实验名称碱性磷酸酶的分离纯化实验报告.docx
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实验名称碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：
在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。
样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。
3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。
酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。
若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。
当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。
底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表示：
式中：
Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。
1当ν=Vmax/2时，Km=[S]。
因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。
2Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要的方法，大多数酶的Km值在0.01-100mmol/L。
3Km和Vmax的测定：
主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法。
此式为直线方程，以不同的底物浓度1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。
方程式与图如下：
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。
实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。
二、实验材料
（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定
１、样品
兔肝
２、试剂
10.5mol/L乙酸镁溶液
20.1mol/L乙酸钠溶液
30.01mol/L乙酸镁－0.01mol/L乙酸钠溶液
40.01mol/L Tris－0.01mol/L乙酸镁PH８.８缓冲液
5丙酮（分析纯）
695%乙醇（分析纯）
7正丁醇（分析纯）
80.04mol/L底物液
9１mg/ml分标准液
100.5mol/LＮａＯＨ
110.3%4－氨基安替比林
120.5%铁氰化钾
130.1mg/mL蛋白标准液
14碱性铜试剂
15酚试剂
３、仪器与器材
1研钵
2刻度离心管
3刻度吸管
4电动离心机
5玻璃漏斗和玻璃棒
6托盘天平
7恒温水浴
8可见分光光度计
（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
１、样品
兔肝匀浆液
２、试剂
10.04mol/L底物液
20.1mol/L碳酸盐缓冲液PH10（37℃）
3碱性溶液
40.5%铁氰化钾
50.3%4－氨基安替比林
6酚标准液（0.1mg/ml）
３、仪器与器材
1恒温水浴锅
2可见光分光光度计
三、实验步骤
（一）AKP的提取
AKP提取实验步骤
步骤
操作
（1）匀浆
2g新鲜兔肝剪碎，加入0.01mol/L乙酸镁－0.01mol/L乙酸钠溶液6.0ml，研磨成匀浆。
匀浆倒入刻度离心管中，记录其体积，此为Ａ液
吸取Ａ液0.1ml于另一试管中，加PH8.8Tris缓冲液4.9ml稀释，此为稀释Ａ液（1:
50），供此比活性用
（２）除杂蛋白
在Ａ液中加入正丁醇2.0ml，用玻璃棒充分搅拌2min，室温放置20min，用滤纸过滤
（３）丙酮沉淀AKP
滤液置于刻度离心管中，加入等体积的冷丙酮，立即混匀离心（2000r/min）5min
（４）AKP溶解
沉淀加入0.5mol/L乙酸镁4.0ml，用玻璃棒充分搅拌使其溶解，记录其体积，此为B液。
取B液0.1ml于另一试管中，加入PH8.8Tris缓冲液4.9ml，此为稀释B液（1:
50），供动力实验用
（二）AKP的比活性测定
1、AKP的活性测定
AKP活性测定实验步骤
步骤
操作
（1）加缓冲液
取试管3支，按表操作
试剂（ml）
测定管
标准管
空白管
PH8.8Tris缓冲液
----
-----
1.0
0.04mol/L底物液
1.0
1.0
1.0
（2）温浴
37℃水浴预温5min
（3）加酶和底物
0.1mol/ml标准酚应用液待测液
----
1.0
----
1.0
----
----
（4）酶促反应
37℃准确保温15min
（5）加显色液
0.5mol/LNaOH
1.0
1.0
1.0
0.3%4－氨基安替比林
1.0
1.0
1.0
0.5%铁氰化钾
2.0
2.0
2.0
（6）显色反应
混匀，室温放置10min
（7）测吸光度
510nm处测吸光度
2、蛋白质含量测定
蛋白质含量测定实验步骤
步骤
操作
（1）反应体系设置
取3支试管，按表操作
试剂
测定管
标准管
空白管
PH8.8Tris缓冲液
----
----
1.0
待测酶液
1.0
----
----
蛋白标准液（0.1mg/ml）
----
1.0
----
碱式铜试剂
5.0
5.0
5.0
（2）反应
混匀后室温放置10min
（3）加酚试剂
酚试剂0.5ml
（4）显色反应
混匀后室温放置30min
（5）比色反应
在510nm处比色
（三）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
1、底物浓度对酶促反应速度的影响
将新鲜兔肝用PH10.00.1mol/L碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可
酶曲线绘制步骤
步骤
操作
（1）反应体系设置
取6支试管标号，按表操作
试剂（ml）
1
2
3
4
5
6
0.01mol/l底物液
0.01
0.20
0.30
0.50
1.00
-----
PH100.1mol/L碳酸盐缓冲液
0.07
0.70
0.70
0.70
0.70
0.70
蒸馏水
1.10
1.00
0.90
0.70
0.20
1.20
（2）保温
37℃水浴中保温5min
（3）加酶
各管分别加入兔肝稀释匀浆液0.10ml
（4）酶促反应
混匀，立即记录时间，将各管准确保温15min
（5）终止反应
各管分别加入碱性溶液1.0ml
（6）加显色剂
各管分别加入0.3%4-氨基安替比林1.0ml
各管分别加入0.5%铁氰化钾2.0ml
（7）显色
充分混匀，放置15min
（8）比色测定
以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定
（9）反应速度计算
根据酚标准曲线计算出每样品酚的含量，算出反应速度
（10）曲线绘制
以各管底物浓度的倒数（1/[|S]）为横坐标，以各管反应速度的倒数（1/V）为纵坐标，作图求出Km值
2、酚标准曲线的绘制的绘制
酚标准曲线的绘制的绘制步骤
步骤
操作
（1）反应体系设置
取洁净干燥试管6支，依次加入试剂
试剂（ml）
1
2
3
4
5
6
0.1mol/ml酚标准溶液
----
0.05
0.10
0.20
0.30
0.40
蒸馏水
2.0
1.95
1.90
1.80
1.70
1.60
（2）预加热
37℃水浴中保温5min
（3）加显色剂
碱性溶液
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
0.3%4－氨基安替比林
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
0.5%铁氰化钾
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
（4）显色反应
混匀后，室温放置15min
（5）比色测定
510nm波长处比色
（6）曲线绘制
以酚含量（微克）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制酚标准曲线
注意事项
（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定
1、在纯化过程中，各步加入的有机试剂要计算精确。
2、加入有机试剂混匀后应立即离心，不宜放置过久。
3、在测定酶活性时，每加入一种试剂须立即混匀，避免浑浊。
（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
1、血清取量要准确。
2、标准曲线必须是过原点的一条直线。
3、在酶促反应中，每管加入后立即计时，保证各管反应时间一致。
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