碱性磷酸酶km值测定实验报告Word下载.docx

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　　二、抑制剂对酶促反映的影响　　凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。

酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。

可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。

竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。

非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。

本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。

实验步骤：

　　实验一:

底物浓度对酶促反应速度的影响　　1.取试管9支，将/L基质液稀释成下列不同浓度：

　　管号　　试剂　　2.另取9支试管编号，做酶促反应：

　　管号　　试剂　　3.混匀，37℃水浴保温5分钟左右。

　　4.加入酶液后立即计时，各管混匀后在37℃准确保温15分钟。

　　5.保温结束，立即加入/LNaOHml以中止反应。

各管分别加入%4-氨基安替　　比林ml及％铁氰化钾ml。

　　6.充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510nm处比色。

读取各管吸光度，　　做记录。

　　实验计算：

　　1.在37°

C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），　　以此计算处各管的酶活性（v）。

　　2.以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值。

　　Y=+,Km=　　实验二:

抑制剂对酶促反映的影响　　1.取试管9支，将/L基质液稀释成下列不同浓度：

　　管号　　试剂　　2.另取试管9支，做酶促反应：

　　管号　　试剂　　3.混匀，37℃水浴保温5分钟左右。

　　6.充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510nm处比色。

读取各管吸光度，　　并计算各管酶活性。

　　以酶活性单位的倒数1/v为纵坐标，以底物浓度[S]的倒数1/S为横坐标，在方格纸上描点，并连接各点，求该酶的Km值并与前面未加入抑制剂时测出的Km值作比较。

　　Y=+,Km=　　实验分析：

　　通过绘图及分别计算无抑制剂与有抑制剂时酶的Km值，可发现，此抑制剂为竞争性抑制剂。

通过绘图发现，其两条以1/v为纵坐标、1/S为横坐标的直线截距几乎相同，而加入抑制剂后，酶的Km值更大，此为竞争性抑制剂的特征：

Vmax不变，Km变大。

　　思考题　　一、除了双倒数作图外，你能举出其它能将酶动力学数据做出直线图的方法吗？

　　1.海涅斯-沃尔弗作图法（Hanes-Wolffplot）　　双倒数方程式两边同时乘以[S]　　直线的斜率等于1/Vmax，横轴截距为-Km　　2.伊迪-霍夫斯蒂作图法（Eadie-Hofsteeplot）　　米氏方程式两边均除以[S]　　直线的斜率为-Km，直线的纵轴截距为　　Vmax　　篇二：

碱性磷酸酶Km值得测定与分子筛层析　　碱性磷酸酶Km值得测定　　实验目的　　1.了解磷酸酶Km值的测定原理和方法；

　　2.掌握磷酸酶活性测定的原理和方法；

　　实验原理　　1.在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度　　[S]增大而增加，但底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，即最大反应速度（Vmax）。

反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：

　　Vmax?

[s]V?

Km?

[S]　　2.本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和磷酸盐。

酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的额衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。

其反应如下：

　　磷酸苯二钠?

H2O?

?

苯酚?

Na2HPO4　　苯酚?

4-氨基安替比林?

醌类衍生物（红色）　　实验器材与试剂　　器材：

试管架，试管，移液管，移液枪，恒温水浴箱，721型分光光度计　　试剂：

/L底物液，pH=10碳酸缓冲液，蒸馏水，酶液，碱性溶液，4-氨基安替比林，铁氰化钾K3Fe6,OH?

AKP,OH?

　　实验步骤　　试剂1234567空白/L　　底物液　　pH=10　　碳酸缓冲液　　蒸馏水　　　　混合水浴37℃，预温5分钟　　酶液　　（/ml）　　加入酶液后立即混匀，37℃水浴保温，反应开始。

并开始计时，反应时间为15min　　碱性溶液　　4-氨基安　　替比林　　铁氰化钾　　2.混匀，室温放置10min左右，以空白管调零，　　测定各管的吸光度（A510）　　时间步骤现象分析　　15:

50配好底物混合液无明显现象　　并开始预热　　15:

55预热结束并加入酶液无明显现象　　水浴15min　　16:

07水浴结束，依次加入1-5号管红黄生成酚类碱性溶液等试剂，混颜色依次加深衍生物，匀，置于室温下10min6,7管颜色不深6,7号管反应未完全16:

17测定各管吸光度　　实验结果记录与处理　　试管编号12345678　　数据处理　　试管编号12345678底物浓度　　100mmol/L　　1/[S]21　　1/　　以1/[S]为横轴，1/A510为纵轴作图：

　　计算　　根据y=+，当y=0时，x=-，继而Km=/L　　实践与思考　　1.底物浓度变化对酶促反应速度可造成什么样的影响？

　　在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。

如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。

所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。

　　值在酶动力学研究中有什么意义？

　　不同的酶Km值不同,同一种酶与不同底物反应Km值也不同,Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：

Km值大,表明亲和力小；

Km值小,表明亲合力大.　　注意事项　　1.计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。

实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。

　　2.各管温度的时间一致。

　　分子筛层析（凝胶过滤法）　　实验目的　　1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理；

　　2.学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

　　实验原理　　1.凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体，它们的内部有很细微的多孔网状结构。

　　2.在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。

　　3.本实验采用葡聚糖凝胶G-25，以水为洗脱溶剂，层析分离大分子蓝葡聚糖（M>

200万）和小分子黄色重铬酸钾（M=294）。

　　实验仪器与试剂　　仪器：

层析柱，试管架，铁架台，试管，小烧杯，胶头滴管试剂：

葡聚糖凝胶，蓝色葡聚糖，黄色重铬酸钾，蒸馏水　　篇三：

实验名称碱性磷酸酶的分离纯化实验报告　　实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师　　总分教师签名批改日期　　碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。

AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。

AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。

血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。

　　AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：

将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。

　　一实验原理　　1、碱性磷酸酶的分离纯化　　AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。

有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。

本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。

正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。

　　2、碱性磷酸酶的比活性测定　　根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg?

pr）来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：

a每毫升样品中的蛋白质毫克数；

b每毫升样品中的酶活性单位数。

酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。

本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。

酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。

于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：

在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。

样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。

　　3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响　　在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。

酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。

若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。

当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。

底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表　　示：

　　式中：

Vmax为最大反应速度；

[S]为底物浓度；

Km为米氏常数；

V代表反应的起始速度。

①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。

因此，Km等于酶促反应速度达最大　　值一半时的底物　　浓度。

　　②Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要的方法，大　　多数酶的Km值在/L。

③Km和Vmax的测定：

主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法。

此式为直线方程，　　以不同的底物浓度1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方　　向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。

方程式与图如下：

　　本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。

实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。

酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。

根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。

　　二、实验材料　　

（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定　　１、样品兔肝２、试剂　　①/L乙酸镁溶液②/L乙酸钠溶液　　③/L乙酸镁－/L乙酸钠溶液　　④/LTris－/L乙酸镁PH８.８缓冲液⑤丙酮（分析纯）⑥95%乙醇（分析纯）⑦正丁醇（分析纯）⑧/L底物液⑨１mg/ml分标准液⑩/LＮａＯＨ　　?

%4－氨基安替比林?

%铁氰化钾　　?

/mL蛋白标准液?

碱性铜试剂　　?

酚试剂３、仪器与器材　　①研钵　　②刻度离心管③刻度吸管　　④电动离心机　　⑤玻璃漏斗和玻璃棒⑥托盘天平⑦恒温水浴⑧可见分光光度计　　

（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响　　１、样品兔肝匀浆液　　２、试剂　　①/L底物液　　②mol/L碳酸盐缓冲液PH10（37℃）③碱性溶液　　④%铁氰化钾⑤%4－氨基安替比林⑥酚标准液（/ml）３、仪器与器材　　①恒温水浴锅　　②可见光分光光度计　　三、实验步骤　　

（一）AKP的提取　　AKP提取实验步骤　　AKP的比活性测定　　1、AKP的活性测定　　AKP活性测定实验步骤　　2、蛋白质含量测定　　蛋白质含量测定实验步骤　　（三）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响　　1、底物浓度对酶促反应速度的影响　　将新鲜兔肝用/L碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可　　酶曲线绘制步骤　　2、酚标准曲线的绘制的绘制　　酚标准曲线的绘制的绘制步骤