微生物限度检验操作规程.docx
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微生物限度检验操作规程
微生物限度检验操作规程
1.0目的
建立微生物限度检查操作规程，规范操作，保证结果的准确性。
2.0适用范围
成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。
3.0职责
品管部微生物限度检验人员。
4.0作业内容
微生物计数法
一、计数方法
1．微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备
4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表1。
4.2菌液制备按表1规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。
表1试验菌液的制备和使用
试验菌株
试验菌液的制备
计数培养基适用性检查
计数方法适用性试验
需氧菌总数
霉菌和酵母菌总数
需氧菌总数
霉菌和酵母菌总数
金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus[CCMCC（B）26003]
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间18～24h
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu。
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu。
铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa[CMCC（B）10104]
枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis[CMCC（B）63501]
白色念珠菌Candidaalbicans[CMCC（F）98001]
沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天
胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。
沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。
胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。
沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。
黑曲霉菌Aspergillusniger[CMCC（F）98003]
沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间5～7天，或直到获得丰富的孢子
4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
4.4培养基适用性检查按照表1规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。
每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。
同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。
5、计数方法适用性检查
5.1供试品制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采用适宜的方法制备供试液。
制备时若需加温应加热均匀且温度不得超过45℃。
供试液从制备到加入检验用培养基不得超过1小时。
5.1.1成品、辅料供试液的制备取供试品，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或PH7.2磷酸盐缓冲溶液，或胰酪大豆胨液体培养基或稀释制成1:
10供试液，若需要，调节供试液PH至6-8，必要时用同一稀释液将供试液进一步10倍稀释系列。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
5.1.2内包装膜、袋：
取供试品100cm2，剪碎，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH7.2磷酸盐缓冲溶液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡，振摇，制成1:
10供试液。
若需要，调节供试液PH至6-8，必要时用同一稀释液将供试液进一步10倍稀释系列。
5.2接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。
所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。
为确认供试品中微生物能被充分检出，应首先选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。
5.2.1试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液所含菌量不大于100cfu。
5.2.2供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。
5.2.3菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
5.3供试品中微生物的回收表1所列的计数方法适用性试验的各试验菌应逐一进行微生物回收，微生物回收采用平皿法。
5.3.1平皿法采用倾注法，表1中每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿。
取照上述“供试液的制备”和“接种和稀释”制备的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养、计数。
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌液，计算各试验组的平均菌落数。
5.3.2薄膜过滤法采用的滤膜孔径不大于0.45um。
滤膜直径一般为50mm。
滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。
使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。
为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。
供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000ml；以免滤膜上的微生物受损伤。
取照上述“供试液的制备”和“接种和稀释”制备的供试液适量（一般取相当于1g、1ml、10cm2的供试品，若供试品中所含菌数校对，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液总，混匀，过滤，用适量的冲洗液冲洗滤膜。
测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；测定霉菌和酵母菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，按表1规定条件培养、技术。
每株试验菌每种培养基至少制备1张滤膜。
同法测定供试品对照组和菌液对照组菌数。
6、结果判断计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5-2范围内。
若各试验验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
若存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，应选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品检查。
二供试品的检查
1、检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。
一般随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取10g、10ml或100cm2进行检验。
2、供试品检查按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。
2.1阴性对照试验以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
若有菌生长应进行偏差调查。
2.2平皿法取规定量的供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
2.2.1培养和计数胰酪大豆胨琼脂培养基平板倒置于30～35℃培养箱中培养3～5天。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板倒置于20～25℃培养箱中培养5～7天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数并报告。
菌落蔓延成片的平板不宜计数。
点计菌落数后计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌落数。
若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
2.2.2菌数报告规则需氧菌总数宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告的依据。
取最高平均菌落数，计算1g、1ml或10cm2供试品中所含微生物，取两位有效数字报告。
如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均茵落数小于1时，以小于1乘以最低稀释倍数报告菌数。
2.3薄膜过滤法按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试液制备。
取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上培养。
2.4培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
2.5菌数报告规则以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品），或＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
3、结果判断
3.1需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。
若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
使用选择性培养基时应进行培养基适用性检查。
3.2各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：
101cfu：
可接受的最大菌数为20；
102cfu：
可接受的最大菌数为200；
103cfu：
可接受的最大菌数为2000，以此类推。
3.3若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。
控制菌检查法
l、简述
控制菌检查法是用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在某些特定微生物。
本标准的控制菌为大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]和金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]
供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“微生物计数法”。
2、培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验
供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行适用性验证。
2.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus[CMCC（B）26003]
铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa[CMCC（B）10104]
大肠埃希菌Escherichiacoli[CMCC（B）44102]
乙型副伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）[CMCC（B）50094]
白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]
生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC（B）64941]
2.2菌液制备
将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基上，30～35℃培养18～24h；
将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天；
将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48h，或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24h。
上述培养物用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，孢子悬液保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。
2.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
2.4培养基适用性检查控制菌检查用的培养基应进行培养基适用性检查。
检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。
各培养基的检查项目及所用菌株见下表2。
表2控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示特性
控制菌检查
培养基
特性
试验菌株
耐胆盐革兰阴性菌
肠道菌增菌液体培养基
促生长能力
大肠埃希菌、铜绿假单胞菌
抑制能力
金黄色葡萄球菌
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基
促生长能力+指示特性
大肠埃希菌、铜绿假单胞菌
大肠埃希菌
麦康凯液体培养基
促生长能力
大肠埃希菌
抑制能力
金黄色葡萄球菌
麦康凯琼脂培养基
促生长能力+指示特性
大肠埃希菌
沙门菌
RV沙门菌增菌液体培养基
促生长能力
乙型副伤寒沙门菌
抑制能力
金黄色葡萄球菌
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
促生长能力+指示特性
乙型副伤寒沙门菌
三糖铁琼脂培养基
指示能力
乙型副伤寒沙门菌
铜绿假单胞菌
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基
促生长能力
铜绿假单胞菌
抑制能力
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
甘露醇氯化钠琼脂培养基
促生长能力+指示特性
金黄色葡萄球菌
抑制能力
大肠埃希菌
梭菌
梭菌增菌培养基
促生长能力
生孢梭菌
哥伦比亚琼脂培养基
促生长能力
生孢梭菌
白色念珠菌
沙氏葡萄糖液体培养基
促生长能力
白色念珠菌
沙氏葡萄糖琼脂培养基
促生长能力+指示特性
白色念珠菌
念珠菌显色培养基
促生长能力+指示能力
抑制能力
白色念珠菌
大肠埃希菌
2.4.1液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的表2的试验菌株与被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基比较，被检培养基试验菌应生长良好。
2.4.2固体培养基促生长能力检查用涂布法分别接种不大于100cfu的表2的试验菌株与被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态应一致。
2.4.3培养基抑制能力检查接种不少于100cfu的表2的试验菌株与被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，试验菌应不得生长。
2.4.4培养基指示特性的检查用涂布法分别接种不大于100cfu的表2的试验菌株与被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂能力等英语对照培养基一致。
2.5控制菌检查方法适用性检查
2.5.1供试液制备：
按“供试品检查”中规定的方法制备供试液。
2.5.2试验菌根据各品种项下微生物限度标准中规定的检查控制菌选择相应的试验菌株。
确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法是，采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。
2.5.3适用性检查按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中，采用薄膜过滤法是取规定量供试液，过滤冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤后注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。
依相应控制菌检查方法，在规定的温度和最短培养时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。
2.5.4结果判断上述试验若检出试验菌，按此供试液之被罚和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，营销处供试品中的抑菌活性（中国药典2015年版四部通则1105中抗菌活性的去除或灭活），并重新进行方法适用性试验。
若经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。
3、供试品检查供试品的控制菌检查应经方法适用性试验确认的方法进行。
3.1阳性对照阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌的加入量应不大于100cfu，阳性对照应检出相应的控制菌。
3.2阴性对照以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照应无菌生长。
3.3大肠埃希菌（Escherichiacoli）
3.3.1供试液制备和增菌培养取供试品，照“微生物计数法”制成1:
10的供试液，取相当于1g或1ml供试品的供试液，接种于适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24h。
3.3.2选择和分离培养取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48h。
取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72h。
3.3.3结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
3.4铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）
3.4.1供试液制备和增菌培养取供试品，照“微生物计数法”制成1:
10的供试液，取相当于1g或1ml供试品的供试液，接种于适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24h。
3.4.2选择和分离培养取上述培养物1ml接种至溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72h。
取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其他适宜方法进一步鉴定。
3.4.3氧化酶试验将洁净的滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1%盐酸N,N-二甲基对苯二胺试液，在30秒内培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。
3.4.4结果判断若溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌。
若平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。
3.5金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）
3.5.1供试液制备和增菌培养取供试品，照“微生物计数法”制成1:
10的供试液，取相当于1g或1ml供试品的供试液，接种于适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24h。
3.5.2选择和分离培养取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72h。
3.5.3结果判断若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
8.0参考文件
中国药典2015年版四部《通则1105非无菌产品微生物限度检查：
微生物计数法》和《通则1106非无菌产品微生物限度检查：
控制菌检查法》
9.0记录表格
微生物限度检查记录
计数培养基适用性检查记录
控制菌检查培养基适用性检查记录
阳性菌使用记录
微生物限度检查记录（1/4）
检品名称
检品来源
检品批号
检验日期
年月日
包装规格
报告日期
年月日
批量
kg（件）
检验依据
中国药典2010年版二部
供试品制备：
常规法
供试品g（ml）加无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（PH7.0）（配制批号）至ml
细菌数30~35℃3天
霉菌（酵母菌）总数23~28℃5天
培养基配制批号：
培养时间月日时～月日时
培养基配制批号：
培养时间月日时～月日时
原液
1：
10
1：
100
阴性对照
原液
1：
10
1：
100
阴性对照
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
24h
24h
48h
48h
72h
72h
96h
120h
平均
平均
结果
cfu/g、ml
结果
cfu/g、ml
大肠埃希菌检查菌种编号：
试验方法
培养基
配制批号
培养时间
h
培养温度℃
结果
备注
供试品
阳性对照
阴性对照
BL
MUG
靛基质
结论
微生物限度检查记录（2/4）
活螨检查
供试品袋（瓶）
直接检查法
结论
金黄色葡萄球菌检查菌种编号：
试验方法
培养基
配制批号
培养时间
h
培养温度℃
结果
备注
供试品
口亚碲酸钠肉汤
口营养肉汤
口卵黄氯化钠琼脂平板
口甘露醇氯化钠琼脂平板
培养基配制批号
观察结果
培养时间（h）
24
48
72
口平板无菌落生长，结论：
未检出金黄色葡萄球菌。
口平板有菌落生长，与金黄色葡萄球菌典型菌落形态特征不符，
结论：
未检出金黄色葡萄球菌。
口平板有菌落生长，与金黄色葡萄球菌典型菌落形态特征相符（或疑似），
结论：
需进行革兰染色、镜检及血浆凝固酶试验。
营养琼脂培养
培养基配制批号：
培养时间：
h
培养温度：
℃
革兰染色、镜检
1、染色观察：
口呈蓝紫色，为革兰阳性菌；口呈红色，为革兰阴性菌
2、镜检结果：
口球菌、口芽孢、口荚膜、
口单个排列、口成双排列、口短链状排列、
口排列不规则的葡萄状
营养肉汤培养
培养基配制批号：
培养时间：
h
培养温度：
℃
血浆凝固酶试
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