光谱化学发光综述剖析Word文档格式.docx

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反应过程可简单地描述如下：

其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态；

若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。

反应过程可表示如下：

化学发光检测具有如下优点：

（1）灵敏度高，灵敏度高是化学分析关键的优越性，用其进行免疫分析，其灵敏度可达11-22mol/L（RIA为10-12mol/L），化学发光免疫分析能够检出放射免疫分析和酶免疫分析等方法无法检出的物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意义；

（2）宽的线性动力学范围，发光强度在4-6个数量级之间与测定物质浓度间呈线性关系；

（3）光信号持续时间长，辉光型化学发光信号持续时间可达数小时甚至一天，简化了实验操作与测量；

（4）分析方法简便快速，绝大多数分析测定仅需一种试剂（复合试剂）的一步模式；

（5）结果稳定误差小，样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能对分析结果带来影响的因素，例如光源稳定性，光散射，光波选择器等；

（6）安全性好及使用期长，免除了使用放射性物质的污染，到目前为止，还未发现其危害性，实际稳定，保存期可达六个月至一年以上。

化学发光的高灵敏度，宽线性范围，分析快速简便，安全性好等优势使得化学发光作为一种光谱检测手段，越来越受到大家的关注。

但是由于化学发光试剂的稀少，化学发光的选择性差等问题限制了其广阔应用，这些问题也受到大家的普遍注意。

随着研究的升入，化学发光有着其广泛的应用前景。

1.理论背景

1.1化学发光分析

化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法。

产生化学发光的能源来自于化学反应，某些物质进行化学反应时，由于反应时产生的化学能使反应物或生成物激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。

化学反应激发后的激发态电子回到基态过程中有许多途径，可以通过振动跃迁、转动跃迁、系间跨越、非辐射跃迁、辐射跃迁等多种形式释放能量，且所有这些过程之间是竞争进行的[1-5]（如图1所示）。

图1TypicalphotophysicalprocessesinCLemission

化学效率主要取决于发光所依赖的化学反应本身；

而发光效率则取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响。

化学发光效率

化学效率

发光效率

化学发光反应的发光强度Icl是以单位时间内发射的光子数表示，它与化学发光反应的速率有关。

时刻t的化学发光强度（单位时间发射的光量子数）：

如果反应是一级动力学反应，t时刻的化学发光强度Icl与该时刻的分析物浓度c成正比，即化学发光峰值强度与分析物浓度c成线性关系。

在化学发光分析中，常用已知时间内的发光总强度来进行定量分析。

图2化学发光动力学曲线

1.2化学发光的分类

化学发光按原理可分为直接化学发光，间接化学发光，生物发光。

其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态

生物发光（bioluminescence）是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。

它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的化学发光，化学能转变为光能的效率几乎为100%。

也是氧化发光的一种。

生物发光的一般机制是：

由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。

自然界具有发光能力的有机体种类繁多。

一些细菌和高等真菌有发光现象。

动物界25个门中，就有13个门28个纲的动物具有发光现象，从最简单的原生动物到低等脊椎动物中都有发光动物，如鞭毛虫、海绵、水螅、海生蠕虫、海蜘蛛和鱼等。

动物的发光，除其自身发光即一次的发光以外，由寄生或共生而产生二次发光的例子也不少。

不同生物体的发光颜色不尽一致，多数发射蓝光或绿光，少数发射黄光或红光。

例如萤火虫的发光是生物发光的一种。

萤火虫的发光原理是：

萤火虫有专门的发光细胞，在发光细胞中有两类化学物质，一类被称作萤光素，在萤火虫中的称为萤火虫萤光素（Fireflyluciferin），另一类被称为荧光素酶。

荧光素能在荧光素酶的催化下消耗ATP，并与氧气发生反应，反应中产生激发态的氧化荧光素，当氧化荧光素从激发态回到基态时释放出光子。

反应中释放的能量几乎全部以光的形式释放，只有极少部分以热的形式释放，反应效率为95%，甲虫也因此而不会过热灼伤。

人类到目前为止还没办法制造出如此高效的光源。

2.化学发光试剂

化学发光剂或发光底物是在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。

能作为化学发光剂的条件：

（1）发光的量子产率高；

（2）它的物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；

（3）能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；

（4）其化学发光常是氧化反应的结果；

（5）在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。

化学发光试剂分为直接发光试剂和酶促发光试剂。

2.1直接化学发光剂

直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团。

2.1.1吖啶酯及吖淀酰胺类

如果吖啶环上的C-9碳原子链上取代基且该取代基能与吖啶环上的C-9和H2O2形成有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当回到基态时发出光子，则这类取代吖啶化合物可做为化学发光标记物。

根据取代基的不同，常用作化学发光标记物的吖啶取代物分为两类：

一类为吖啶酯，如图3-1所示；

另一类为吖啶磺酰胺，如图3-2所示：

图3吖啶取代物结构式

　图3-1和图3-2中的R，R′，R″可能由烷基、烷烯基、芳基、烷氧基及其取代物等构成，相当于连结吖啶部分和官能团部分的空间手臂，其中R′，R″还可能起控制反应动力学和稳定性的作用，如果R′，R″含有吸电子基团，则增加反应速率降低稳定性，含有电子授予体基团，则降低反应速率增加稳定性。

X、X′、X″为官能团，它们起的作用是偶联抗原或抗体，并增加化合物在水中的溶解度。

常用做CLIA的吖啶酯和吖啶磺酰胺化合物[4-8]有下面几种结构（如图4）：

图4吖啶酯和吖啶磺酰胺化合物的结构

它们的结构中都有共同的吖啶环，它们的发光机理相同：

在碱性条件下被H2O2氧化时，发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体，如图5所示：

图5吖啶酯的发光原理

　吖啶类化合物在水溶液中的水解程度，随pH值增大而增大；

随温度升高而增大。

大多数吖啶酰胺类化合物的稳定性较吖啶酯类高，其原因是由于C-N键与C-O键的键级不同，C-N键大于C-O键；

吖啶酰胺类化合物抵抗水解的能力强于吖啶酯类。

对于吖啶化合物来说，吖啶环及酚环或苯磺酰环上，不连取代基与连接不同取代基其稳定性不同。

通常吖啶环或酚环或苯磺酰环上，连有甲基等取代基的吖啶酯或吖啶磺酰胺，由于空间位阻大的原因热稳定性增加，连有吸电子基团时，因有利于亲核取代反应而使稳定性降低。

吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2的稀碱性溶液中即能发光，具有许多优越性，特别是无须一个催化过程，也不需要增强剂，从而降低了背景发光，提高了信噪比，干扰作用少。

该类化合物作为化学发光免疫分析的发光标记物，还具有其它方面的优点，如光释放快速集中、发光效率高、发光强度大，易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少、标记物稳定，在2-8℃下可保存数月之久，因此吖啶酯或吖啶磺酰胺是一类非常有效的化学发光标记物。

这类化合物发光为闪光型，加入发光启动试剂后，0.4s左右发射光强度达到最大，半衰期为0.9s左右。

吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用的体系是Acridiniumester/H2O2系统，即用吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体或抗原，用HNO3+H2O2和NaOH作发光启动试剂。

有些在发光启动试剂中加入TritonX-100，CTAC，Tween-20等表面活性剂以增强发光。

例如CiboCorning公司的MagicLite化学发光免疫分析系列商品试剂盒就是采用这种系统。

2.1.2三联吡啶钌

三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+（如图6所示），其是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。

电化学发光过程如下（如图7所示）：

[Ru（bpy）3]2+和三丙胺（TPA）分别在阳极表面氧化成[Ru（bpy）3]3+和TPA阳离子自由基（TPA+）·

，（TPA+）·

迅速脱去一质子形成三丙胺自由基TPA·

，TPA·

具有强还原性，从而把[Ru（bpy）3]3+还原为激发态的[Ru（bpy）3]2+；

后者发射一个620nm的光子回到基态，再参与下一次电化学发光，只需0.01ms就可发出稳定的光，300ms达到最高峰，每秒几十万次的循环电化学发光大大提高了分析的灵敏度。

另外，通过电极反应在线制备了不稳定的发光剂[Ru（bpy）3]3+和TPA·

，避免了由于化学激发剂不稳定对分析测试的影响。

图6三联吡啶钌结构式图7电化学发光原理

2.2酶促反应发光剂

酶促反应发光剂是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂。

2.2.1鲁米诺及其衍生物

鲁米诺（luminol）、异鲁米诺（isoluminol）及其衍生物作为化学发光物质最早被用作标记物[11-13]，是现有化学发光分析中最常用的体系。

其结构式如图8所示：

图8鲁米诺、异鲁米诺结构式

这类物质的发光为氧化反应发光，它们在碱性条件下通过辣根过氧化物酶（HRP）催化，被H2O2氧化生成3-氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。

图9阐述了鲁米诺-辣根过氧化酶-双氧水体系的反应过程。

图9鲁米诺的发光反应

图10阐述了HRP催化鲁米诺氧化反应产生化学发光的机理。

首先HRP氧化H2O2得到氧化态HRP（HRP-1），然后HRP-1和鲁米诺阴离子（luminol-）反应得到半还原态的HRP（HRP-2）和鲁米诺自由基（luminol•）最后HRP-2和另外一个鲁米诺分子反应，再产生一个luminol•自由基，从而HRP-2回到还原态HRP[14]。

由于鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光，在最后光强度测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成二瓶试剂溶液，只在用前即刻混合。

HRP催化鲁米诺氧化的反应可被某些酚试剂（如邻碘苯酚、对碘苯酚）或萤火虫荧光素酶等增强。

增强剂的作用是增强发光和延长发光时间，由此可提高敏感度。

图10鲁米诺发光机理

　　鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射光波长为425nm。

早期用鲁米诺直接标记抗原或抗体，但由于标记后发光强度降低而使其灵敏度受到影响，近年来改用HRP标记抗原或抗体，免疫反应后，利用鲁米诺作发光底物，在发光启动试剂（NaOH+H2O2）作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于免疫反应中酶的浓度。

如果不使用增强剂，鲁米诺体系的发光基本上为闪光型且信号弱。

1983-1984年Whitechead和Thorpe等首先在上述体系中加入合成的荧光素即一种6-羟基苯并噻唑的衍生物，可以使发光时间延长持续至7min，光信号强度提高7倍，并降低本底信号强度，将信噪比提高达原来的80倍，此即为Luminol/H2O2/HRP/EnhanceSystem。

1985年发现一些取代酚如对位碘苯酚、1-溴-2-萘酚、对位苯基苯酚、对羟基肉桂酸和4-苯基硼酸等是更好的增强剂，发光的持续时间可延到30-60min，发光强度至少增加100倍以上。

目前鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物应用于CLIA，通常采用的体系是Luminol/H2O2/HRP/EnhanceSystem，即用HRP标记抗原或抗体，以鲁米诺或异鲁米诺及其衍生物作发光底物，对碘苯酚或对苯基酚等作增强剂，用NaOH+H2O2作发光启动试剂，化学发光反应2min后，光发射强度达到最高峰；

20min后，光强度减少20%。

Amersham公司的Amerlite化学发光免疫分析系列商品试剂盒采用Luminol/H2O2/HRP/p-iodphenolSystem。

2.2.2（金钢烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物

能发生化学发光的（金钢烷）-1,2-二氧乙烷[15-21]，其结构可以表示如下通式（图11）：

图11（金钢烷）-1,2-二氧乙烷结构通式

　　其中T通常为环烷烃金钢烷，起稳定过氧环的作用，X为烷氧基，它的作用是增加2-二氧乙烷的水溶性，Y是发光基团（也叫生色基团和荧光发色团），Z是Y的保护基团，它与Y连接的化学键能被碱性磷酸酶断裂，而使Z与Y脱离。

当酶促使Z从分子中脱离后，二氧乙烷分解成两个羰基化合物，一个含T，另一个含X和Y，分解反应放出的能量，使Y激发形成一不稳定的电子激发态中间体，当其回到基态时发出光子。

可以通过选择修饰不同取代基Y的二氧乙烷，使发射光的波长和光量子数不同，而通过选择修饰T和X、Z可改变二氧乙烷的水溶性和分解动力学性质。

常用于化学发光免疫分析的（金钢烷）-1，2-二氧乙烷有下面几种结构（如图12）：

图12（金钢烷）-1,2-二氧乙烷结构式

　　在上述分子结构中，螺旋金刚烷构成分子的稳定部分，带有保护基团（磷酸酯或半乳糖吡喃苷）的衍生芳香族结构，则构成易被酶解并在酶解后发光的部分，发光由二氧乙烷断裂分解成为一个激发态的两个羰基化合物。

例如AMPPD在碱性磷酸酶（AP）作用下磷酸酯基发生水解，脱去一个磷酸基而得到一个中等稳定的中间体AMPPD-（半衰期2-30min），此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金钢烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当回到基态时发出波长为470nm的光，并可持续几十分钟，其发光机理如下图13所示：

图13AMPPD化学发光原理

AMPPD的特性：

（1）在碱性环境下，AMPPD的非酶解性的水解程度低，即本底低；

（2）AMPPD的热稳定性好，在pH=7.0的水中，30℃时的分解半衰期为142h，活化能为21.5kcal/mole；

（3）在pH=9.0时，AP酶解AMPPD的速度最快；

在pH=9.5时，虽酶解速度略低，但信噪比最低；

（4）AMPPD的酶解发光为辉光型，波长为470nm，在15min时强度达到高峰，15-60min内光信号强度维持一致，变化很小，即使在12h后仍能测定得出正确结果；

（5）加入增强剂如聚氯苄乙烯苄基二甲基铵（BDMQ）或BSA等，能明显增强AP酶解AMPPD的发光强度，增强因素达100-100000倍。

增强剂的增强机理目前还不非常清楚，在理论上还没有精确的解释，文献上一般认为AMPPD在中等极化的非质子有机溶剂（如正丁醇，二甲基亚砜等）中的发光强度和检测灵敏度较在极化的质子溶剂中，尤其是水介质中高。

如在水介质中加入增强剂，增强剂包围在AMPPD分子的周围，可能通过疏水或离子相互作用或二者兼而有之，与AMPPD酶解产生的发色团结合，使发色团形成一个稳定的构象。

这样使发色团与水分子隔开，从而阻止发色团从激发态回到基态时，非光发射的途径如振动松驰以热能的形式释放全部或部分能量，一些天然的水溶性大分子如水溶性球蛋白BSA、HAS等，和人工合成的聚季铵盐如TMQ、BDMQ等，它们的分子结构中都含有疏水区，能提供一个疏水性微环境，具有稳定发色基团的作用，从而增强发光强度。

CSPD和CDP-Star是继AMPPD后合成的AP酶解化学发光物质，它们的发光性能优于AMPPD：

CSPD和CDP-Star较AMPPD稳定；

非酶解性的水解程度更低；

酶解速度更快，达到最大光信号只需要相当于AMPPD时间的一半；

且发光信号更强，信噪比更高；

CSPD和CDP-Star是目前最理想的AP酶解化学发光物质。

（金钢烷）-1，2-二氧乙烷及其衍生物[15-21]应用于CLIA，通常采用的体系是Dioxetane/AP/EnhanceSystem，即用碱性磷酸酶（AP）标记抗原或抗体，用（金钢烷）-1，2-二氧乙烷或其衍生物作发光底物，在发光底物中加入增强剂。

目前美国DPC公司的ImmuliteSystem和BeckmanCoulter公司ACCESSAutomatedImmunoassaySystem都是采用Dioxetane/AP/EnhanceSystem。

3.国内外主要的化学发光仪器的生产商

尽管人们这么早就发现了化学发光现象，由于大多数化学发光非常微弱，且大多数化学发光反应为快反应，更主要是由于检测器的限制，使得化学发光反应在分析化学中的应用受到限制。

随着化学发光分析研究的深入，化学发光分析仪器也得到了发展。

最初分析工作者主要根据研究工作的需要，自己组装化学发光分析仪器，随着研究工作的深入和技术的日趋成熟，自二十世纪六、七十年代国外化学发光分析仪器有了迅速的发展[22，23]。

国内化学发光分析方面的研究起步于八十年代初，自章竹君及其研究小组在鲁米诺的合成、发光仪的研制方面取得突破性的进展以来，短短二十年时间，国内化学发光分析的研究取得了很大的进展。

有关高效液相色谱化学发光检测器、毛细管电泳化学发光检测器、化学发光免疫分析法和生物的超微弱发光在生命科学、环境、临床医学中的应用都已成为研究的热点。

表1列出各种国内商品化的化学发光分析仪。

到二十世纪九十年代，一些研究工作者和仪器开发商已经研制出了不同型号的商品化的化学发光分析仪。

有关化学发光分析仪器的综述文献也已有报到[24，25]。

表2列出各种国外商品化的化学发光分析仪。

表1国内商品化学发光分析仪

仪器型号与名称

制造单位

性能

备注

FJ-2116超微弱生物化学发光分析仪

陕西师范大学

生物化学发光

FJ-2117超微弱生物化学发光分析仪

YHF-1液相化学发光仪

西安无线电八厂

瞬间发光（流动注射分析）

适合于化学发光动力学研究

YHF-2液相化学发光仪

8601流动注射化学发光分析仪

江苏泰县分析仪器厂

瞬间发光

FICT-8604流动注射化学发光分析仪

FC-878流动注射化学发光分析仪

FG-300超微弱生物化学发光分析仪

上海植物所

光强10-40^4phlton/scm^2

FG-83-1液相化学发光仪

福州无线电六厂

HF-1液相化学发光仪

厦门英华无线电厂

KJL-1超微弱生物化学发光分析仪

北京空军总医院

可检测10^-18w超微弱光

SHJ-1化学发光分析仪

上海计量局实验厂

化学发光

应用光子计数技术（单管）

T3超微弱光探测仪

南京土壤所

应用光子计数技术

BF-8840化学发光氮氧化物分析器

北京分析仪器厂

用光电倍增管检测

WDD-2电脑发光测试仪

北京瑞利分析仪器公司

FT-632型生物化学光度计

北京核仪厂

GPI-B型化学发光仪

西安莱特电子公司

流动注射式化学发光仪

8601，FICT-8604，FC-877，FC-878型化学发光仪

SHG-I型化学发光仪

上海

注射式化学发光仪

表2国外商品化学发光分析仪

国别和公司名称

仪器型号

检测方法

温度控制

动态范围

灵敏度

Bio-OrbitOY

1257-001SiriusLuminometer

PMT单管光子技术（1-10s）

12、25、37

104

0.04pgATP

1258Microolateluminometer

微滴板光子计数

2-40

总测定时间<

55s

1254-001lumimova

15、25、37

0.03pgATP

1251-003lumimometer

2-45

104-107

0.04fmolATP

LabsystemsOy

LuminokanTL

PMT单管光子技术

无控温

0.08fmolATP

AnthosLabtecInstrumentsGmbH

LucyMicroplaceLumimometer

96孔微滴板PMT

TraceLtd

Uni-LiteXcelandSingle-shotSwabDevice

便携式单管

仅测ATP

BMGLabTechnologierGmbH

LUMIs