学软件SPSS17.O对数据进行2结果2.1过氧化氢对Neuro-2a细胞突起生长的影晌Neuro-2a细胞在血清饥饿条件下发出突起，48h后突起平均长度（83.34士5.28）µm（图lA，图2），应用较低浓度过氧化氢处理后（200µmol/L），细胞突起回缩变短，平均长度（64.11±中国实用神经疾病杂志2012年5月第15卷第10期ChineseJournalofPracticalNervousDiseasesMay2012,Vol.15No.10•54.14）µm，与对照组相比有明显差异＜P<0.01）（图1日，图2）；较高浓度时（500µmol/L），细胞数量减少，突起平均长度（55.63土2.87）µm，与对照组相比差异有统计学意义＜P图l经过氧化氢处理的Neuro-2a细胞固定染色后形态观察（×200）A，未处理品，200µmol/LH,O,;C,500µmol/LH202;D,1000µmol/LH,02’00．。
舶崎回－E嘈sgJ屈居耐昆主届萄MFH由副2田’因测量功能，沿细胞边缘突起起点向末端准确描绘出整个突起，软件自动标出数值，见图3.3讨论神经元轴突长短及形态变化是神经元对生理病理性刺激以及药物干预作出反应的重要检测指标，轴突测量广泛用于早老性痴呆、帕金森病以及运动神经元疾病的体内和体外实验研究“”。
同时，轴突生长作为标志性评价手段在神经再生研究中有重要意义［叫。
使用原代培养神经元观察轴突生长变化时，由于原代培养神经元中易混入少量星形胶质细胞及其他神经元，仅能通过肉眼加以区分和鉴别，不可避免造成测量误差，影响对实验结果的判断。
使用不同种类神经细胞标志物抗体进行免疫荧光染色，虽可区分神经元与其他细胞，但影响对神经突起细节的测量。
Neuro2a细胞是Klebe和Ruddle由A型白化小鼠的自发肿瘤中建立，早期多用于微管蛋白的相关研究［川，具有神经干细胞的特征，且细胞系成分均一，无其他来源、的神经细胞污染［12］，故本研究中我们探索使用Neuro-2a细胞作为模式细胞进行轴突测量，从而明确其在相关神经系统疾病体外研究中的应用。
过氧化氢常作为氧化剂应用到氧化应激损伤研究中［13），已有报道用过氧化氢处理原代培养神经元，如鼠海马神经元、小脑颗粒神经元以及皮层神经元，可引起细胞不同程度损伤，这种损伤具有浓度和时间依赖性，直至神经元死亡［14-15］。
同样，许多研究报道过氧化氢也可对Neuro-2a细胞造成类似损伤［16·18）。
本研究以200µmol/L,500µmol/L,l000µmol/L过氧化氢浓度对Neuro-2a细胞突起的影响为例展示神经突起的测量方法，结果显示，随着过氧化氢浓度的升高，细胞数量减少，突起生长受到抑制，至l000µmol/L时，光镜下看不到明显突起，与以往研究报道吻合［17·18），且与原代培养神经元相比，Neuro-2a细胞对过氧化氢的耐受较4组比植处理挥阳”唰儿？
强［1•115）。
图2过氧化氢对Neuro2a细胞突起生长的影晌（11=50;''P<0.01;'••P<0.001）图3突起测量方法（×200拍照后"11:
I.大）2.2突起测量方法进行突起测量时，将采集图像（×200）放大至适宜人眼测量程度，利用lmageProPlus软件的跟踪尽管如此，该细胞系来源于小鼠神经母细胞瘤．不能代表其他脑组织神经元的全部特征，因此有必要根据自己的实验目的和需要进行选择。
肿瘤细胞对损伤剌激的耐受强于原代培养细胞，在结果解释时需要加以考虑［叫。
总之，使用神经母细胞瘤Neuro-2a细胞替代神经元原代培养进行神经再生轴突测量具有可操作性强、结果均一的特点，可作为某些实验的前瞻性研究或替代神经元原代培养加以应用。
4参考文献[l]FournierAE,TakizawaBT,StrittmatterSM.Rhokinasein hibitionenhancesax。
nalregenerationintheinjuredCNS[J].JNeurosci,2003.23（4）,1416-1423.[2]LehmannM’F。
urnierA.Selles-Navarr。
I,etal.Inacuvau。
。
fRh。
signalingpathwaypr。
m。
resCNSax。
nregenerat阳，［J].JNeur。
sci,1999.19（17）,7537-7547.[3]NgWP,CartelN.RoderJ,etal.Humancentralnervoussys ternmyelininhibitsneuriteoutgrowth[J].BrainRes,1996,720（1-2）:
17-24.中国实用神经疾病杂志2012年5月第15卷第10期ChineseJournalofPracticalNervousDiseasesMay2012,Vol.15No.10•5）；较高浓度时（500µmol/L），细胞数量减少，突起平均长度（55.63土2.87）µm，与对照组相比差异有统计学意义＜P舶崎回－嘈sgJ屈居耐昆主届萄MFH由副3讨论神经元轴突长短及形态变化是神经元对生理病理性刺激以及药物干预作出反应的重要检测指标，轴突测量广泛用于早老性痴呆、帕金森病以及运动神经元疾病的体内和体外实验研究“”。
同时，轴突生长作为标志性评价手段在神经再生研究中有重要意义［叫。
使用原代培养神经元观察轴突生长变化时，由于原代培养神经元中易混入少量星形胶质细胞及其他神经元，仅能通过肉眼加以区分和鉴别，不可避免造成测量误差，影响对实验结果的判断。
使用不同种类神经细胞标志物抗体进行免疫荧光染色，虽可区分神经元与其他细胞，但影响对神经突起细节的测量。
Neuro2a细胞是Klebe和Ruddle由A型白化小鼠的自发肿瘤中建立，早期多用于微管蛋白的相关研究［川，具有神经干细胞的特征，且细胞系成分均一，无其他来源、的神经细胞污染［12］，故本研究中我们探索使用Neuro-2a细胞作为模式细胞进行轴突测量，从而明确其在相关神经系统疾病体外研究中的应用。
中［13），已有报道用过氧化氢处理原代培养神经元，如鼠海马神经元、小脑颗粒神经元以及皮层神经元，可引起细胞不同程度损伤，这种损伤具有浓度和时间依赖性，直至神经元死亡［14-15］。
同样，许多研究报道过氧化氢也可对Neuro-2a细胞造成类似损伤［16·18）。
本研究以200µmol/L,500µmol/L,l000µmol/L过氧化氢浓度对Neuro-2a细胞突起的影响为例展示神经突起的测量方法，结果显示，随着过氧化氢浓度的升高，细胞数量减少，突起生长受到抑制，至l000µmol/L时，光镜下看不到明显突起，与以往研究报道吻合［17·18），且与原代培养神经元相比，Neuro-2a细胞对过氧化氢的耐受较4组比植处理挥阳”唰儿？
过氧化氢对Neuro2a细胞突起3突起测量方法（×200拍照后"11:
I.大）突起测量方法进行突起测量时，将采集图像（×200）放大至适宜人眼测量程度，利用lmageProPlus软件的跟踪尽管如此，该细胞系来源于小鼠神经母细胞瘤．不能代表其他脑组织神经元的全部特征，因此有必要根据自己的实验目的和需要进行选择。
肿瘤细胞对损伤剌激的耐受强于原代培养细胞，在结果解释时需要加以考虑［叫。
总之，使用神经母细胞瘤Neuro-2a细胞替代神经元原代培养进行神经再生轴突测量具有可操作性强、结果均一的特点，可作为某些实验的前瞻性研究或替代神经元原代培养加以应用。
参考文献[l]FournierAE,TakizawaBT,StrittmatterSM.Rhokinasein hibitionenhancesax。
nalregenerationintheinjuredCNS[J].JNeurosci,2003.23（4）,1416-1423.。
fRh。
signalingpathwaypr。
m。
resCNSax。
nregenerat阳，［J].Neur。
sci,1999.19（17）,7537-7547.[3]NgWP,CartelN.RoderJ,etal.Humancentralnervoussys ernmyelininhibitsneuriteoutgrowth[J].BrainRes,1996,720•6•中国实用神经疾病杂志2012年5月第15卷第10期ChineseJ。
urnalofPracticalNervousDiseasesMay2012,Vol.15No.10[
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