猪圆环病毒病2型灭活疫苗LG株实用工艺规程.docx
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猪圆环病毒病2型灭活疫苗LG株实用工艺规程
编号:
SC-TS-02-218
猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）
工艺规程
上海海利生物药品有限公司
工艺规程
生产管理
上海海利生物药品有限公司
编号:
SC-TS-02-218
生效日:
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标题:
猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）工艺规程
起草 :
起草日期 :
部门审核 :
审核日期 :
QA审核 :
审核日期 :
批准 :
批准日期 :
分发部门 :
质管部、技术研发部、生产部
题目 :
猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）工艺规程
编号:
SC-TS-02-218
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1.主题内容
本标准规定猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）达到的技术要求。
2.适用范围
本标准适用于猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）
3.引用标准
国家标准（猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）制造及检验试行规程）。
4.规程内容
4.1品名
通用名称：
猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）
英文名：
PorcineCircovirusType2Vaccine,Inacitvated（StrainLG）
汉语拼音：
ZhuYuanhuanbingduErxingMiehuoyimiao（LGZhu）
4.2剂型
水包油剂型
4.3规格
20ml/瓶、40ml/瓶、100ml/瓶、250ml/瓶
4.4菌（毒）种
1.来源：
中国农业科学院哈尔滨兽医生物研究所保存
2.毒株：
猪圆环病毒LG株
3.代次：
56～60代
4.保存温度：
-80℃以下保存
4.5批准文号
兽药生字（2010）090201071
4.6工艺流程图
猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）工艺流程图
生产用PK-15细胞
转瓶制备成细胞悬液﹡
转瓶培养
同步接种毒﹡
36~48h，换维持液﹡
细胞病变达70～80%﹡
收获﹡
半成品检测
分装
灭活检验*
灭活
合格抗原
成品检验
乳化*
反复冻融3次
题目 :
猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）工艺规程
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4.7质量控制点
工序名称
控制项目
控制标准
细胞消化
消化液
0.125%胰蛋白酶+0.01EDTA溶液；50-100mL/转瓶
消化温度
37℃
消化时间
转动转瓶，待细胞层开始出现裂缝时终止，一般为45秒
转瓶培养
温度
37℃恒温室的控制
时间
细胞生长成单层即可结束培养，一般为24小时左右
转速
转瓶机设置为10～12转/小时
接毒
接种量
无菌控制下接种，5%
无菌检测
取样，T.G、G.P、G.A培养基培养应无菌
调PH值
PH值
2日后，无菌，7.5%碳酸氢钠调PH为7.2
观察
细胞病变情况
出现混浊，可能污染，弃去。
细胞病变达70%~80%时收获
收获
无菌
无菌控制下操作，不污染
灭活
灭活剂
0.2%的甲醛
灭活温度
调整灭活罐的温度为37℃
灭活时间
灭活充分，维持24小时
乳化
水相、油相比例
保证抗原含量并不分层，水相：
油相为9:
1
乳化时间
30分钟
乳化温度
0～10℃
4.8活性物质制备工艺过程
4.8.1PK-15细胞系标准：
1.细胞形态：
用含10%的小牛血清的MEM培养液培养细胞，置37℃、含5%CO2培养箱中培养，2～3小时可貼壁，培养48小时应在1/2以上的瓶面出现细胞岛，并有部分相连、镜检时细胞形态是椭圆形或梭状上皮细胞，明朗、轮廓清晰、胞浆内可见小颗粒，72～96小时形成单层。
2.细胞纯净性：
应无菌、无霉菌、无支原体、无外源病毒污染。
3.细胞致瘤性检验：
不致瘤。
4.细胞核学检查：
不同代次的细胞与基础细胞库的细胞相比，所有细胞的染色体模式数不得高出15%，核型必须相同。
5.制苗的细胞代次：
第20～40代之间。
6.细胞保存：
液氮保存，保存期为36个月。
4.8.2生产用毒种要求
◆病毒含量：
每毫升病毒含量应不低于105.5TCID50
◆纯净性：
病毒应无
题目 :
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细菌
霉菌
支原体
其它外源病毒
◆特异性
与PCV2阳性血清中和后接种PK15细胞，中和细胞孔IPMA检测无明显着色反应，病毒对照孔呈棕红色染色。
◆毒种保存与毒种继代
1）在-20℃以下保存，应不超过1年。
2）继代应不超过3代。
4.8.3细胞的传代
Ø工艺过程
选生长2—3天已形成致密单层的细胞种按常规法进行细胞分散，37℃培养，2～3天传代一次。
传代细胞传代时的分种率一般1：
3即1瓶分3瓶，也可1：
5。
可根据生产和试验的需要和细胞生长的情况增殖和扩大细胞。
每次传代应在细胞瓶上（中方瓶、扁瓶、圆瓶）注明细胞代次、日期。
◆生长不良、形态不好的细胞不能用。
Ø工作条件
工作环境
洁净级别：
100级
温度：
18～26℃
相对湿度：
30～65%
压差：
大于5Pa
工作器械
121℃高温灭菌
◆高温蒸汽灭菌工艺应进行验证
4.8.4接种
制备细胞同步接种5%LG毒种，置37℃温室的转瓶机上培养，转速10～12转/小时。
4.8.5观察和收获
Ø工艺过程
接种后每天逐瓶观察细胞病变，并做好记录，接毒后36～48小时用无血清的MEM培养基换液1次，继续培养72～96小时收获病毒液，置–20℃以下冰箱冻结保存，保存期不得超过12个月。
细胞培养物需冻融3次，检验无菌后，将数瓶圆瓶的病毒液混合后，无菌吸取病毒液小样，进行中间检验。
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Ø工作条件
工作环境
洁净级别：
100级
温度：
18～26℃
相对湿度：
30～65%
压差：
大于5Pa
工作器械
121℃高温灭菌
◆高温蒸汽灭菌工艺应进行验证
4.8.6.灭活工艺过程
Ø工艺过程
病毒液导入灭活罐后，将甲醛溶液缓缓导入灭活罐使其终浓度为0.2%，37℃灭活24小时。
灭活结束后用10%亚硫酸钠加入病毒液，使其终浓度为0.05%终止灭活。
Ø工作环境
工作条件
洁净级别：
10000级
温度：
18～26℃
相对湿度：
30～65%
压差：
大于5Pa
工作器械
121℃高温灭菌
◆高温蒸汽灭菌工艺应进行验证
4.8.7半成品检验
4.8.7.1按照现行《中国兽药典》附录进行检验，应无
细菌
霉菌
支原体
外源病毒
4.8.7.2病毒含量检验IPMA（免疫过氧化物酶单层细胞染色法）
1）将毒种用无血清MEM培养基做10倍系列稀释。
2）取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度各接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，每孔100UL,同时设不接毒的空白对照4孔；
3）每孔再加入100uL加入新消化的PK15细胞悬液
4）37℃、含5%CO2培养箱中培养72小时
5）用33%丙酮-PBS固定，用PCV2阳性血清进行IPMA试验，测定各孔中病毒感染情况，按照Reed-Muench法计算TCID50，每ml病毒含量应不低于105.5TCID50。
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4.8.7.3抗原灭活检验后检验
◆按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌
◆灭活检验灭活后的病毒液10倍稀释后取10-1、10-2、10-33个稀释度，每个稀释度各取1ml接种到新消化的PK15细胞培养瓶中，37℃、含5%CO2培养箱中培养96小时，盲传2代，按照病毒含量检验法检验，应均为阴性结果。
4.8.8岗位定员和生产周期
岗位
人员
生产周期
制细胞
3
每批共7天
配液
2
接种
2
收获
3
4.8.9原材料：
PK15细胞，其质量标准应符合PK15细胞系的要求。
4.9活性物质生产技术经济指标和原料利用率计算
原料
营养液
收获得益率
数量
PK-15细胞
10*1000
95%
价值/元
500
10*1000*0.2
1000*10*0.95
每ml活性物质
（500+2000）/1000*10*0.95=0.2631元
4.10油乳剂灭活疫苗制造工艺过程
4.10.1配方
灭活液
水相
9份
15AVG
油相
1份
4.10.2油相制备
为法国SEPPIC提供的MontanideTMISA15AVG佐剂，
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4.10.3水相制备
为已灭活的病毒液
4.10.4乳化
按照上述比例，先将水相加之乳化容器中进行搅拌，然后缓慢加入油相，以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟。
4.10.5分装
4.10.5.1内包装容器
Ø名称：
西林瓶或药用高密度聚乙烯瓶、丁腈橡胶塞
Ø药用高密度聚乙烯瓶由符合GMP要求的厂家直接提供。
Ø丁腈橡胶塞灭菌：
121℃，蒸汽灭菌20分钟。
Ø西林瓶清洗：
用超声波清洗机清洗2-3次；121℃，干热灭菌60分钟。
4.10.5.2分装生产：
生产好的疫苗产品，移至分装生产线上，进行分装，有20ml/瓶、40ml/瓶、100ml/瓶、250ml/瓶四
种规格。
4.10.5.3工作环境
工作条件
洁净级别：
100级
温度：
18～26℃
相对湿度：
30～65%
压差：
大于5Pa
工作器械
121℃高温灭菌
◆高温蒸汽灭菌工艺应进行验证
4.10.6轧盖贴签装箱
Ø压盖：
分装完毕的产品，立即进入压盖生产线，加上铝盖，进行压盖。
Ø贴签：
贴签机调整设置好相应的产品批号及有效期限，进入贴签程序。
Ø装盒：
20ml每10瓶一盒，盒内放置说明书，用条形码封小盒口；装箱。
100ml每一瓶装入纸箱，盒内放置说明书，再每10瓶装入一盒；用条形码封小盒口。
Ø装箱：
外箱用泡沫箱外套纸箱，20ml每箱放入49盒疫苗，并在包装箱外侧贴一张该产品的标签。
100ml每箱放入9盒疫苗，并在包装箱外侧贴一张该产品的标签。
Ø入库。
注：
批号设置、贴签印刷应符合《兽药瓶签、说明书的管理规定》
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4.10.7岗位定员和生产周期
岗位
人员
生产周期
分装
4
1/2天
压盖
3
1/2天
贴签装箱
3
2天
4.11油乳剂剂制造技术经济指标
序号
项目及计算
指标
1
分装率（%）=实际分装瓶数/理论分装瓶数*100%
100%±5%
2
合格率（%）=合格瓶数/实际分装瓶数*100%
≥99%
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4.12设备一览表
编号
工序
设备名称
型号
规格
数量
制造单位
1
活性成分制备
恒温培养箱
HW-2500
0-100℃
2
上海一恒科学仪器有限公司
2
恒温摇床
YC-120
0-65℃
1
上海一恒科学仪器有限公司
3
转瓶机
SHXJ-VI
1400*650*14000
4
南京博健科技有限公司
4
-70℃冰箱
HAIER
450L
1
青岛海尔集团
5
2-8℃冷库
装配
40m2
2
上海开灵制冷有限公司
6
-20℃冰库
装配
20m2
1
上海开灵制冷有限公司
7
脉动真空灭菌柜
YXQ-MG-225
2200*2000*2200
1
华菱医疗设备制造有限公司
8
脉动真空灭菌柜
YXQ-MG-208
2415*1200*1800
1
华菱医疗设备制造有限公司
11
干热灭菌柜
101A
1600*1800*2550
1
华菱医疗设备制造有限公司
12
灭活
灭活罐
YJ-2005
2000L
4
上海永巨制药设备有限公司
13
电子天平
YH-1000
0.0001
1
上海一恒科技有限公司
14
乳化
乳化泵
RH-2000
2000L
3
上海华东制药机械有限公司
15
分装
分装机
HD-2005
0-20ml
1
上海华东制药机械有限公司
16
分装机
HD-2005
0-100ml
1
上海华东制药机械有限公司
17
自动胶塞清洗机
CDDA-10
2370*1320*1880
1
上海欣丽实业有限公司
18
臭氧灭菌柜
KER-1000
1600*1800*550
1
康尔医药设备制造有限公司
19
包装
轧盖机
XF-2005
1375*755*1600
1
上海华东制药机械有限公司
20
贴签机
TLJ
1650*845*1200
1
上海华东制药机械有限公司
21
检验
恒温箱
HIHENG
650*445*550
1
上海一恒科技有限公司
4.13生物安全及劳动保护
4.13.1技术安全
1.上岗工人必须经过“生物安全及自我防护”培训。
2.生产过程中，各岗位必须严格按照工艺规程、岗位标准操作程序及设备标准操作程序操作，不得违反。
3.生产时必须在符合兽药GMP要求环境条件下进行。
4.每次生产更换批号（或品种和规格），各工序须清洗工具容器和场地，达到清场要求。
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5.各工序半成品容器加盖密封存放，放至半成品贮存间规定的地方，防止异物混入，并有明显标志（有卡片），按品名、规格、批号存放或设棚栏隔开。
6.机器设备有专人管理、维护、保养。
严格执行安全用电规定，经常检查电源、线路，防止漏电短路，电源要接地线，禁止湿手开掣；机电设备严禁带病运转，机器运行时，严禁用手伸入转动部位；禁止用水洗电机转轴及皮带轮防护安全罩，操作时不能站在与皮带轮同一线上。
7.随时检查燃气系统，应保持完好无损，以免发生事故，设备、设施应定期检查完好情况。
8.管道标志明显：
水管涂绿色，药液管涂黄色，蒸气管涂红色，严防漏气漏液。
高压容器、管道系统等应经劳动技术安全部门检测合格方能使用。
9.各工序均应配备防火设施和其他意外应急设施，每个员工都要学会使用灭火器材。
10.各岗位操作人员须经严格岗位培训并经考核合格，凭岗位合格证才能上岗独立操作。
非本岗位人员不能顶替上班。
当班人员不能随意离开岗位，严禁窜岗，必需离开时要有本岗位人员接替方能离开。
交接班应交接清楚，认真填写交接班记录。
11.各岗位上岗须按规定穿戴工作服、帽、鞋、手套。
特别是接触强酸、强碱，要穿戴防护衣、胶手套、水鞋及防护镜，避免酸、碱液溅到身上。
万一被溅上皮肤，立即用大量水冲洗。
4.13.2劳动保护
1．上班人员均要按规定穿戴工作服、帽、鞋、防护手套等劳保用品。
2．使用显微镜的人员严格执行中休、班休制度，每年检查视力一次。
◆员工每年进行健康检查一次。
建立健康档案。
4.14物料
4.14.1注射用水的质量标准及检验
1）性状：
本品为纯化水经蒸馏所得的无色的澄明液体；无臭，无味。
2）检查
a :
pH值 :
应为5.0～7.0（附录ⅥH）。
b :
氨
取本品50ml，照纯化水的方法检查，
注：
对照用氯化铵溶液改为1.0ml，应符合规定（0.00002％）。
c :
细菌内毒素
取本品，依法检查（附录ⅪE），每1ml中含内毒素量应小于0.25EU。
d :
氯化物、硫酸盐与钙盐、硝酸盐与亚硝酸盐、二氧化碳、易氧化物、不挥发物与重金属
照纯化水的方法检查，应符合规定。
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4.14.2小牛血清
名称：
牛血清
质量标准：
2005年版《中华人民共和国药典》三部附录
供应商：
上海微科生化试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.14.3营养液
名称：
MEM
质量标准：
HG/T3935-2007
供应商：
清大天一生物科技有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.14.4磷酸钠
名称：
磷酸钠
质量标准：
HG/T2968-1999
供应商：
国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.14.5磷酸氢二钾
名称：
磷酸氢二钾
质量标准：
HG-T3487-2000
供应商：
国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.14.6磷酸氢二钠
名称：
磷酸氢二钠
质量标准：
GB1263—2006
供应商：
国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.14.7胰酶
名称：
胰酶
质量标准：
GB/T21498-2008
供应商：
国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.14.8D-氨基葡萄糖
名称：
D-氨基葡萄糖
供应商：
Sigma（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
题目 :
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4.14.9无水氯化钙
名称：
无水氯化钙
质量标准：
HG/T2327-92
供应商：
国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.14.10苯酚红
名称：
苯酚红
质量标准：
GB/T15351-94
供应商：
国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.14.11佐剂
名称：
15AVG佐剂
质量标准：
供应商：
法国SEPPIC公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.14.12EDTA
名称：
乙二胺四乙酸二钠（250g）
质量标准：
GB12593-2007
供应商：
国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.14.13乙醇
名称：
乙醇
质量标准：
中国药典，2000年版。
供应商：
国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.15成品质量标准
4.15.1物理性状
Ø外观本品为粉白色乳状液。
Ø剂型水包油型。
Ø稳定性取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心30分钟，管底析出的水相应不大于0.5ml。
Ø粘度用1ml吸管（出口内径1.2mm），吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流下，记录流出0.4ml所需的时间，应在4秒以内。
4.15.2无菌检验
应无菌生长。
题目 :
猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）工艺规程
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4.15.3安全检验
Ø用30～40日龄健康易感仔猪（IPMA法检测PCV2抗体效价，应低于50）5头。
各深部肌肉注射疫苗2ml。
连续观察14日。
接种前1日及接种后逐日测定体温，每日上、下午各测定1次。
应不出现体温升高，或仅于接种次日体温升高不超过1℃，在观察期内应不出现由疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应。
4.15.4效力检验
下列方法任择其一。
（1）抗体检测用30～40日龄健康易感仔猪（IPMA法检测PCV2抗体，应低于50，见附注1）10头，随机等分成2组。
其中一组分别经颈部肌肉注射途径接种疫苗1ml，21日后，以相同剂量和途径加强免疫1次；另一组不接种疫苗，作为对照组。
二免后14日采集血，分离血清，用IPMA法（见附注1）检测血清抗体效价。
免疫猪应至少4头抗体效价不低于800，对照猪抗体效价均应低于50。
（2）免疫攻毒二免后14日，取上述免疫猪和对照猪，用PCV2LG株强毒攻击，通过滴鼻和肌肉注射途径各接种1ml（105.0TCID50）。
称取攻毒当日体重。
攻毒后28日，将所有猪称重后扑杀，取腹股沟淋巴结样品，采用荧光定量PCR法（见附注2）检测病毒核酸载量。
相对增重率（见附注3）应不低于5%；免疫猪应至少4头病毒核酸载量不高于3.5×107拷贝/g组织，对照猪应至少4头病毒核酸载量不低于1.45×109拷贝/g组织。
4.15.5甲醛含量测定
应不超过0.2%。
4.16贮藏和有效期
2-8℃保存，18个月
4.17包装材料要求
4.17.1标签
名称：
猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）标签
质量标准：
80克铜板纸，内容符合《兽药瓶签、说明书的管理规定》
尺寸：
24mm×60mm，39mm×98mm
供应商：
上海郑盛印务有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.17.2塑料瓶
名称：
外用液体药用高密度聚乙烯瓶
质量标准：
符合《中华人民共和国药品管理法》和《药品包装用材料和容器管理办法》
尺寸：
20mm
供应商：
沧州维康食品药品包装有限公司，江阴恒利源包装材料有限公司（或经公司批准的其他符合规
定的厂家）
题目 :
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编号:
SC-TS-02-218
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4.17.3铝塑盖
名称：
铝塑盖
质量标准：
符合《中华人民共和国药品管理法》和《药品包装用材料和容器管理办法》
尺寸：
d:
2cm,h:
1cm
供应商：
洛阳豫洛瓶盖有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.17.4胶塞
名称：
丁腈橡胶塞
质量标准：
Q/HT006-2007 ;符合《中华人民共和国药品管理法》和《药品包装用材料和容器管理办法》
尺寸：
Φ20mm
供应商：
湖北应城市恒天药业包装有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.17.5外包装箱
名称：
纸箱
质量标准：
符合《中华人民共和国药品管理法》和《药品包装用材料和容器管理办法》
尺寸：
610mm×346mm×410mm;440mm×342mm×420mm;375mm×286mm×318mm
供应商：
上海御风包装材料有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）
4.17.6保温箱
名称：
泡沫保温箱
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