食品安全检测第二章样品前处理技术Word下载.docx

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3、微波萃取；

4、液－液萃取；

5、加速溶剂萃取；

6、超临界萃取

1、萃取技术————超声萃取

超声萃取（SAE）就是在溶剂萃取过程中引入超声波，提高溶剂萃取的过程。

基本原理：

空化效应、热效应、机械作用。

高频声波空化作用产生的极大压力造成生物细胞及整个生物体破碎，同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解。

影响SAE的因素：

超声波的强度、频率、提取时间、提取溶剂等。

􀁺

SAE的操作方法:

将样品和溶剂放于密闭的容器中，置于一定能量的超声波水浴中,数秒后拿出，再放入、拿出

2、萃取技术———-微波萃取

微波萃取（MAE）就是在溶剂萃取过程中引入微波，加速溶剂萃取的过程。

（1）微波辐射能穿透萃取介质到达物料内部，物料吸收微波能，内部温度迅速上升，细胞内部压力增大而破裂；

（2）微波所产生的电磁场，加速被萃取成分向萃取溶剂界面的扩散速率。

微薄萃取工艺流程：

微波萃取的设备:

微波萃取罐、连续微波萃取线.

微波提取成套生产线工艺组成流程：

粉碎、预处理、微波提取、料液分离、浓缩系统等五个环节.

MAE的影响因素:

萃取溶剂、萃取温度、时间、溶剂体积、试样中的水分或湿度、基体物质等。

微波提取优点:

①微波辅助提取是里外同时加热.没有高温热源，消除了热梯度,有效地保护功能成分；

②由于微波可以穿透式加热,提取的时间大大节省;

③微波能有超常的提取能力，大大简化工艺流程。

④微波提取没有热惯性易控制，所有参数均可数据化；

⑤微波提取物纯度高，可水提、醇提、油提；

⑥溶剂用量少（可较常规方法少50％～90％）；

⑦微波设备是用电设备，不需配备锅炉，无污染、安全、属于绿色工程;

⑧生产线组成简单，节省投资。

3、萃取技术————加速溶剂萃取

加速溶剂萃取（ASE）就是采用常规溶剂在高温高压条件下进行自动萃取的技术.

基本原理：

（1）提高温度（50～200℃）能加速溶质分子的解析动力学过程，减小解析过程的活化能；

降低溶剂的粘度，减小溶剂进入样品基体的阻力；

增加溶剂进入样品基体的扩散；

降低溶剂和基体样品的表面张力，有利于萃取物与溶剂的接触。

（2）升高压力（10。

3～20.6MPa）使溶剂的沸点升高；

可保证易挥发性物质不挥发；

在压力下可快速充满萃取池。

4、萃取技术————超临界流体萃取

超临界流体萃取（SPE）是以超临界流体作为萃取剂，把所需要的组分从复杂的样品中提取出来的一种分离技术.

超临界流体性质:

超临界流体的物理性质介于气体与液体之间.

超临界CO2的特点：

1、在超临界状态下，流体具有气液两相的双重特点；

2、密度对温度和压力的变化十分敏感;

3、来源广，价格低廉；

4、不燃烧、不助燃、操作安全;

无毒、易挥发、操作后残留物少；

5、对设备无腐蚀；

临界温度低。

超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行.

在萃取的过程中，超临界流体具有很好的流动性和渗透性，将超临界流体与待分离的物质充分接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小不同的成分依次萃取出来；

然后通过改变温度或压力使超临界流体变成普通气体,被萃取物质析出，从而达到分离提纯的目的。

超临界萃取条件的选择:

原料前处理（粒度、水分含量等）;

萃取压力；

萃取温度;

流体的流量；

改性剂；

萃取时间；

分离条件（温度和压力）等.

超临界萃取的特点：

①萃取和分离合二为一，不存在物料的相变过程，不需回收溶剂，操作方便，萃取效率高，而且能耗较少,节约成本；

②压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数，因此工艺流程短、耗时少；

③超临界流体的极性可以改变，一定温度条件下,只要改变压力或加入适宜的夹带剂即可提取不同极性的物质，可选择范围广；

④SFE全过程不用有机溶剂，萃取物绝无残留溶剂,无污染；

CO2容易取得,且在生产过程中循环使用，真正实现生产过程绿色化,降低生产成本;

⑤萃取温度低,可以有效保留生物活性，而且能把高沸点,低挥发性、易热解的物质在其沸点温度以下萃取出来。

净化技术

1、液－液萃取；

2、固相萃取；

3、固相微萃取;

4、基质分散固相萃取；

5、柱层析（凝胶、离子交换、亲和、分配、吸附柱层析等）

1、净化技术—-——固相萃取

固相萃取（SPE）是在液－液萃取和液相色谱的基础上发展起来的一种的萃取技术。

利用高效高选择性的固体吸附剂（固定相）将液体样品中的目标化合物吸附，使其与样品的基体和干扰化合物分离,然后用合适的洗脱液（另一种体积较小的溶剂）进行洗脱或加热解吸，达到分离和富集目标化合物的目的。

固相萃取的实质就是一种液相色谱分离，是一个包括液相和固相的物理萃取过程。

分离模式也与液相色谱相同，分为正相、反相、离子交换等。

固相萃取的类型：

石墨碳（反相）—SPE、离子交换树脂—SPE、金属配合物吸附剂-SPE、键合硅胶-SPE、聚合物吸附剂—SPE、免疫亲和吸附剂-SPE、分子嵌入聚合物—SPE等。

操作步骤：

吸附剂的活化；

加样；

萃取；

淋洗;

洗脱

①吸附剂的活化:

在样品萃取之前要用适当的溶剂淋洗萃取柱，使吸附剂保持湿润;

②加样：

加入一定体积的被处理样品溶液,使其完全通过吸附剂；

③淋洗：

用溶剂强度较弱的溶剂选择性洗去部分杂质；

④洗脱：

用溶剂强度较强的溶剂洗脱被测物。

SPE的特点：

①可以获得高的回收率和高的富集倍数；

②减少了高纯有机溶剂的用量，减少了对环境的污染，同时减少了有机溶剂中的杂质对被测分析物的影响；

③无相分离操作，避免了乳化影响，易于收集分析物组分；

④操作简单、快速、易于实现自动化；

⑤但目标化合物的回收率和精密度低于液－液萃取。

2、净化技术————固相微萃取􀁺

固相微萃取（SPEM）是在固相萃取基础上发展起来的新型萃取分离技术,是一种基于液－固吸附平衡的样品富集方法，属于非溶剂型选择性萃取。

利用待测物在样品基质与萃取相之间的非均相平衡。

将聚合物涂层纤维浸润在水相萃取物中，或保留在样品顶空使待测组分扩散吸附到石英纤维表面的固定相涂层（顶空固相微萃取），待吸附平衡后，涂层纤维/进样头立即转移到GC或HPLC的进样口。

SPME的萃取模式主要有三种:

1、直接法，即将涂层纤维保留在样品中，主要用于半挥发性的气体液体样品萃取；

2、顶空法，即将涂层纤维放置在样品顶空中，主要用于挥发性固体或废水水样萃取;

3、膜方法，将涂层纤维放在经过微波萃取及膜处理过的样品中，主要用于难挥发性复杂样品的萃取。

样品萃取：

①将SPME针管穿透样品瓶隔垫，插入瓶中；

②推手柄杆使纤维头伸出针管，纤维头可以浸入水溶液中（浸入方式）或置于样品上部空间（顶空方式），萃取时间大约2-30min；

③缩回纤维头，然后将针管退出样品瓶。

GC分析：

①将SPME针管插入GC仪进样口;

②推手柄杆,伸出纤维头,热脱附样品进色谱柱；

③缩回纤维头,移去针管。

HPLC分析：

将SPME针管插入SPME/HPLC接口解吸池，进样阀置于“Load”位置;

推手柄杆伸出纤维头，关闭阀密封夹；

将阀置于“Inject”位置，流动相通过解吸池洗脱样品进样;

阀重新置于“Load”位置,缩回纤维头，移走SPME针管。

影响SPEM的因素：

涂膜纤维性能、萃取时间、离子强度、解吸附时间和温度等.􀁺

SPEM的特点：

集采集、浓缩于一体,简单方便,不造成二次污染.与液－液萃取或固相萃取相比，具有操作时间短、样品量少、无需萃取溶剂、适于分析挥发性和非挥发性物质、重现性好等优点。

免疫检测技术

免疫检测技术是以抗原抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析检测技术。

在此基础上结合一些生化或物理方法作为信号显示或放大系统即可建立免疫测定法。

即抗原可以特异性地与抗体结合，通过抗原－抗体的特异性识别反应来进行检测。

抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质，抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。

在免疫测定中，抗原是能与抗体结合的物质，能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白。

抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白（Ig），与免疫测定有关的主要为IgG和IgM.

抗原与抗体间的反应是依靠局部的分子间作用力结合的.主要有四种:

氢键、范德华力、静电和疏水相互作用.抗原抗体结合反应具有高度特异性、交叉反应和可逆性.抗原抗体结合的理化特性主要表现为由亲水胶体转化为疏水胶体。

一个成功的免疫学测定法必须具备的3个要素：

性能优良的抗体、灵敏而专一的标记物和高效的分离手段.

现有的免疫测定方法很多，按照不同的方法分类.经典的免疫测定法不需要标记物;

标记免疫测定法分为放射性标记测定法和非放射性标记测定法，按反应介质分为均相和非均相免疫测定法.经典免疫测定法在食品安全卫生分析上较少采用，而灵敏度高的非均相、非放射性标记免疫测定法种类繁多，发展较快、检测灵敏度高，使用范围广。

2、免疫学检测技术--酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验（ELISA）的基础是抗原与抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

基本原理:

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；

②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性；

③结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量.

材料和试剂：

完整的ELISA试剂盒包括：

已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）、酶标记的抗原或抗体（结合物）、酶催化的底物、阴性对照样品和阳性对照样品（定性检测）、参考标准品和控制血清（定量测定）、结合物及标本的稀释液、洗涤液和酶反应终止液。

类型：

双抗体夹心法测定抗原;

双抗原夹心法测抗体；

间接法测抗体;

竞争法测抗体；

竞争法测抗原。

3、免疫学检测技术——放射免疫测定法（RIA）

放射免疫测定法（RIA）是将放射性同位素检测的高度敏感性与免疫反应的高度选择性相结合的一种免疫标记检测技术。

RIA的基础是待测抗原和标记抗原对有限量抗体进行竞争性结合。

待测抗原是指人体内某种微量活性物质（如微生物和寄生虫抗原、激素、酶或药物等），标记抗原是将已知的上述物质标记上同位素（食品安全快速检测中最常用的是3H和14C），具有示踪作用。

这两种抗原具有共同的决定簇，都能与相应的抗体发生特异的结合。

将标记抗原（Ag＊）和未标记抗原（Ag）与特异性抗体（Ab）相混合，两者竞争与抗体结合结果形成标记的和未标记的抗原抗体复合物.

采用分离技术（如用活性炭）将Ag*-Ab、Ag-Ab复合物（B）和游的Ag、Ag＊（F）分离，测定B和F的放射活性,绘制B/F对Ag量的关系曲线。

测定时需先用一系列已知浓度的未标记抗原和一定量标记抗原及抗体相混合,然后测出标准浓度抗原参加下的标记抗原抗体复合物的放射结合率（B/F），绘出标准竞争抑制曲线.试验时,在相同条件下，根据待测抗原的放射性结合率，在标准曲线上即可查得相应的抗原含量.

4、免疫学检测技术——PCR

PCR又称聚合酶链式反应（PCR），即通常说的PCR体外扩增技术，又称无细胞克隆技术,是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法,该方法操作简便，可使微量的特定DNA片段在几小时内迅速扩增至几百万倍，目前已在分子生物学、生物医学等领域得到了广泛的应用.

依据DNA摸板的特性，模仿体内的复制过程，在体外合适的条件下以单链DNA为模板，以人工合成的寡核苷酸为引物,以四种脱氧核苷酸（dNTP）为底物，利用热稳定的聚合酶延５′－３′的方向掺入核苷酸来特异地扩增DNA片段.􀁺

PCR反应过程通常由20～40个循环组成，每个循环由高温变性—低温复性—适温延伸三个基本反应步骤构成:

①模板DNA的变性:

加热93～95℃,模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA变性，解离成单链，作为扩增的模板；

②模板DNA与引物的复性：

温度降至55℃左右，引物与单链DNA模板的互补序列特异性地结合

③引物的延伸：

在适宜的温度条件下，DNA模板——引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性--复性-—延伸三过程，DNA扩增量呈指数上升．最终的扩增量可用N＝N０（１＋E）n计算.理论上,单一拷贝基因经过40个循环,产物的拷贝数为1012.􀁺

注：

扩增遵循酶促反应动力学原理。

第三章农药残留量的检验

食品中农药残留的分类概

1、农药􀁺

农药：

是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成或者来源于生物、其他天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂.􀁺

按用途分：

杀（昆）虫剂、杀菌剂、除草剂、杀线虫剂、杀螨剂、杀鼠剂、落叶剂和植物生长调节剂等；

按化学组成分：

有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机氯、有机砷、有机汞等。

2、农药残留

农药残留：

是指农药使用后残存于生物体、食品（农副产品）和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。

当农药过量或长期施用，导致食物中农药残存数量超过最大残留限量（MRL）时，将对人和动物产生不良影响，或通过食物链对生态系统中其他生物造成毒害。

我国近年生产的高毒杀虫剂主要有甲胺磷、甲基对硫磷氧乐果、久效磷、对硫磷、甲拌磷等，因而，这些农药目前在农作物中残留最严重.

3、食品中农药残留的来源：

1、施用农药对农作物的直接污染；

2、农作物从污染的环境中吸收农药；

3、通过食物链污染食品；

4、其他来源：

粮库内使用熏蒸剂等对粮食造成的污染；

禽畜饲养场所及禽畜身上施用农药对动物性食品的污染；

粮食贮存加工、运输销售过程中容器、车船的混装；

事故性污染，用错农药品种和剂量，误食等。

传统的农药残留量分析技术的一般过程

常用的农药残留分析样品前处理技术􀂋

1、样品采集:

（以蔬菜农药残留量检测的样品采集为例）采集对象：

①蔬菜基地：

上市前的蔬菜②市场：

正在售卖的蔬菜检测部位：

大白菜、小白菜（去根、去外测菜叶）；

萝卜、胡萝卜（取叶、根）;

番茄、茄子等（去蒂）。

􀂋

2、提取方法：

萃取分离法、索氏抽提法、微波加热提取法、超声辅助提取法等（传统技术）.􀂋

3、净化方法：

液液分配法、吸附柱色谱法、磺化法、凝结沉淀法、冷冻法、薄层色谱法等。

4、浓缩方法：

自然挥发法、吹气法、真空旋转蒸发法。

农药残留分析样品前处理新技术：

固相萃取技术；

固相微萃取技术;

超临界流体萃取技术；

基质固相分散萃取技术;

凝胶渗透色谱技术;

免疫亲和色谱技术；

衍生化技术等

农药残留检验技术

概述：

目前我国农药残留检测方法主要有两大类:

农药残留色谱检测法和快速检测法。

色谱检测法是为农药残留执法提供依据。

农药残毒快速检测法主要是防止有机磷和氨基甲酸酯类农药残留要重超标的蔬菜和水果流入市场。

常用的色谱检验技术：

薄层色谱法、纸色谱、气相色谱、液相色谱法、GC—MS联用技术.

1、薄层色谱（TCL）：

半定量和定性检测技术.􀂋

TCL不需要特殊设备和试剂,方法简单、快速、直观、灵活，TCL除用特殊的显色剂观察斑点颜色和用Rf定性外，与其它技术联用，不仅可以定性，而且可以对样品中待分离的一种或多种成分进行定量分析。

但是灵敏度不高，多把它作为分离手段.可同时分析多个样品，多用于复杂混合物的分离和筛选。

2、气相色谱技术（GC）􀁺

残留的农药经有机溶剂提取并经净化、浓缩后，注入气相色谱仪、气化后在载气携带下于色谱柱中分离，并由检测器检测.􀁺

GC是应用最多的方法,占有关色谱法报道的70％以上.气相色谱法具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速等优点。

易气化，气化后又不发生分解等的农药均可采用GC检测。

用于GC的检测器主要有FID、ECD、NPD、TCD、FPD、MSD等.

3、高效液相色谱技术（HPLC）􀁺

HPLC可以分离检测极性强、分子量大及离子型农药，尤其对不易气化或受热易分解的化合物更能显示出它的突出优点.􀁺

常用的液相色谱柱有Ｃ8柱、Ｃ18柱、氨基柱、硅胶柱等，检测器有紫外检测器、荧光检测器等。

近年来，HPLC的检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程度现已成为农药残留检测不可缺少的重要技术，其缺点是溶剂消耗量大，检测器种类较GC少，灵敏度不如GC高。

4、气相色谱—质谱联用技术（GC-MS）􀁺

GC—MS是将气相色谱仪和质谱仪串联成为一个整机使用的检测技术。

它既具有气相色谱高分离效能，又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点,可达到同时定性定量的检测目的.用于农药和药物残留量检测工作，特别是应用于农药和药物代谢物、降解物的检测和多残留检测等具有突出的特点。

5、液相色谱－质谱联用技术（LC—MS）

LC-MS将气相色谱仪和质谱仪串联成为一个整机使用的检测技术。

LC-MS可以首先将混合物分离为单一组分，之后再用质谱检测器进行检测。

如此过程不仅可以得到更有意义的质谱数据，而且可以在一定程度上排除基质干扰，克服离子抑制现象，优化质谱检测信号。

液质联用系统是残留分析理想的检测手段。

对于需要高灵敏度、宽适用范围、复杂基质的多残留快速筛选工作而言,液质联用无疑是首选的最佳检测手段

农药残留量检验新技术：

超临界流体色谱;

毛细管电泳技术；

直接光谱技术（近红外光谱分析、荧光光谱分析）；

酶联免疫吸附试验技术；

酶抑制技术；

生物传感器技术；

实验室机器人

1、超临界流体色谱

超临界流体色谱（SCF）是以超临界流体为流动相的色谱分离检测技术.􀁺

特点:

超临界流体黏度小、传质阻力小、扩散速度快，其分离能力和速度可与GC相比;

其密度、溶解力和速度可与HPLC相比；

且超临界流体的物理、化学性质都是密度的函数。

超临界流体色谱仪的工作流程:

SFC的部件组成与HPLC很相似，包括流动相输送系统（泵、流量缓冲器和混合柱等）、色谱分离系统（进样器、色谱柱和柱温箱等）、检测系统（检测器等）和计算机软件。

SCF以超临界流体作为流动相,它的密度随压力增加而增加，而密度的增加引起流动相溶剂效率的提高，同时可缩短淋洗时间。

在SFC中采用程序升密度相对于GC中的程序升温和HPLC中的梯度洗脱，并且SFC可以与大部分GC和HPLC的检测器相连，许多在GC上需经过衍生化才能分析的农药，都可以用SFC直接测定.

2、毛细管电泳（CE）

毛细管电泳（CE）是以高压（可达30kV）下产生的强电场为驱动力，以小内径的石英毛细管（常用25～100μm）为分离通道，依据各组分之间电泳淌度或分配系数的差异实现分离。

CE是电泳技术与色谱技术的完美结合,分离速度快，分离效果好,仪器结构比较简单.􀁺

CE根据分离模式的不同，可分为毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦电泳、胶束电动毛细管色谱和毛细管电色谱。

农药残留快速检测技术

传统的农药残留量分析技术的优缺点：

农药残留快速检测方法

1、生化检测法（胆碱酯酶抑制法）：

速测卡、酶片、速测仪、生物传感器等

2、免疫分析法（抗体－抗原反应）：

ELISA试剂盒、免疫传感器等

3、活体生物测定法（发光细菌或敏感性家蝇）

速测卡法：

速测卡法（纸片法）是国家标准快速检验方法《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测》。

1、测定范围:

由酶抑制法测定蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检验方法,适用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速筛选测定。

2、原理：

3、试剂：

速测卡:

固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯的纸片；

pH7。

5缓冲溶液：

分别取15.0gNa2HPO4·

12H2O与1。

59gKH2PO4，用500mL蒸馏水溶解。

4、仪器：

常量天平；

有条件时配备37℃±

2℃恒温装置;

有条件时配备专为速测卡而设计的“农药残留速测仪”和超声波提取器.

5、分析步骤

（1）表面测定法（粗筛法）:

1）擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴缓冲溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。

2）取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上.放置10min进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中进行。

注:

预反应后的药片表面必须保持湿润。

3）将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min.4）每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡.（同时进行）

思考:

空白对照卡不变蓝的原因？

（2）整体测定法:

1）选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上。

2）取一片速测卡,用白色药片沾取提取液，放置10min进行预反应.注：

3）将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min。

4）每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。

思考：

蔬菜剪得太碎对试验结果有怎样的影响？

6、结果判定和表述：

检测结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制（阳性）和未抑制（阴性）来表示。

8、速测卡法检测注意事项

葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇等含有对酶有影响的植物次生物质的样品，应采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法；

对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。

当温度低于37℃时，酶反应的速度随之放慢,药片加液后放置反应的时间应相对延长。

延长时间的确定，以空白对照卡用手指捏3min时可以变蓝，且样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。

红色药片与白色药片叠合反应时间以3min为准。

速测卡对农药非常敏感，测定时如果附近喷洒农药或使用杀虫剂,以及操作者和器具沾有微量农药,都会造成对照和测定药片不变蓝。

酶抑制率法：

酶抑制率（分光光度法）是国家标准快速检验方法《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测》。

由酶抑制法测定蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检验方法，适用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速筛选测定。

3、试剂

pH8。

0缓冲溶液：

取11。

9mg无水磷酸氢二钾与3.2mg磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解。

显色剂：

取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，在4℃冰箱中保存。

底物：

取25。

0mg硫代乙酰胆碱加8。

0mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4℃冰箱中保存，保存期不超过一周.􀁺

乙酰胆碱酯酶：

根据酶的活性情况,用缓冲溶液溶解,但吸光度值应控制在0.3以上。

可选用以上试剂制备的试剂盒。