拉曼光谱在生物化学中应用.doc
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拉曼光谱在生物化学中的应用
张文静
拉曼光谱是一种散射光谱。
在30年代，拉曼散射光谱曾是研究分子结构的主要手段。
自1960年激光问世并将这种新型光源引入拉曼光谱后，拉曼光谱的弱点（主要是拉曼效应太弱）被攻克。
拉曼光谱出现了崭新的局面。
目前激光拉曼光谱已广泛应用于有机、无机、高分子、生物、环保等各个领域，成为重要的分析工具。
它不仅与红外光谱相配合，可以更完整地研究分子的振动和转动能级，更好地解决有机结构的分析问题。
而且由于它的一些特点，如水和玻璃的散射光谱极弱，因而在水溶液、气体、同位素、单晶等方面的应用具有突出的特长。
近几年来又发展了傅里叶变换拉曼光谱仪、表面增强拉曼光谱仪、超拉曼、共振拉曼、时间分辨拉曼等新技术，激光拉曼光谱在高分子结构研究中的作用正在与日俱增。
作为生物化学主要研究对象的生物大分子多是处在水溶液环境中，研究它们在水溶液中的结构对于了解生物大分子的结构与性能的关系是很重要的。
目前关于水溶液中生物大分子的结构（构性，构象）资料还比较少。
生物大分子溶于水时结构上是否会发生变化？
pH、离子强度、温度和溶剂等环境条件对生物大分子的结构会有什么影响？
这些问题都有待我们去研究。
由于水的红外吸收很强，因此用红外光谱发研究生物体系有很大局限性，而水的拉曼散射很弱，干扰小，而且拉曼效应对于分子构象的变化比较灵敏。
此外，对生物大分子结构有重要影响的—S—S—键在红外光谱中吸收很弱，又处于低波数区（550~430ｃｍ-¹），因而测定很困难，但它在拉曼光谱中却显示强峰。
在激光拉曼光谱的测定中，样品用量很少，可低至数微克，这对生物化学体系也是非常重要的。
由于上述原因，再加上激光拉曼光谱仪本身的不断改进，使激光拉曼光谱已成为一种能够快速，详尽提供有关水溶液中生物大分子结构信息的新技术。
生物大分子中，蛋白质、核酸、磷脂等是重要的生命基础物质，研究它们的结构、构象等化学问题以阐明生命的奥秘是当今极为重要的研究课题。
应用激光拉曼光谱除能获得有关组分的信息外，更主要的是它能反应与正常生理条件（如水溶液，温度，酸碱度等）相似的情况下的生物大分子的结构变化信息，同时还能比较在各相中的结构差异，这是用其它仪器难以得到的成果。
多肽和蛋白质的分子链是同种或异种α－氨基酸头尾相连的肽链。
这种酰胺键的振动状态有九种，如表1所示。
其中酰胺Ａ，Ｂ常被ＣＨ伸缩振动和水分子振动所掩盖。
酰胺Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ的拉曼线很弱，故它们都无应用价值。
而酰胺Ⅰ的拉曼先强而宽，且为单线，对各种蛋白质分子差别不大，故参考价值不大。
酰胺Ⅲ很少受其它振动模式的干扰，且具有强拉曼效应，是分析鉴定结构的可靠模型。
表1 酰胺链的拉曼频率和归属
链
通常频率范围／ｃｍA
~３３００
Ｎ－Ｈ伸缩
酰胺Ｂ
~３１００
Ｎ－Ｈ伸缩（费米共振）
酰胺Ⅰ
１５９７~１５７５
Ｃ－Ｎ伸缩，Ｎ－Ｈ变形
酰胺Ⅲ
１２２９~７６７
Ｏ＝Ｃ－Ｎ变形
酰胺Ⅴ
６４０~６０６
Ｃ＝Ｏ变形
酰胺Ⅶ
２００
Ｃ－Ｎ扭曲
多肽，蛋白质结构的拉曼信息是较丰富的。
主链酰胺Ⅰ，Ⅲ特征振动能精确地描述它们的二级结构。
许多的拉曼线归属与芳香环的氨基酸残基和Ｓ－Ｓ、Ｃ－Ｓ键振动的特征频率，它们的状态与蛋白质的几何构型和性能关系很为密切。
多肽和蛋白质的二级结构是指主链构型为α－螺旋、β－褶板的不规则状或它们的混合态。
利用酰胺基伸缩振动频率与二级结构关系通则，可以进行定量计算。
核糖核酸（ＲＮＡ）是磷酸与核糖相互连结并在核糖的１`位接上腺嘌呤（Ａ）、尿嘌呤（Ｕ）、鸟嘌呤（Ｇ）或胞嘧啶（Ｃ）等核酸碱基。
去氧核酸（ＤＮＡ）在核糖的２`位上是ＣＨ２基，碱基由５－甲基尿嘧啶，即胸腺嘧啶（Ｔ）代替。
在多聚的核酸链中，碱基相互排列组成了一级结构。
二级结构通常指碱基相对与主链的方向位置以及碱基是由氢键配对或一个堆积在另一上面。
核酸的二级结构包括有序和无序构型。
核酸的主链状态发生变化可由－Ｏ－Ｐ－Ｏ－基拉曼线强度的变化来测定。
根据实验－ＰＯ２⁻的对称伸缩振动（1100ｃｍ⁻¹）不依赖于主链构型，将它作内标，求得814ｃｍ-¹和1100ｃｍ-¹谱线的强度比，能定量的说明有序（分子呈螺旋状）和无序构型的程度，当强度比在1.64±0.04时为100%的有序型，当比值等于０时则为完全无序型。
如大肠菌甲酰甲硫氨转移核糖核酸在中性常温水溶液中的比值为1.37，它的二级结构中就含有84％的有序型，16％属无序型。
二级结构的内容还包括碱基成对还是堆积型。
碱基的构型状态取决于环振动和氢键的变化。
例如PolyA·PolyU在32°C时呈双股状，其碱基的成对拉曼线在1668cm-¹。
当加温至85°C，它离解为单股时，就出现了不成对的拉曼线1661cm-¹,这两条线的强度比能反映主链中A·U的成对程度。
拉曼光谱在引入激光光源及光电探测技术之后得到了迅速的发展。
然而，人们仍常常为样品本身或样品中杂质的荧光干扰而困惑。
80年代末期发展了傅里叶变换拉曼（FT-Raman）技术，这一技术能有效地消除荧光干扰。
由于高聚物样品或其中杂质的干扰，普通激光拉曼只能检测其中一小部分样品。
而引入FT-Raman技术后，已能成功地检测80％以上的合成和天然高聚物，生物大分子及其它样品。
FT-Raman技术能避免荧光干扰，从而大大拓宽了Raman光谱的应用范围。
FT-Raman采用1.064μm近红外区激光激发以抑制电子吸收,这样既阻止了样品的光分解又抑制了荧光的产生。
同其它在拉曼光谱中减少荧光问题的方法相比，近红外激发的傅里叶变换拉曼谱的魅力在它的抑制荧光的能力，它的现场检测特性及它的对多种复杂样品的适用性。
FT-Raman技术可大大提高光谱仪的测量精度。
在分光扫描系统中，光谱测量精度主要由机械扫描精度决定，很难在长程扫描中保持0.5cm-¹以上的精度，两次扫描之间重复精度也差。
在FT-Raman系统中，由于是干扰计量，以稳频He-Ne激光波长为标准，对拉曼位移的测量可达10-³cm-¹，并且重复性好。
另外，FT-Raman光谱仪能消除瑞利谱线，瑞利谱线的存在所引起的噪音会影响整个拉曼谱图，使相对较弱的拉曼线变得模糊。
FT-Raman光谱仪所具有的滤光系统能够消除瑞利谱线。
生物物质组成高度复杂，通常在可见及紫外区对激光照射产生强荧光。
反射红外光谱法被广泛用来研究“Intact”生物物质，但它的光谱分辨率很差且受到生物组织中水的吸收干扰。
拉曼光谱受水的影响很小，但在用它对眼睛晶状体及植物的研究时，都遇到严重的荧光干扰，相比而言，用近红外激发可以成功地得到这些生物物质的无荧光干扰的傅里叶变换拉曼光谱。
眼球晶状体中蛋白质含量较之身体其它器官都高大约占质量的33%，如此高的蛋白质含量对把光聚焦在视网膜上起很重要的作用。
晶状体中蛋白质的物理化学排布对其透明性影响很大，由意外事件造成的晶状体不透明都可能导致视力模糊甚至全部失明。
老年性白内障是人眼睛里最常见的疾病之一。
作为一种非破坏性技术的拉曼光谱已被广泛地用来在分子水平上研究晶状体的病变结构变化。
但对普通拉曼光谱来讲，老年人眼睛中色素沉淀的晶状体的荧光性物质是一个严重的干扰问题。
用FT-Raman光谱却可免受其害。
植物是由两种主要细胞构成：
一组负责新陈代谢，另一组为非新陈代谢，负责输送液体或起支撑作用。
细胞壁的存在是植物细胞区别与动物细胞的特征之一。
细胞壁的主要组成是植物纤维物质和木质素。
传统的研究植物细胞壁的方法需对其进行离析，这样就破坏了它的形态。
FT-Raman技术可用来研究细胞壁。
研究三种不同木质组织的光谱图，它们分别是南方松树、竹子和枸杞。
在枸杞的近红外FT-Raman光谱图上标出了主要的拉曼位移：
其中2898cm-¹和1098cm-¹的拉曼谱线是由植物纤维物质的单独振动产生；1655和1608cm-¹处的谱线是由木质素单独贡献的。
同时在1455，1384，1339及905cm-¹处还可以检测到植物纤维物质和木质素的重叠模式。
从这三种不同物质的光谱上可以看出：
竹子的化学组成名显异与松树和枸杞。
FT-Raman光谱技术既是一种可获得丰富信息又是一种实施方便的分析植物组织化学组成的先进技术。
综上所述，拉曼光谱（包括激光拉曼光谱和傅里叶变换拉曼光谱）是一种灵敏度高、不需特殊制样、不破坏样品并可对样品物质进行检测的崭新技术，随着激光技术、计算机技术等相关技术的不断地发展，拉曼光谱技术必将不断改进创新，将在生物化学中发挥更大的作用。
[参考书目]：
1.薛奇《高分子结构研究中的光谱方法》高等教育出版社1995年5月
2.许存义 左健《紫外拉曼散射及其应用》《物理》1999年第28卷第4期万方数字资源系统数字化期刊
3.孙志贤《现代生物化学理论与研究技术》军事医学科学出版社1995年4月
4.中国科学院科技政策局《走向21世纪的生物学未来生物学（1991~2020年）预测》华夏出版社1992年4月
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红外与拉曼光谱在生物学中的应用
09811031生化系曹建
结构化学是研究原子、分子和晶体的微观结构，研究原子和分子的运动规律，研究物质的结构和性能关系的科学，是化学的一个重要分支。
它包含许多有用的概念和知识，许多重要的规律和原理，并且发展和改进许多研究方法和实验手段。
同时随着生物学进入分子生物学时代，对于一个生物科学工作者来说，对结构化学知识的了解已经成为不可缺少的了。
以下我将通过对光谱技术中红外与拉曼光谱的学习和了解，表达我对本学科的一些认识和看法。
数十年来化学家已经利用光谱技术来研究化合物的结构和反应，这些技术的主要优点是它们一般不会损伤所研究的分子，并且容易精确化和自动化，这些优点对于生物学家也是重要的。
在有机结构的分析中，红外光谱与拉曼光谱是相互补充的。
红外光谱谱图解析主要是在掌握影响振动频率的因素及各类化合物的红外特征吸收谱带的基础上，按峰区分析，指出某谱带可能属于哪个峰区，结合其它峰区的相关峰，确定其归属。
在此基础上，再仔细归属指纹区的有关谱带，综合分析，提出化合物的可能结构。
必要时查阅标准图谱或与其它谱（1HNMR，13CNMR，MS）配合，确证其结构。
与其它谱比较，红外光谱谱图的解析更具有经验性、灵活性。
而在拉曼光谱中，谱带频率与功能团之间的关系与红外光谱基本一致。
不同的是有些功能团的振动，在红外光谱中能观测到，在拉曼光谱中很弱甚至不出现；而另一些基团的振动，红外光谱中很弱甚至不出现，在拉曼光谱中则可能是强带，这是由于两者的选律不同，所以在有机结构分析中，两者可以相互补充。
在拉曼光谱中，振动谱带的叠加效应较小，谱带清晰，对整个分子的骨架振动的表示比较有特征性。
另外，拉曼光谱还可以测定分子的退偏度比，利于弄清分子的对称性等。
一、红外光谱的应用
纯的转动光谱发生在微波区，其能量较低，对生物大分子的研究价值不大。
一个生物大分子中有数目巨大的振动模式，完全的红外光谱非常复杂。
但是人们在总结大量红外光谱实验资料的基础上，发现在不同的化合物中，同一种化学键或基团，往往表现出大致相同的吸收峰位置，这些就是我们常利用的特征振动频率，它可以帮助我们判断有无某种化学键或基团，从而帮助判断分子结构。
例如在研究血液中存在的胆固醇时，有时需区分自由胆固醇和被脂肪化的胆固醇，此时可利用两分子的红外光谱加以区别：
自由胆固醇的红外光谱应有OH基吸收峰而无羰基吸收峰。
它的脂化产物恰相反。
我们在课堂上了解到OH吸收峰在3500cm-1附近而羰基吸收峰在1700cm-1附近。
这样我们可以根据这两者的谱图，发现其中一谱图在1730cm-1附近有强吸收，因而可判断为被脂肪化了的胆固醇（原图为胆固醇醋酸脂与自由胆固醇，此处未标出）。
以上只是红外光谱在鉴别上的部分应用，其对于化合物的性质测定也有一定的价值。
以下是一个近期在报刊上发表的例子。
近年来，有关天蚕的饲育、基础理论和开发利用等研究备受关注。
几位科学工作者用红外光谱法测定了桑蚕茧、柞蚕茧、龙蚝天蚕茧、东北天蚕茧和河南天蚕茧丝蛋白结构，其谱图及研究结论如下：
由谱图1-5和谱图6可见，被测定蚕茧样品均为丝蛋白结构。
根据蛋白质特征吸收峰的归属可知，3300cm-1谱峰为酰胺ANH伸缩振动和OH伸缩振动，1650-1660cm-1谱峰为酰胺ⅠCO伸缩振动，1530cm-1谱峰为ⅡCN伸缩振动和NH面内变形振动，1230-1240cm-1谱峰为酰胺ⅢCN伸缩振动和NH面内变形振动，600-700cm-1谱峰为酰胺ⅤNH面外变形振动。
由谱图1—5可见：
（1）960cm-1谱峰，独有桑蚕茧不出现；
（2）1320cm-1和770cm-1两谱峰，只有东北和河南天蚕茧出现，且河南天蚕茧相对强度明显强于东北天蚕茧；（3）1650cm-1和1530cm-1这对谱峰其相对强度桑蚕茧、柞蚕茧和龙蚝天蚕茧均相差不大，而东北和河南天蚕茧都相差较大，特别是河南天蚕茧相差更大，即1530cm-1谱峰强度特低；（4）龙蚝天蚕茧和柞蚕茧虽然红外光谱相似，但它们的谱峰之间相对强度却不尽相同；（5）600-700cm-1谱峰也有明显差别。
为了验证两种蚕茧1530cm-1谱峰强度降低的原因，1320cm-1和770cm-1两谱峰的来源，以及前面归属的正确性。
本文测定了氧化后的柞蚕茧层红外光谱（图6），由图6可见，1530cm-1谱峰相对强度降低，同时出现了1320cm-1和770cm-1两个新谱峰，并且随着1530cm-1谱峰的降低，1320cm-1和770cm-1两谱峰相对强度在增加，呈现出与东北及河南天蚕茧红外光谱相似这一现象。
该实验表明，这种对东北及河南天蚕茧红外光谱1530cm-1、1320cm-1和770cm-1谱峰的归属和解释是合理的。
通过上述红外光谱研究，我们可以发现东北及河南天蚕茧层均被某种程度氧化，酰胺中亚氨基部分被氧
化成硝基化合物，且河南天蚕茧比东北天蚕茧氧化的更严重些。
同时也证明了东北及河南天蚕茧1530cm-1谱峰低的原因和1320cm-1、770cm-1两谱峰的由来，为不同种类的蚕丝及它们的织品的物证检验及鉴定提供了较好的方法。
但红外光谱对水溶液的研究遇到了重大障碍，因为溶剂水对红外光有强的吸收，使光谱完全被水的吸收所遮蔽。
但红外光谱可研究从生物体系萃取的物质。
例如微生物和病毒的溶剂萃取物具有其特征的红外光谱，可用于检测它们。
毒物学家用红外光谱检测已死器官中所存在的毒物。
病理学家常用红外光谱研究尿与血液。
对溶液的红外光谱研究可用有机溶剂。
对固体样品常与KBr粉末混合和压成薄片，或分散在石油中进行测定。
二、拉曼光谱的应用
水的红外吸收十分强烈，而它的拉曼散射极弱，拉曼光谱是同红外光谱相接近的方法，但又补充了红外光谱在生物高分子研究上的弱点。
拉曼光谱不仅水没有影响，而且用量仅几微克。
（红外光谱用量在100微克以上）生物高分子中的烯键、炔键、硫桥键、碳-碳键在红外光谱上是弱信号，而在拉曼光谱上的信号很强。
生物高分子的结构是螺旋体或平面折叠型，因此偏振和退偏度的测定具有指导意义。
由于这些特点，拉曼光谱被越来越广泛地应用于研究各种生物高分子的结构及它们在水溶液中受外界环境（温度、离子强度、pH等）的影响。
以下是拉曼光谱在生命科学中应用的一些范畴及实例。
1.多肽及蛋白质构型的探讨
多肽及蛋白质有两种主要的构型，即α-螺旋体构型及β-折叠构型。
α-构型聚-L-丙氨酸Ⅰ--Ⅲ带为1654（s），1549（w,b），1331和1310（s）cm-1，聚-L-赖氨酸的酰氨Ⅰ、Ⅲ带为1652（s）、1320（s）cm-1.而β-构型聚-L-丙氨酸和聚-L-赖氨酸的酰氨Ⅰ带为1663cm-1和1668cm-1，酰氨Ⅱ带很弱，不易识别，酰氨Ⅲ带前者为1268、1250、1237cm-1，后者为1235cm-1，故可大致把1230及1235cm-1两带作为判断β-构型的依据。
2.核酸的组成及结构的探讨
在1967年前后已经有了关于核酸碱基的激光拉曼光谱的报道，在这些碱基、核糖和磷酸的衍生物中确定了1500----1800cm-1区域内各基团归属。
如共轭C=O的基频为1655---1670cm-1；非共轭C=O的基频为1695cm-1附近；环内的C=C及C=N伸缩振动频率为1550---1650cm-1。
C=O的偏振性很强，而C=C及C=N的偏振性较弱。
在1200---1500cm-1区域内出现的环内CC及CN伸缩振动的偏振性为中等。
800cm-1以下的一些谱线具有较强的偏振性。
由于NH，NH2，ND，OH的变形频率都是很弱的，故核苷及核苷酸以及核糖只有很弱的谱峰。
为了研究核酸的构型，核酸的模型化合物只能用核糖磷酸基与某种碱基合成。
此种模型化合物称为聚核苷酸。
当聚核苷酸以水为介质时它们会形成一系列特殊的构型及自身作用成有序构型。
其中以双螺旋结构为最重要。
核酸的双螺旋结构有A、B、Z三种构型。
在激光拉曼光谱中以810---815cm-1处的谱线表征，并认为此谱线是有序排列的核酸所具有的特征谱线，它是有磷酸核糖脊骨的振动产生的，它的位移反映核酸分子构型的变化。
例如，比较小牛胸腺DNA与酵母tRNA的2.5%水溶液的激光拉曼光谱，可以看到前者无814cm-1线，而后者有814cm-1线。
表明在水溶液中RNA常以A式存在，而DNA常以B式存在。
比较810---815cm-1谱线与磷酸基伸缩振动线（约1100cm-1）的强度，其比值可以作为核酸A式构型含量的量度。
以下是一则应用红外光谱和激光拉曼光谱共同测定配合无分子的材料：
稀土配合物的性能及其应用一直广泛吸引着人们的研究兴趣。
上海师范大学化学系的一位在职研究生杨海峰合成了Nd（Pro）3（Phen）Cl3.2H2O三元固体配合物（Pro=脯氨酸，Phen=邻啡罗啉）。
文献上未发现该三元固体配合物的振动光谱数据，本文报道了在本实验室中所测得的此配合物的FTIR光谱（4000-400cm-1）和Raman光谱（3700-100cm-1）。
通过检索分子振动归属校正表和对比脯氨酸、邻啡罗啉的光谱数据，对固体三元配合物Nd（Pro）3（Phen）Cl3.2H2O的振动频率作了归属。
根据FTIR光谱和Raman光谱，初步讨论了配体与Nd（Ⅲ）的配位方式。
其具体的研究结论及图谱如下:
配合物在3056cm-1（Raman）的峰由芳香环上的C—H伸缩振动引起。
2985cm-1（Raman）、2983cm-1（IR）是吡咯的C—H伸缩振动（羧酸基环境）。
2935cm-1（Raman）、2884cm-1（Raman）对应亚甲基的反对称和对称伸缩振动。
2746cm-1（IR）是典型的N-亚甲基C—H伸缩振动。
配合物的3077cm-1（Raman）是吡咯NH吸收带的泛频峰，而在脯氨酸的Raman光谱中，由于分子内氢键的存在而观察不到该峰。
频率1623cm-1（IR）、1622cm-1（Raman）来自N—H的面内变形振动。
711cm-1由N—H的面外变形振动产生。
据此，可推断脯氨酸的吡咯环上的氮未参与配位。
配合物的1520cm-1（Raman）、1413cm-1（Raman）分别是COO-的反对称和对称伸缩振动（Δν=107cm-1），与配体脯氨酸的COO-振动1576cm-1（Raman）、1396cm-1（Raman）（Δν=180cm-1）相比较可知，钕与羧酸根的氧原子以双齿配位形成四员螯环［3，4］。
红外光谱的结果与Raman光谱一致。
配合物的CN伸缩振动分别在1592cm-1（Raman）、1452cm-1（Raman）附近，与配体邻啡罗啉的CN振动带1617cm-1（Raman）、1579cm-1（Raman）、1557cm-1（Raman）、1489cm-1（Raman）相比有较大位移，表明邻啡罗啉通过两个吡啶环上的氮与钕配位形成五员螯环。
在分子振动光谱研究中，红外光谱和Raman光谱是强有力的工具，但其振动模的选择定则不同，光谱数据呈互为补充及佐证的关系。
红外光谱是当分子的振动及转动使分子的永久偶极矩发生改变时对入射光（红外光）中具有特定波长的光的不同程度的吸收。
而拉曼光谱测量的是散射光频率相对激发光频率的位移与散射光强度的关系。
因此，凡是能使分子的偶极矩（极化率）发生改变的振动、转动称为具有红外（拉曼）活性。
对于任何分子，其中不同类型的振动、转动是否具有红外或拉曼活性，一般可用①相互排斥规则②相互允许规则③相互禁阻规则等来判别。
同时对分子低频振动区的观察则Raman光谱更有其优势，这主要是Raman光谱仪在技术上容易得到“全”振动光谱（3700-10cm-1），而远红外光谱分析对仪器要求比较高。
总的来说，红外光谱与拉曼光谱是互为补充的，由它们得到的有关分子结构的信息是一致的。
一切概念和原理都来源于实践，而所得的理论的正确性又要由实践来检验。
我们应当努力掌握好本学科（结构化学）的原理知识，令其成为我们日后研究工作中强有力的辅佐工具，并争取对结构化学这门学科做更为深入的研究、发现、探讨。
[参考文献]:
1.沈报恩著《生命科学中的物理化学》1991年10月第一版P222---227。
2.潘家来著《激光拉曼光谱在有机化学上的应用》1986年4月第一版P117---135。
3.程虎民著《结构化学与结构分析基础》1997年12月第一版P253---254、P238。
4.《光谱实验室》1999年第16卷第2期刘莉萍等《红外光谱法测定无蚕茧层丝蛋白结构》
表1 酰胺链的拉曼频率和归属
链
通常频率范围／ｃｍA
~３３００
Ｎ－Ｈ伸缩
酰胺Ｂ
~３１００
Ｎ－Ｈ伸缩（费米共振）
酰胺Ⅰ
１５９７~１５７５
Ｃ－Ｎ伸缩，Ｎ－Ｈ变形
酰胺Ⅲ
１２２９~７６７
Ｏ＝Ｃ－Ｎ变形
酰胺Ⅴ
６４０~６０６
Ｃ＝Ｏ变形
酰胺Ⅶ
２００
Ｃ－Ｎ扭曲
C（protein）I1632protein=fαIα1632+fβIβ1632+fRIR1632
C（protein）I1660protein=fαIα1660+fβIβ1660+fRIR1660
fα+fβ+fR=1
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