自噬与凋亡文档格式.docx
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细胞自噬性死亡（autophagiccelldeath），又叫第二类细胞程序化死亡。
最近有研究发现，细胞骨架的成分，如胞质角蛋白（cytokeratin）及F-肌动蛋白（F-actin）在这两种细胞程序化死亡中有着很大的区别，推测这两种死亡方式有着不同的本质。
本次报告结构
一细胞凋亡与自动吞噬死亡
二对细胞自噬性死亡中的细胞骨架成分的实验方法
三对细胞凋亡中的细胞骨架成分的实验方法
四小结
五比较讨论与分析
一细胞凋亡与细胞自噬性死亡
细胞凋亡（apoptosis）
细胞凋亡（apoptosis）是传统意义上的细胞程序化死亡，在细胞中主要执行两种功能：
1.对无用的细胞进行消除，如组织萎缩和退化。
2.作为对抗疾病的方式，如清除癌细胞、被毒害了的细胞。
形态学特点
1、胞质胞核内的染色体凝集浓缩
2、形成死亡小体
3、细胞器保存完好
4、不存在大量吞噬泡
细胞自噬性死亡
近年来，在大量的生物体中发现一种存在有大量的吞噬泡的细胞程序化死亡方式，有足够的证据表明，这是细胞程序化死亡。
这是一种在某种生理或疾病时期出现的细胞死亡方式。
已经在菌类，昆虫变态过程中，哺乳动物胚胎发育中的趾间蹼退化，乳腺停止分泌乳汁等过程中，还有在一些疾病中，例如老人痴呆症（Alzheimer’sdisease）和帕金森氏症（Parkinson’sdisease）中，都发现有这种细胞程序化死亡方式。
功能
1、细胞营养缺乏时营养的动员
2、细胞间分化
3、细胞死亡及老化
4、阻止癌症的发生
1、高尔基体和内质网等细胞器膨胀
2、胞质无定形核碎断，固缩
3、有大量吞噬泡
4、细胞膜冒泡
5、形成的吞噬泡是由光面内质网包围将要被吞噬的底物，随后与初级溶酶体结合形成，可用单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverineMDC）染色检测出来。
两者关系
形态学与生化上有不同。
两者可在同一组织中出现，死亡方式的选择由一种基因表达决定。
研究表明，在这两种死亡过程中细胞骨架存在很大差别。
细胞骨架的成分胞质角蛋白和F-肌动蛋白在细胞凋亡过程中很快断裂，而在细胞吞噬死亡过程中仍大部分保存完好。
二对细胞自噬性死亡的研究方法
材料：
人乳腺癌细胞（MCF-7）
方法：
1.用三苯氧酚（tamoxifenTAM）诱导培养细胞，产生细胞自噬性死亡。
2.透射电镜观察细胞形态。
3.用单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverinMDC）染色观察自动吞噬泡。
4.用免疫及组织化学方法分别观察细胞核形态（用H33258染色）、胞质角蛋白（用anti-cytokeratin染色）、F-肌动蛋白（用phalloidin鬼笔环肽染色）。
5.Westernblot电泳（荧光染色）。
透射电镜下观察到的细胞形态
对照细胞：
箭头所指为线粒体三角形所指为多聚核糖体横线表示1微米
双箭头所指为自动吞噬泡（AV）
左图：
10-6MTAM168h（7d），可见大量自动吞噬泡，染色体与对照比，有轻微凝缩。
右图：
10-6MTAM168h（7d），胞质无定形，线粒体聚集成簇，可见吞噬泡，凝缩的核与核膜分离位于核中央
10-6MTAM168h（7d）
用单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverinMDC）染色观察自动吞噬泡。
左上图：
对照
左下图：
所指为自动吞噬泡
免疫及组织化学染色观察
10-6MTAM168h（7d）
A图：
所指为凝缩的细胞核。
B图：
A图所指的核周围的胞质角蛋白成点状。
C图：
D图：
A图所指的核周围的F-肌动蛋白呈放射状，一直延伸到质膜。
Westernblot电泳
（荧光染色）
上图：
对于胞质角蛋白对照组显示典型的区带处理组第三日开始在CK18和CK19之间有弱区带出现，但直到第七天才明显
下图：
对于肌动蛋白总量对照组逐渐减少，而实验组直到第七天才减少
三对细胞凋亡的实验方法
已有资料表明，细胞程序化死亡前及其过程中，会出现肌动蛋白和胞质角蛋白，核纤层蛋白质及其他细胞骨架蛋白解聚化，本实验进行验证和对照。
人结肠癌细胞HT29/HI1
用酪氨酸激酶抑制体（tyrphostinA25）诱导培养细胞产生细胞凋亡。
其余处理方法同自动吞噬泡的实验方法。
实验结果：
透射电镜下观察到的细胞形态
箭头所指为线粒体
三角形所指为多聚核糖体
双箭头所指为自动吞噬泡，数量很少
横线表示1微米
细胞呈多边形，互相靠近，之间有微绒毛接触
用16μg/mltyrphostinA25处理24小时后
典型的apoptosis症状：
圆形细胞没有微绒毛，互相分离，胞质凝缩成新月状，与核膜相连。
线粒体结构保存完整多核糖体仍然可见，有自动吞噬泡，但不多于对照组。
图C及D:
可见完整核旁可见完整的网状胞质角蛋白,而所指的断碎凝缩的核周围的胞质角蛋白却失去了免疫活性。
图E、F和G：
凝缩成碎片的核周围没有被鬼笔环肽染色的F-肌动蛋白但用anti-actin染色可见肌动蛋白成圆球状（G-actin）。
Westernblot电泳（荧光染色）
对于胞质角蛋白，贴壁细胞在24h后在30KD以下有弱区带出现；
分离细胞在1和24h后，30KD以下有更强的区带出现
对于总的肌动蛋白，没有可被免疫法检测出来的水解产物。
1.在MCF-7的细胞系中，TAM能引起细胞自噬性的细胞程序化死亡。
每个细胞中的吞噬泡数量，以及含有自动吞噬泡的细胞，都和对照组有明显的对比。
（如下图）
2.在细胞自噬性的细胞程序化死亡过程中，胞质角蛋白少量分解，但仍未降解到明显的程度，保留其免疫活性，直至死细胞裂成碎片。
3.F-肌动蛋白在核凝缩时即实施程序化死亡时仍能保存完好
4.在HT29/HI1细胞系中，用用酪氨酸激酶抑制体（tyrphostinA25）诱导培养细胞能产生典型的细胞凋亡（apoptosis）
5.细胞凋亡过程中，胞质角蛋白早在凋亡的早期就解聚化或水解掉了。
6.F-肌动蛋白转变成另一种形式的球状肌动蛋白，并可由抗体检测出来。
（右图所示：
在两种细胞程序化死亡的细胞中由鬼笔环肽检测在出现核凝缩的细胞中含有F-肌动蛋白和不含的占所有出现核凝缩的细胞的百分比）
可见，两种细胞程序化死亡确实有着不同的本质。
1.自动吞噬泡与核凝缩，即细胞最终死亡之间的关系？
如图：
吞噬泡数量上升最快在第2-4天，之后维持在一最大量水平，约为60%。
而出现核凝缩和裂解，即不可逆转的细胞死亡阶段，却在迟些时候；
并且所占百分比较少，第七天约为18%。
这可以说明含有正常的细胞核形态以及自动吞噬泡的细胞数量大于含有凝缩核以及自动吞噬泡的细胞的数量。
自动吞噬泡的形成先于细胞死亡的完成阶段。
这在白细胞和神经胶质瘤细胞也发现。
用抑制自动吞噬泡的物质3-甲基腺嘌呤（3-MA）也能抑制核凝缩。
它们之间的关系需要进一步研究。
2.细胞自噬性死亡中细胞骨架与线粒体之间的关系
中间纤维及微丝对自动吞噬泡的形成是必要的。
吞噬泡与溶酶体的融合依赖于微管。
细胞质结构的隔离，自动吞噬泡的开始形成，都依赖于中间纤维，如胞质角蛋白和波形蛋白（vimantin）。
这些步骤以及胞质降解都依赖于ATP，即需要线粒体保持活性。
本实验符合这一推断，即在细胞死亡过程中，胞质角蛋白保留免疫活性，即使其已经变成点状，这个结构可能与线粒体及吞噬泡形成束状有关
3.HT29/HI1细胞系的细胞凋亡分两个阶段？
如前面的细胞电泳对胞质角蛋白的分析：
贴壁的apoptosis细胞有断碎的核，在anti-actin染色中显示很弱或没有免疫活性。
在图中可以看到30KD以下有弱的区带。
而分离的细胞显示有胞质角蛋白的明显降解。
这可能是因为一旦细胞的染色质凝缩并碎断，就会和底物快速分离，因此在任何时候，很少细胞具有细胞凋亡的核形态仍然贴在单层细胞上。
由此可知，中间纤维在apoptosis过程中是降解的，这发生在细胞与底物的分离之前，然后细胞裂解成凋亡小体，即进行第二次坏死。
4.Apoptosis与细胞自噬性死亡的两种细胞死亡方式的选择受哪个基因调控？
曾经有报道说，神经胶质膜细胞及胃癌细胞中的Ras的表达是一个引发这两个途径中的一个的关键步骤。
当Ras使caspase-3-like的蛋白酶失活，自动吞噬死亡产生，当用酪氨酸磷酸化阻断剂处理该细胞，则apoptosis产生。
可是另外的说法是，自动吞噬死亡并不由于caspase-3的缺少而产生，因为自动的早期可检测出caspase的存在，没有caspase的细胞中也有apoptosis的产生。
具体的机制仍有待研究。
尾声
MCF-7细胞是研究雌激素治疗乳腺癌的常用实验材料，弄清其死亡本质对人类对抗癌症有重要意义。
弄清两种细胞程序化死亡的本质区别对控制各种疾病中的细胞程序化死亡提供新的研究目标。
主要参考文献
1.Autophagicandapoptotictypesofprogrammedcelldeathexhibitdifferentfatesofcytoskeletalfilaments---JournalofCellScience113,1189-1198（2000）
2.Actiniscleavedduringconstitutiveapoptosis---BiochemJ（1997）323，233-237
3.http:
//life.kjist.ac.kr/Htm/Lab/apoptosis/htmofworkfield/autophagy.htm
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