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重大科学研究计划

国家重点基础研究发展计划（重大科学研究计划）课题年度报告

项目编号：

2012CB910600

项目名称：

蛋白质定量新方法及相关技术研究

课题编号：

2012CB910601

课题名称：

高效低残留的蛋白质样品处理和分离新材料

2012年12月1日

一、年度计划执行情况

1.年度计划完成情况

按照项目任务书要求本课题在2012年度主要针对蛋白质定量中蛋白质或肽段回收率低、分离峰容量低和基质非特异性吸附强的问题，侧重于发展低残留的磁性材料、整体材料、蛋白质均衡器固载基质以及超细粒径分离材料。

按项目任务书的规定，完成了研究内容和预期目标。

在低残留的样品预处理新材料方面：

1）研究了基于原子转移自由基聚合反应（ATRP）在磁性微球材料表面键合可控链长的聚合物链段的方法，探索了不同长度和种类的链段与蛋白质在材料表面残留间的关系，制备了新型的亲水性刷型聚合物磁性纳米颗粒，并将其用于大规模分析人血清糖蛋白质组，共鉴定到106个糖蛋白的204个糖基化位点；2）研究了基于可逆加成-断裂链转移自由基聚合（RAFT）制备可控链长的聚合物微球材料的方法，并结合蒸馏沉淀聚合制备了一种新型表面硼酸基团可控的核壳结构的聚合物纳米材料，实现了糖蛋白质的高选择性富集；3）分别以分子印迹材料和硼酸为高选择性配基，以点击化学为键合方式，制备了核壳卫星型高选择性配基修饰的磁性材料，实现了糖蛋白的选择性富集；4）发展了基于三磷酸腺苷配基的固定化金属离子磁性纳米材料，用于磷酸化肽富集和定量，将其检测限降至3amol，且从肝癌肿瘤高低转移细胞株中发现17条磷酸化肽段和2条磷酸化蛋白质的含量具有显著差异。

4）基于比大表面积的石墨烯，研制了C8修饰的三明治结构介孔石墨烯复合物，并用于内源性肽段的富集，在鼠脑组织中选择性地富集到89个内源性肽段；5）研制了石墨烯/二氧化钛复合材料，用于磷酸化肽段的选择性富集，对磷酸化肽的检测限可以降至2×10-9M；6）研制了具有等级孔结构的含钛磷酸铝5型分子筛介孔材料，并将其成功用于磷酸化肽的高选择性富集。

在蛋白质均衡器技术方面：

发展了基于噬菌体展示单链可变区片段文库（scFv@M13）为配基的蛋白质均衡器，并将其用于血清蛋白质组样品，经均衡器处理血清后，鉴定蛋白数目大幅上升，从280个提高到560个，展示了该蛋白质均衡器在高丰度蛋白质去除和低丰度蛋白质富集方面、以及提高蛋白质组鉴定覆盖率方面的重要作用。

在蛋白质组样品分离材料方面：

1）制备了粒径分布较窄、粒径可控（1μm-2μm）的亚2μm核壳结构硅胶色谱填料基质，并实现了多肽的快速分离；2）采用苄基甲基丙烯酸酯和硅氧烷为原料，通过“一锅法”制备了苯基-硅胶杂化整体柱，杂化整体柱的最小理论塔板高度为8.38µm，对应的理论塔板数为119,000理论塔板数/米，对六种蛋白的酶解产物进行了分离分析，计算得到12cm苯基-硅胶杂化整体柱的峰容量为144；3）通过一步升温的改进型“一锅法”制备了两亲性的有机-硅胶杂化整体柱，对肽段混合物进行分离，均取得了很好的分离效果，最高柱效可达到110,000理论塔板数/米；4）基于“巯基-烯烃”的点击化学反应这一新型固定相键合方式，设计了新型的两性离子亲水作用色谱固定相，该固定相不仅具有优异的分离选择性和分离效率，还克服了常用亲水作用色谱固定相化合物适用范围窄的问题；5）基于水平共聚的技术，发展了反相/弱阳离子交换（C18/WCX）的混合模式色谱固定相，在不同pH条件下，C18/WCX柱与C18的正交性优于商品化C18固定相的正交性。

在本年度，发表文章27篇，其中SCI收录26篇，申请发明专利4项；培养博士6名，硕士7名。

2.研究工作的主要进展

2.1低残留的样品预处理新材料方面

1）表面链长可控的蛋白质样品预处理聚合物纳米颗粒材料

通过ATRP反应，在纳米颗粒表面共价键合链长可控的刷型聚乙二醇（PEG）层，然后在聚合物链段末端嫁接亲水性的麦芽糖，从而制得新型的亲水性刷型聚合物磁性纳米颗粒。

由于活性/可控聚合物链段上有大量活性位点的存在，材料表面麦芽糖的键合密度为单分子层接枝麦芽糖的16倍。

将该材料用于糖肽富集，灵敏度可达到500amol的水平，较常用的硼酸富集法和点击麦芽糖亲水作用色谱法的灵敏度提高了2个数量级。

在大规模分析人血清糖蛋白质组中，共鉴定到106个糖蛋白的204个糖基化位点。

通过结合RAFT和蒸馏沉淀聚合（DPP）技术制备了一种新型表面硼酸基团可控的核壳结构的聚合物纳米材料：

以亚甲基双丙烯酰胺（MBA）和甲基丙烯酸（MAA）二元共聚物为核，亚甲基双丙烯酰胺和3-丙烯酰胺基苯硼酸（AAPBA）二元共聚物为壳的纳米颗粒材料（poly（MBA-co-MAA）@（MBA-co-AAPBA））并用于实现糖蛋白质的选择性富集（图1）。

由于核壳层中均含有MBA单体，因此具有很强的亲水性以及水相分散性，可以降低材料的非特异性吸附；材料表面的苯硼酸功能基团是通过RAFT-沉淀聚合的方法引入的，不仅克服了传统后修饰方法反应步骤繁琐、反应效率低以及直接聚合时得到产物形貌不稳定的缺点，而且通过调节其投料比例可以得到即具有良好富集能力具有低表面残留的纳米聚合物材料。

该材料用对糖蛋白辣根过氧化物酶（HRP）的饱和吸附量可达到76.25mg/g。

在HRP和非糖蛋白牛血清白蛋白（BSA）1:

10的混合溶液中，经该材料富集后，富集后HRP的峰强度较富集前提高了10倍，且经过富集后不存在BSA的峰干扰。

将该材料用于实际样品蛋清中糖蛋白富集，经过材料富集之后经过SDS-PAGE的分析，可以看出对于蛋清中卵清蛋白（OVA）和伴白蛋白（COA）两种糖蛋白具有很好的富集效果。

因此，该低残留富集材料有望在实际生物样品中目标蛋白质的定量分析中发挥重要作用。

图1.通过可逆加成-断裂链转移自由基聚合（RAFT）制备硼酸基团可控的核壳结构的聚合物纳米材料（a）以及对糖蛋白的富集（b）

1.2）高选择性配基修饰的磁性材料

以表面接枝有双键的磁性纳米粒子作为载体，以廉价的BSA作为替代模板，以温敏响应的N-异丙基丙烯酰胺为主要功能单体，采用表面分子印迹技术，制备了具有温敏特性的分子印迹聚合物修饰的磁性纳米材料，以实现价格相对昂贵的人血清白蛋白（HSA）的选择性富集。

磁性温敏印迹纳米粒子不仅可在15min达到吸附平衡，在磁场下瞬间快速磁性分离，对HSA具有良好的选择性吸附性能（吸附容量：

51.95mg/g,识别系数：

4.2），而且对温度有着智能响应功能，通过对温度的改变即可实现对人血清白蛋白的吸附和解吸，在20°C的升温变化内，可实现材料对52%蛋白质的释放。

通过叠氮与炔基的1,3-偶极环加成反应，将炔基化的硼酸分子通过点击化学反应修饰到叠氮功能化的磁性纳米粒子表面，制备了硼酸功能基团修饰的磁性材料；在两种糖蛋白（OVA，转铁蛋白Trf）与三种非糖蛋白（BSA，溶菌酶，细胞色素C）的混合溶液中对该高选择性配基修饰的磁性材料进行吸附性能测定，发现该材料对两种糖蛋白OVA和Trf的最大吸附量分别达到490.4mg/g和293.8mg/g，对OVA的吸附量是传统磁性粒子键合硼酸基团方法的粒子的8倍。

而对非糖蛋白的吸附很小，从而显示出该磁性材料在蛋白质样品处理过程中的低残留特性。

以纳米磁球为基质，以参与蛋白磷酸化过程的磷酸腺苷为配基，制备了基于三磷酸腺苷配基的固定化金属离子磁性纳米材料（Ti4+-ATP-MNPs）。

由于配基的亲水性，提高了材料对磷酸肽的选择性：

在用β-酪蛋白和BSA的酶解产物按照质量比1:

5000的情况混合的情况下，Ti4+-ATP-MNPs仍能富集到5条磷酸化肽，检测限可降至3amol，回收率可达到84.76±2.9%。

基于此富集材料，在小鼠肝癌腹水瘤淋巴道高转移细胞株中高表达的磷酸化蛋白质分析中共鉴定到1130个肽段，其中含磷酸化肽高达1069个；进而利用二甲基化同位素标记定量技术，结合纳升液相色谱-质谱联用技术，发现17条磷酸化肽段和2条磷酸化蛋白质的含量具有显著差异。

3）石墨烯类富集材料

通过溶胶凝胶法，一步合成了C8修饰的三明治结构介孔石墨烯复合材料。

这种新发展的基于石墨烯富集材料具有广阔的平面结构，良好的水溶性，开放式的孔道，规则的孔径（2.8nm），大表面积（632m2/g）以及内壁修饰的C8功能基团。

这种特殊的新型复合材料不仅提供了超大面积的亲水表面，避免了材料本身的聚合现象，并且其内壁修饰上的疏水C8链可以通过疏水-疏水相互作用，有效吸附肽段。

这种C8修饰的介孔石墨烯材料还可以通过体积排阻作用，在鼠脑组织中选择性地富集到89个内源性肽段，且富集能力可以达到4.737mg/mg，检测限可以达到0.1nM。

基于石墨烯材料，制备了双平台的石墨烯-二氧化硅-聚甲基丙烯酸甲酯复合材料（Graphene@SiO2@PMMA），以低丰度多肽（血管紧张肽Ⅱ）为分析对象，经过复合材料富集后，可将检测到的标准多肽的信号强度提高12倍。

将该材料用于实际样品鼠脑提取物蛋白质组分析，可以鉴定到52条低丰度的多肽。

利用“一步水热法”合成了石墨烯/二氧化钛复合材料，并将此材料用于磷酸化肽段的选择性富集。

不仅水热法的合成策略简便快速，并且由于石墨烯的大比表面积，制得复合材料的比表面积为商品化二氧化钛纳米颗粒的3倍，达到了137.9m2/g。

对β-酪蛋白酶解产物的检测限可以降至2×10-9M，因此该材料有望成为磷酸化蛋白组学分析和定量的强有力工具。

4）用于多肽富集的介孔材料

以葡萄糖为模板剂制备具有等级孔结构的含钛磷酸铝5型分子筛介孔材料，并将其应用于复杂肽段混合物中磷酸化肽段的选择性富集。

由于葡萄糖为模板剂能够有效提高分子筛材料中的中孔结构，进而大大提高磷酸化肽检测的特异性。

通过优化得到含钛量为0.05的以葡萄糖为模板剂的等级孔含钛磷酸铝5型分子筛（TiAPO-5H-0.05）是这一系列材料中最有效的磷酸化肽富集材料：

以1pmol的β-酪蛋白作为标准样品，在100倍BSA酶解物干扰的情况下，TiAPO-5H-0.05材料对磷酸化肽仍具有显著的富集选择性。

2.2蛋白质均衡器技术

以氨基磁球为基质材料，戊二醛为间隔臂，以噬菌体展示单链可变区片段文库（scFv@M13）为配基，发展了基于scFv@M13的磁性蛋白质均衡器（scFv@M13@MM）。

并将其与血清样品共同孵育，随后用2MNaCl溶液、20mM盐酸胍溶液、20%乙腈溶液（含0.5%三氟乙酸）、牛凝血酶四种洗脱液分别洗脱与材料结合的蛋白质，然后将蛋白洗脱液酶解、进而进行2D-SCX-RPLC−ESI-MS/MS分析。

从蛋白质均衡器上可以洗脱下来560个蛋白（在相同条件下，不经过蛋白质均衡器处理，从血清中仅能鉴定到280个蛋白）。

从而说明了scFv@M13@MM在高丰度蛋白质去除和低丰度蛋白质富集方面、以及提高蛋白质组鉴定覆盖率方面的重要作用。

2.3蛋白质组学样品分离材料

1）超细粒径肽段分离微球

采用“低温成核，高温生长”的方法制备亚2μm核壳结构硅胶色谱填料基质。

该新发展的方法能够在较短的时间内制备出粒径分布较窄的，粒径可控（1μm-2μm）的硅胶基质分离微球材料。

图2（a）为合成的2m核壳结构硅胶微球透射电镜图片，可以观察到清晰的核壳结构，其壳层厚度为173nm，核与粒径比为0.82，粒径分布的相对标准偏差小于5%。

将合成的核壳结构硅胶微球经过C18试剂衍生后制备出反相色谱填料，可用于多肽化合物的快速分离，如图2（b）所示，能够在2min内对5种标准多肽实现基线分离。

图2.核壳结构硅胶微球的电镜照片，放大6000倍（a）以及核壳硅胶色谱柱对5种标准多肽的快速分离色谱图（b）；色谱柱：

50×2.1mmi.d.,1.4μm核壳结构C18硅胶填料；流动相A：

水加0.1%TFA，流动相B：

乙腈加0.1%TFA。

梯度15-50%B，梯度时间：

5min；流速：

0.8mL/min；T=60℃；分离时最高压力47MPa；检测波长：

214nm；五种多肽进样量：

1μL。

2）肽段分离整体柱

采用苄基甲基丙烯酸酯和硅氧烷为原料，通过“一锅法”制备了苯基-硅胶杂化整体柱并用于毛细管液相色谱分离中。

杂化整体柱的最小理论塔板高度为8.38µm，柱效为119,000理论塔板数/米，适用于中性、极性化合物以及多肽分子的分离。

将此苯基-硅胶杂化整体柱用于六种蛋白质酶解产物的分离，以肽段K.AEFVEVTK.L的色谱峰计算得到12cm苯基-硅胶杂化整体柱的峰容量为144，这与相同条件下C18填充柱分离峰容量相当。

针对传统的“一锅法”制备过程中需要进行多步升温，过程繁琐，重复性差的问题，利用甲基丙烯酸类化合物上的双键反应活性高的特点，分别以[2-（甲基丙烯酰基氧基）乙基]二甲基-（3-磺酸丙基）氢氧化铵（MSA）和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱（MPC）为两种单体制备两种两亲性的有机-硅胶杂化整体柱。

这两种的整体柱的色谱分离均呈现出典型的亲水作用机理，证明了这一改进型“一锅法”用于制备有机-无机杂化整体柱的可行性和有效性。

此外，这两种有机-硅胶杂化整体柱成功地用于了肽段混合物的分离，柱效可以达到110,000理论塔板数/米。

3）基于新型键合方式的新型色谱固定相

基于巯基-烯烃的点击化学反应，设计了一种以半胱氨酸为两性离子键合相的亲水作用色谱固定相（ClickTE-Cys），其正负电荷以平行于固定相表面的方式分布（图3）。

ClickTE-Cys亲水作用色谱固定相表面电荷容易调控，在pH3-7的范围内能从正电荷变为负电荷状态。

以1.0mL/min的流速连续使用甲酸铵溶液淋洗色谱柱72小时，保留因子不变。

采用ClickTE-Cys色谱柱对4种标准蛋白（血红蛋白、BSA、磷酸化酶b、酪蛋白）的酶解产物进行分离，发现该色谱柱与商品化反相色谱（XTerraMSC18）在分离多肽样品上具有优异的正交性（88.0%）。

图3.基于“巯基-烯基点击化学”的两性离子色谱固定相的合成路线

基于水平共聚的技术，发展了反相/弱阳离子交换（C18/WCX）的混合模式色谱固定相（图4）。

利用C18/WCX与商品化的C18固定相有着优异的正交性的特点，构建了二维C18/WCX-RPLC系统用于鼠脑可溶性蛋白酶解产物的分离，并用Q-TOF质谱检测器在线检测，结果表明该系统具有很高的分离效率，共鉴定到了2803个蛋白和5921个多肽，比文献报道的用二维RP-RPLC系统和二维SCX-RPLC系统所鉴定的多肽分别增加了47%和275%。

图4.基于水平共聚技术的反相/弱阳离子交换（C18/WCX）混合模式固定相合成

二、重要阶段性成果或突破（每项300-500字，另附图片）

2.1刷型聚合物修饰的亲水作用材料的制备及应用

结合PEG刷型聚合物结构稳定、抗蛋白非特异性吸附强与ATRP反应中链长活性可控的特点，如图5所示，在纳米颗粒表面通过ATRP反应共价键合链长可控的刷型PEG层。

利用PEG链段上大量的活性位点的存在，进一步通过“点击化学”反应，引入麦芽糖基团，制得表面链长可控的聚合物纳米颗粒材料（Fe3O4@SiO2@PEG-Maltose），用于基于亲水作用机理的糖肽富集。

通过此活性/可控链段所引入的麦芽糖接枝密度能达到：

88.56μmol/m2，为常规单分子接枝法的16倍。

将该材料分别用于1mg三种标准糖蛋白（免疫球蛋白、HRP、人α1酸性糖蛋白）酶解产物的富集和糖基化位点大的鉴定，与理论糖基化位点相比，均得到很高位点鉴定率：

免疫球蛋白，1/1；HRP，6/8；人α1酸性糖蛋白，5/5。

该材料对糖肽的富集灵敏度可以达到500amol的水平，较糖肽富集中常用的硼酸微球和点击麦芽糖亲水作用色谱法的灵敏度提高了100倍。

人血浆样品经SDS-PAGE预分离、胶上酶解后，随后用Fe3O4@SiO2@PEG-Maltose富集肽段，洗脱液用2DLC-MS/MS进行分析，共鉴定到106个糖蛋白的204个糖基化位点。

该新型的刷型亲水性磁性纳米颗粒在糖肽中的高选择性、高灵敏性以及低非特异性吸附，为其进一步用于为糖蛋白质组学定量提供了重要的手段。

相关研究成果已发表于Chem.Commun.2012,48,8138-8140。

图5.基于ATRP反应制备表面链长可控的麦芽糖修饰的磁性纳米颗粒材料

2.2基于三磷酸腺苷配基的固定化金属离子磁性纳米材料

以氨基纳米磁球为核心，经戊二醛活化后，随后将三磷酸腺苷（ATP）固定于磁球表面，最后进行金属离子固载，最终制得基于三磷酸腺苷配基的固定化金属离子磁性纳米材料（Ti4+-ATP-MNPs），该功能磁球形貌均一，直径约为150nm，为了验证对磷酸化肽的富集能力，用β-酪蛋白和BSA的酶解产物按照物质的量比1:

500、1:

1000甚至1:

5000的混合物为样品进行了富集，分别鉴定到7条、9条和5条磷酸化肽；说明即使在复杂的样品体系中，Ti4+-ATP-MNPs仍对低丰度的磷酸化肽展示出极强的富集性能。

而在1:

500的混合的样品中，用商品化的TiO2和Ti4+-IMAC颗粒进行富集，仅能鉴定到4条和2条磷酸化肽，说明Ti4+-ATP-MNPs是当前商品化磷酸化富集材料所无法企及的。

以β-酪蛋白酶解产物为标准样品，Ti4+-ATP-MNPs对磷酸化肽的富集容量可以达到20.72μmol/g，回收率可达到84.76±2.9%，检测限可降至3amol，这是迄今为止在磷酸化肽检测中最低的检测限。

将Ti4+-ATP-MNPs用于在小鼠肝癌腹水瘤淋巴道高转移细胞株中高表达的磷酸化蛋白质分析中（图6），共鉴定到1130个肽段，其中含磷酸化肽1069个，对应2323个磷酸化位点，Ti4+-ATP-MNPs在肽段水平对磷酸化肽的富集选择性高达94.60%；进而利用二甲基化同位素标记定量技术，结合纳升液相色谱-质谱联用技术，成功获得了17条磷酸化肽段和2条磷酸化蛋白质具有显著差异。

相关研究成果已发表于Chem.Commun.2012,48,6274–6276

图6.基于三磷酸腺苷配基的固定化金属离子磁性纳米材料的制备及应用

2.3噬菌体展示单链可变区片段文库（scFv@M13）为配基的蛋白质均衡器

发展了基于噬菌体展示单链可变区片段文库（scFv@M13）为配基的蛋白质均衡器。

如图7所示，在氨基功能化磁球表面键合戊二醛，并以此为间隔臂固载scFv@M13制得用于蛋白质均衡的磁性材料（scFv@M13@MM）。

每100mg磁球可以固载3×1010个scFv@M13，文库中与蛋白结合的可变片段可达106种，且每种数目相同。

与已发展起来的固载均衡器的凝胶材料相比，该材料不仅具有在磁场下快速分离的优点，而且其均衡器键合密度从60μg/g提高至1mg/g，洗脱溶剂使用量从5mL降至100μL。

在scFv@M13@MM应用于血清样品中蛋白质丰度均衡的研究，将材料与血清样品共同孵育，随后用2MNaCl溶液、20mM盐酸胍溶液、20%乙腈溶液（含0.5%三氟乙酸）、牛凝血酶四种洗脱液分别洗脱与材料结合的蛋白质，然后将蛋白洗脱液酶解、进而进行2D-SCX-RPLC−ESI-MS/MS分析。

第一种洗脱液中，鉴定到439中蛋白，后三种洗脱液中，共鉴定到332中蛋白质，合并四种洗脱液，从蛋白质均衡器上可以洗脱下来560个蛋白（在相同条件下，不经过蛋白质均衡器处理，从血清中仅能鉴定到280个蛋白），鉴定数目提高了100%，且前10种高丰度蛋白在四种洗脱液中的丰度都有了明显降低，且有许多低丰度蛋白质被鉴定出来，因此scFv@M13@MM材料不仅在去除高丰度蛋白质和提高蛋白质组鉴定覆盖率方面发挥了重要作用，并且还为低丰度蛋白质富集和相对定量打下了基础。

相关研究成果已发表于Anal.Chem.2012,84,7633−7637。

图7.固载scFv@M13的磁性微球的制备过程

三、项目执行过程中存在的问题及其对策。

课题按照计划任务书顺利执行。

在可逆加成断裂链转移聚合在聚合物微球材料表面键合可控链长的聚合物链段过程中，会发生键合量偏低的现象。

下一步本课题会对用于键合球的蒸馏沉淀制备过程进行优化，提高核心微球表面双键量。

此外，还将上述新材料新方法尽快用于解决更多蛋白质组学定量问题。

四、下年度研究工作计划和进度安排。

根据项目任务书，本课题下年度工作计划如下：

1-3月，开展以马来酸酐为功能单体，并结合其他功能单体，通过可逆加成断裂链转移聚合，发展活性可控聚合物整体材料的方法；

4-6月，以亚氨基螯合的金属离子（Cu2+、Fe3+、Ni2+）、核酸适配体为配基，制备亲和色谱整体柱材料，并考察蛋白质在此整体柱上残留情况与配基之间的关系；

7-9月，通过热聚合、光聚合、溶胶凝胶法制备适用于蛋白质分离的聚合物整体材料、硅胶整体材料和有机-无机杂化整体材料；

10-12月，研制可满足蛋白质组分离需求的高效、低残留超长超细内径毛细管整体柱。