最新寄生虫病检测检验技术Word格式文档下载.docx
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（2）检查原虫活滋养体时，可在用生理盐水涂匀的粪膜附近滴一滴碘液，取少许粪便在碘液中涂匀，勿使两块粪膜相混合，盖上盖玻片，便可观察。
这样的涂片一半染色，检查包囊，另一半不染色，可以检查活滋养体。
试剂：
1、碘液染色液：
碘化钾4g
碘2g
蒸馏水100ml
先将碘化钾溶于少量水中，然后加碘溶解后，再加水到100ml。
2、碘伊红染色液
碘液：
碘化钾5g溶于生理盐水100ml，加碘至饱和。
伊红液：
伊红饱和于生理盐水中。
应用时将上述两液等量混合。
（1）碘易升华，放置数日变淡、均以原液瓶底有碘片沉集，每日取少量上清液使用为宜。
（2）碘液过浓，易使标本沉集成块且使原虫染色过深，而致构造不大明显，故在使用时，注意调节碘液量。
（3）碘、伊红染色时背景较深，不如使用碘液时背景清楚。
1．1．1．3快速染色法
快速染色法用于肠道原虫的快速诊断。
固定液的配制
丙酮50ml
冰醋酸50ml
甲醛溶液10ml
邵氏液890ml
以1.25g酚复红与0.5g耐绿混合于上述液中即可使用。
混合液应贮存于棕色玻璃瓶中，严密封口，二个月后染液仍稳定，染色结果不变。
（1）用棉签将粪便在玻片上涂成薄层。
（2）用滴管将混合液滴在粪涂片上，并将粪膜完全盖住，使之染色并固定。
（3）将载玻片在酒精灯上慢慢加热，待蒸汽出现后，即可缓慢地在火焰上经过2~3次。
（4）立即用自来水轻轻冲洗。
（5）分别依次放置于50%及70%酒精中，每次各需时30秒钟。
然后放在95%及纯酒精中，各15秒钟，最后置于二甲苯中透明1分钟。
（6）封固于香胶中，即能做镜检。
用此法染成的标本外观与苏木素染色法相同，呈蓝紫色，核的微细构造与拟染色体特别明显，所需时间仅2.5分钟，不需要特殊的技巧，而且保存液与固定液混合于染液中。
染色标本可保存两个月，染色的特征上都没有明显的改变。
1．1．1．4煌焦油蓝、伊红染色法：
此种染色法是一种活体湿片快速染色法，不影响阿米巴原虫的活力，着色不明，便于检出虫体和鉴定虫种。
试剂的配制
甲液：
煌焦油蓝0.2g
氯化钠6.35g
枸橼酸钠1.1g
饱和氯化钠溶液0.1ml
乙液
水溶性金红1.0g
用时将甲、乙两液等量混合。
操作方法：
（1）在干净的载玻片上加一滴生理盐水。
（2）用便签挑取少许粪便的粘液部分，与生理盐水混合，涂成适当的粪膜。
（3）加上述混合染色液一滴，混合之，覆置盖玻片。
（4）先用低倍镜找到，然后换高倍镜鉴定。
1．1．2浓集法：
用较多的粪便，将其中的虫卵或包囊集聚在一个小范围内，便于检出，其阳性率比直接涂片法高；
缺点是较直接涂片法复杂，时间也较长些。
浓集法又分为漂浮法和沉淀法。
1．1．2．1漂浮法
利用虫卵和包囊的比重小于液体比重的原理使线虫卵或包囊浮集于液面，以增加单位面积虫卵和包囊的含量，提高检查效果。
通常用的方法有饱和盐水漂浮法和硫酸锌离心浮聚法。
（1）饱和盐水漂浮法：
食盐40g
加热至沸，冷后取上清液使用。
如每95ml内加5ml40%甲醇溶液，可起固定的作用，有利于吸虫卵的上浮。
取0.5~1g的粪便放入漂浮瓶内（一般可用链霉素瓶代替）。
加入少量的饱和盐水（约为容器的1/3即可），用便签搅拌成均匀的混悬液。
再加入饱和盐水至漂浮瓶口，使液面略高于瓶口而未溢出为止。
在瓶口盖一载玻片，静置10~15min后，将载玻片迅速上提翻转，立即镜检。
注意事项
此法适用于线虫卵的检查，如果漂浮时间过长，可使虫卵及包囊变形，甚至下沉。
浮集于表面的杂质在放置载玻片前，要清除掉，否则影响检查结果。
（2）硫酸锌离心浮聚法
取1份粪便与10份温水调合成混合液。
取两层纱布过滤于离心管内。
用2000~2500r/min的离心速度离心1min，弃去上层液体，再加水少许，将沉淀物调和，再离心，反复2~3次，至水清为止。
弃去上清液，加入硫酸锌液（比重1.180即33%的溶液）少许调匀，再加入硫酸锌溶液，随加随调匀，使液面距管口约1cm即可。
再离心沉淀1min。
用白金耳取表面的液体于玻片上镜检。
1．1．2．2沉淀法
利用虫卵比重大于水的原理，使其下沉在水底。
缺点是对于比重略大于1的原虫包囊效果较差，检查费时较多。
沉淀法又分自然沉淀法和离心沉淀法。
（1）自然沉淀法
取20g左右的粪便放在烧杯内，加少许清水充分搅拌，再加入20倍的水，边加水边搅拌。
用二层纱布或60~80目的铜筛将其滤入500ml的三角量杯内。
再加满水，静置20~30分钟。
弃去上清液，重新加满清水，静置15~20分钟，如此反复数次，至上清液清晰为止。
弃去上清液，取沉渣镜检。
（2）离心沉淀法
用离心机离心，可加速虫卵下沉，缩短检查时间。
取黄豆粒大小的粪便一块，加入10倍的清水，搅拌成混悬液。
用二层纱布或60~80目的铜筛将其滤入离心管内。
以1500~2000r/min速度离心1~2min，弃去上清液，加入清水，调匀后再离心沉淀，至上清液清晰为止。
取沉渣镜检。
所取粪便必须充分搅匀。
离心机启动要逐渐加速，停止时要逐渐减速，避免因其骤起或骤停使离心管互相撞击而破碎或扬起沉淀物。
弃去上清液时动作要快，避免沉淀物随上清液流出。
（3）消化法
此法为目前检查肝吸虫卵常用的方法，检出率较高。
取10%氢氧化钠溶液5ml，置试管内。
取粪便1g放入试管内，充分搅拌，静置1h。
吸取管底沉渣，滴于载玻片上镜检。
（4）醋酸—醚浓集法
本法对虫卵浓集颇佳，醋酸能溶解碳酸盐类，消除粘液物质及使一部分脂肪水解，醚能溶解剩余的脂肪及渗透混悬物质，使其比重减轻而浮于液面易与虫卵分离。
取粪便1~2g放入试管内，加入5%醋酸溶液约10ml，以玻棒充分搅拌均匀。
用一层纱布过滤于离心管中，加入等量醚液，塞住管口，用力振摇1min。
离心数分钟，此时管内自上而下分为醚层，粪内粗大物质渣滓层，醋酸液层及沉淀层等四部分，虫卵在管底沉淀层内。
用毛细吸管取沉淀少许于载玻片上镜检。
醚层适用于隐血试验。
（5）汞碘醛沉淀法
本法同时有浓集，固定及染色的作用，对原虫的滋养体及包囊效果较好，也可用于集卵。
汞碘醛染色液
卢戈氏液（碘5g、碘经钾10g、蒸馏水100ml）1ml
甲醛1.5ml
硫柳汞酊7.5ml
用时将三种液体按上述比例配制卢戈氏液，超过一周后不宜再用。
用2层纱布过滤于离心管中，加乙醚4ml，加塞后用力振荡。
静置2min后，离心1min。
弃去上清液，取沉渣加盖玻片镜检。
1．1．3肛门外检查法
主要检查产于肛门附近的蛲虫卵和污染肛门附近的带绦虫卵，有时在肛门附近还可发现血吸虫卵，此外阿米巴患者遇有肛门溃疡时，亦可从溃疡处检查阿米巴原虫的滋养体。
因此肛门外检查法已不限于检查蛲虫卵。
此法分为棉拭子法和透明胶纸法。
1．1．3．1棉拭子法
1、操作方法
（1）取10cm长的棉签一根，用时先在生理盐水中稍加湿润。
再于受检者肛门周围皱襞上揩拭。
（2）然后将棉签置于试管内（也可用干净的青霉素小瓶），加饱和生理盐水至容器的1/3处，用力振荡棉签约半分钟，迅速将棉签提起，并将棉签在管壁上挤去盐水。
（3）加饱和盐水至试管口，盖以载玻片，漂浮5~10分钟后取下镜检。
或以1500r/min离心5min倾去上清液吸取沉渣镜检。
检查的时间最好是清晨刚起床的时候。
所用棉签刚刚湿润即可，切不可沾水过多，或带有悬滴。
1．1．3．2透明胶纸法
（1）取透明胶纸卷，剪成宽1~2cm，长3~5cm的胶纸条，贴于载玻片上备用。
（2）将有胶纸的一面贴于受检者肛门周围皱壁上。
（3）把粘有虫卵一面的胶纸放在载玻片上，滴生理盐水1~2滴，使胶纸平展，便可镜检，如加二甲苯后虫卵更为清晰。
1．2血液和骨髓的检查
血液检查法是诊断丝虫病，疟疾等最基本的方法，骨髓检查法是诊断黑热病较常用的方法。
1．2．1微丝蚴的检查
采血时间应在夜间十点钟以后至次晨2点以前，为微丝蚴在末梢血液内活动最多的时间，尤为患者睡后再唤醒效果更佳。
1．2．1．1新鲜血片法
（1）用75%酒精棉球消毒耳垂或手指。
（2）待干后用采血针刺破耳垂或手指，待血自然流出。
（3）接一大滴，放载玻片中央，盖一盖玻片。
（4）置低倍镜下观察，如有微丝蚴可呈蛇形蠕动，碰撞血球，使红血球摆动不停。
（1）采血时间最好是在夜间。
（2）采血量不宜过多，否则血球会将虫体遮盖，但又不宜过少，血量太少，又影响检出率。
1．2．1．2厚血片法
（1）取血时间仍在夜间采血为好。
（2）取血部位和方法同新鲜血片法。
（3）取血量为三大滴。
涂成均匀的厚血膜，约为2cm长，1.5cm宽的面积。
自然晾干，干后放蒸馏水中冲洗5min，将血红蛋白溶去，至血膜灰白色为止。
（4）干后，放甲醇或无水酒精中固定。
（5）水洗后，用已稀释的吉氏染液染色30min。
（6）用水冲洗后，再放入0.5~1%盐酸中数秒钟，使新染的片子更加显明。
（7）水洗，干后镜检。
（8）如做成永久染色标本，其法将染好的干片子，直接用加拿大树胶封片。
（1）所用的载玻片，要干净，无油渍。
（2）染色时间以染色液的浓度和温度而定，可常在显微镜下观察，调节染片时间长短及染片的效果。
（3）血片不宜涂得过厚，以免干燥时虫体破裂，且在溶血过程中血膜很易脱落。
（4）如不染色只能看出虫体，但不能鉴别种类。
（5）涂片制好后，要放安全地方，切勿使蝇类舐吸，也应防止灰尘落上。
（6）微丝蚴应与棉花纤维鉴别，棉花纤维长短皆不一致，且其中无体核。
1．2．1．3离心沉淀浓集法
（1）取静脉血2ml，立即放入盛有0.4ml3.8%的枸橼酸钠的离心管中。
（2）混合后加入8~10ml的水，按住管口，倒转数次，使红细胞溶解。
（3）红细胞溶解后，离心沉淀，以3000r/min，离心3~5min。
（4）倾去上清液，后加0.05mol/L氢氧化钠8~10ml。
（可溶去纤维蛋白），按住管口，用力振荡数次，放置5~10min。
（5）待纤维蛋白凝块迅速溶解再离心。
（6）用吸管吸去上清液，取全部沉渣镜检。
如需鉴定微丝蚴的种类，可进行染色，再镜检。
（1）离心后弃去上清液，最好用细管吸出，以免将沉渣倒出。
（2）振荡后放置时间可稍长，使虫体全部沉淀下来。
此法优于厚血片法的是微丝蚴比较集中，沉渣少，涂片干净，染色良好，适于鉴别虫种。
1．2．1．4微丝蚴白天诱出法：
诱出微丝蚴：
白天口服海群生50~100mg，可诱出马来微丝蚴，服药后5min末稍血液中即出现微丝蚴，15~30min达高峰，采血、涂厚血片、固定、染色、镜检。
1．2．1．5微丝蚴计数法：
操作
（1）用血红蛋白吸管，吸血20ul，涂成厚血膜。
（2）干后，溶去血红蛋白，染色。
（3）以显微镜计算全血片微丝蚴，并报告微丝蚴XX数/20ul。
1．2．2疟原虫检查法
1．2．2．1厚薄血片法
（1）取一洁净无油脂的载玻片，再另取一张做推片用的完整无损的载玻片。
（2）取血：
先用75%酒精棉球消毒耳垂或无名指的指尖，待干后用刺血针针刺出血。
（3）用载玻片靠近耳垂或手指待自然流出一滴于载玻片的2/3处。
（4）取推片将其一端的边缘接触血滴。
（5）以45°
角与前一载玻片上的血滴相接触，待血液沿边缘展开后立即向左边轻轻迅速推成一薄血膜。
（6）薄血膜制成后，立即再挤耳垂，取血2~3滴在此载玻片的1/3处，将血涂成约1cm的厚血膜。
用余下的边缘写上标号如姓名、年、月、日等。
（7）制成后，将玻片平放，待干后固定染色。
（8）将自然晾干的薄血膜，用甲醇或纯酒精固定1~2分钟。
注意甲醇不能碰上厚血膜处，以免血红蛋白被固定。
（9）可将血片放入（37℃）温箱中，则可缩短在室温的时间，约1h许，即可干透。
（10）将厚血膜用蒸馏水溶去血红蛋白晾干。
待染。
（11）加已稀释好的吉氏染液（20份PH7.2~7.4的缓冲液加1份吉氏染液），滴于已固定好的厚薄血膜上染30min，或加瑞氏染液1min，再加蒸馏水，混匀，染3~5min。
（12）水洗、干燥，镜检。
（1）取好在病人寒战发作前取血检查，阳性率高。
（2）不同种类和不同时期的疟原虫，对临床选择药物治疗有关，故检出后要分类、分期、做出报告。
（3）在染色过程中不要将片子都放在一个染色缸内，以免片子之间相互污染。
（4）冲洗时防止流水直接冲血膜，以免血膜脱落，其时间不宜过长，否则可使环状滋养体的细胞质和茂氏小点洗掉而看不清楚。
（5）如果血片上有瑞氏染剂沾污时可将95%酒精或纯酒精于血膜上，回转几次，使稍脱色。
约15min，但要掌握好时间，即不能过长也不能太短。
（6）最好先做几张试染的片子，当把染液的稀释度调好，时间掌握好，方可进行大批的染色工作。
（7）若血膜染得偏碱性（红细胞着紫色）可将血片浸于生理盐水中校正数分钟。
（8）血膜用久退色，需复染时，可放入稀释好的吉氏染液染2~6h，再浸于1%硼酸溶液中褪色，然后用中性蒸馏水冲洗。
亦可先用甲醇或1%硼酸溶液把归血片褪色数分钟，用中性蒸馏水冲洗，干后用已稀释之吉氏染液如常染色。
1．2．2．2血液浓集涂片法
（1）取用草酸钾与草酸铵混合抗凝剂抗凝血液移入红细胞比测定管内。
（2）以2000r/min离心10min。
（3）吸去血浆后，吸取白细胞层下的上层红细胞作涂片
（4）染色镜检。
可提高疟原虫的检出率。
1．2．2．3皂素浓集法
（1）取枸橼酸或EDTA抗凝血2ml，加入1%皂素生理盐水1.5ml混合均匀。
（皂素1g，生理盐水100ml）。
（2）待完全溶解后离心沉淀。
先以3000r/min离心1min。
取上清液至第二管，然后两管再以3000r/min离心15min。
（3）各取沉淀物，涂片、染色、镜检。
（4）第二管多见是环状体，第一管多见是阿米巴样滋养体与裂殖体。
1．2．2．4皮肤划痕法
本法用于检查恶性疟原虫的一种诊断方法。
（1）用70%酒精棉球消毒背部两侧肩胛骨之间或上臂外侧的皮肤。
（2）用锐针同种牛痘一样的划破皮肤2~3道，相距间1~2毫米。
（3）挤出微带血液的组织液制成厚、薄血膜均可。
（4）按常规染色，干后镜检。
（1）划皮时要注意深浅度，划得太浅，血液不能流出，达不到检查的效果，划得太深血液大量流出反而降低效果。
只划破毛细血管为宜。
（2）因恶性疟原虫在内脏及皮肤的毛细血管内进行裂体生殖，故此法阳性率高，可见到恶性疟的大滋养体，裂殖体及幼稚的配子体。
1．2．2．5梯度分层浓集法
用于疟疾的免疫学诊断的研究，为了制备裂殖子抗原，需要从感染血液中分离裂殖体期所寄生的红细胞进行短期培养。
以便收集红细胞外的游离裂殖子，可用阿拉伯胶密度梯度离心方法。
（1）取25%阿拉伯胶液3ml，缓慢置于离心管中。
（2）将感染疟原虫的血液3ml慢慢的放入离心管的上层，切莫混合。
（3）600r/min离心5min。
（4）再以1000r/min离心10min，结果可以看到在阿拉伯胶之上的沉淀为第一层，内含有大量裂殖体和少数滋养体仅见极个别的正常红细胞，在离心底部的沉淀为第二层，如感染的血中有环形体，则在第二层沉淀中有环状体，部分滋养体和裂殖体，以及正常红细胞。
需要分离纯裂殖子作为免疫原，则可取上述第一层沉淀层中之裂殖体，经磷酸缓冲糖溶液离心洗2次后接种于营养液中培养4~6h，即有大量的裂殖子出现，然后取此培养物，1000r/min离心15min，上清液中含有大量的裂殖子和色素粒，红细胞膜和少量成熟裂殖体。
再将此沉淀物经阿拉伯胶密度梯度离心后即可得纯裂殖子，其方法如下：
依次取28%、20%、15%和8%的阿拉伯胶液各3ml，缓慢置入离心管中，切莫混合，然后取上述沉淀物加3ml营养液或磷酸缓冲糖溶液稀释混合后，缓慢地置于离心管的最上层，先以600r/min，离心沉淀8min，然后以2500r/min，离心沉淀20min。
结果在8%阿拉伯胶之上有一层白色沉淀物，内含大量裂殖子及红细胞和极少量的死亡原虫。
1．2．2．6荧光染色法
原理：
荧光染色是利用荧光色素通过渗透、吸附、化合等原理、化学作用与寄生虫或组织细胞的不同结构成分相结合，成为带荧光结构的标本。
（1）用甲醇固定厚、薄血膜（厚血膜一定要脱血红蛋白才能固定）。
（2）用0.01%吖啶橙染液滴在厚血膜上染半分钟，然后在薄血膜上滴吖啶橙染色液染1分钟。
（3）将厚、薄血膜上的染色液倾去。
（4）用缓冲液冲洗数次。
（5）用1.0%氯化钙净化液退色和分色10~15分钟。
（6）用清水漂洗数次，晾干待镜检。
染好的血片晾干后，可保存半个月。
检查时，打开荧光源，使紫蓝光柱直接射在显微镜的反光镜上，利用反光镜将最亮的光线调节在视野的中心。
在血膜上滴1小滴PH7.4的缓冲剂或普通清水做裱封剂，加一盖玻片，先用低倍镜找，然后换高倍镜观察。
染色的血片在荧光显微镜下，视野的背景呈暗绿或黑绿色，疟原虫的核和白细胞的核（因含有大量的脱氧核糖核酸），呈现橙红色荧光，正常红细胞不着色。
白细胞在暗绿色的视野中如同、夜空中的皓月，疟原虫的核点则如同亮晶晶的小星星。
疟原虫的各个发育阶段的形态可以分辨出来，如想用油镜看可滴一滴香柏油即可观察。
（1）厚血膜比平常的厚血膜稍薄点，并要求涂末均匀，这样染色效果好。
（2）净化液退色时间要掌握好，即不可过长，也不可过短。
否则时间长可使细胞质的橙红色荧光会减退，时间短了又可使原虫的核不出现黄绿色荧光。
（3）在制片过程中要注意清洁，避免细菌和其他污物污染，用水时尽量用蒸馏水或将冷开水过滤。
不影响荧光的着色。
1．2．3黑热病原虫的检查
骨髓穿刺取骨髓液检查是诊断黑热病的一种常用方法。
常以髂骨穿刺、棘突穿刺、胸骨穿刺，取骨髓液制成涂片进行镜检。
1、穿刺骨髓液，或者淋巴结制成涂片，肝与脾也可，虽阳性率高但不太安全。
2、将制成的涂片进行瑞氏或吉氏染色。
3、放油镜下查找利杜体，其形态特点简述如下：
利杜体为圆形或卵圆形小体，相当于血小板大小，细胞浆染成浅蓝色，核与动基体各染成紫红的颜色，多半在人体的内皮细胞及单核细胞内，也可能游离在血细胞外。
1、在分叶核细胞内，因被吞噬消化的关系，原虫的形态和染色都不正常，而在单核细胞内或内皮细胞内染色较好。
2、在肝或脾穿刺液，阳性率最高，骨髓、淋巴结次之，末梢血最差，但骨髓穿刺较安全。
3、凡所涂之血片，及骨髓涂片，均必须自然干燥，切勿加热。
4、血片染色较深时，血小板颗粒不清楚，易认错，所以要注意利杜体和血小板的区别，以免误诊。
1．2．4弓形虫检查
1、取检于病人的骨髓或血液，一可直接涂片；
如为胸、腹水、脑脊液、阴道分泌物，尿液离心后取沉淀涂片。
2、待干后，用吉氏或瑞氏染色法染色、镜检。
1．3其他体液的检查
1．3．1痰液的检查
痰液主要是检查肺型肺吸虫病，也可检查阿米巴病等。
1、取24h的痰液，并仔细观察痰液的色泽，呈黄色、棕褐色或铁锈色，而以铁锈色最常见，如查阿米巴，可选取有血液的部分作生理盐水涂片镜检。
2、将痰液消化，可用1分痰，5分5~10%的氢氧化钠摇匀后放入37℃温箱中。
3、经3~6h可将粘稠的痰消化，可取底部少许沉渣放在载玻片上，加以盖玻片镜检。
或将在沸水浴中使痰全部溶解，后离心2000r/min5min即可，检查时可用低倍镜。
1、以下呼吸道的痰液为最好，除肺吸虫卵外还可检查出寄生虫的幼虫如棘突蚴的头节，小钩，蛔虫的幼虫等。
2、如得不到下呼吸道的痰，也可设法取到早晨的痰。
3、如不能及时检查时，可用10%甲醛固定保存。
1．3．2十二指肠液的检查
十二指肠液的检查主要是诊断肝吸虫病，除可检查肝吸虫卵外，还可查到兰氏贾第鞭毛虫，钩虫卵，蛔虫的幼虫及卵。
用十二指肠引流，采取胆汁检查虫卵，可用直接涂片的方法，也可离心沉淀浓集法检查虫卵，此方法虫卵多又无杂质最易找到，但操作比较困难，患者多不愿接受检查。
1．3．3乳糜尿的检查
乳糜尿及鞘膜积液的检查为诊断丝虫病较好的方法。
取乳糜尿可做直接涂片检查，如果找不到微丝蚴，可做浓集检查，其方法如下：
取乳糜尿5ml加乙醚5ml于试管内用力振荡，使脂肪溶于乙醚内，将上层乙醚液吸去加水稀释后离心检查。
1．3．4鞘膜积液的检查
将阴囊皮肤以碘酒酒精消毒后，用注射器抽取鞘膜积液，可作直接涂片检查，也可加水稀释离心检查。
要注意彻底的消毒，以免发生感染。
1．3．5阴道分泌物的检查
阴道分泌物的检查是诊断阴道毛滴虫病的一种常用的方法，一般检查方法有如下三种：
1．3．5．1直接涂片法
此法简单易行，为一般化验室常用的方法，但如轻度感染也可漏诊。
操作方法
（1）消毒棉签在疑似的病
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