发酵工程复习题Word下载.docx
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醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌、乳酸杆菌、乳链球菌、枯草芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌、大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌
酵母菌：
酿酒酵母、假丝酵母属（产朊假丝酵母、解脂假丝酵母、热带假丝酵母）、毕赤酵母属、汉逊酵母属
霉菌：
曲霉属（米曲霉、黑曲霉）、青霉属（青霉菌、桔青霉）、根霉属（德氏根霉、米根霉、小麦曲根霉）、红曲霉属（紫红曲霉）
放线菌：
链霉菌属、小单孢菌属、地中海诺卡氏菌
2、发酵工业菌种选择的总趋势？
野生菌→变异菌自然选育→代谢控制育种诱发基因突变→基因重组的定向育种
3、菌种选择的要求？
A、能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；
B、生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；
C、培养条件易于控制；
D、抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
E、菌种不易变异退化；
F、对放大设备的适应性强；
G、菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。
4、工业菌种来源途径？
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；
生产中长期使用的菌种的定期分离筛选从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株；
从保藏机构获取菌种；
从已知菌种和大自然中分离新菌株；
寻找新的发酵产品的产生菌；
寻找老产品的新的优良菌株
5、工业用新菌株分离、筛选的步骤？
调查研究→设计实验方案→含微生物样品采样→样品预处理→菌种分离→菌种纯化→复筛→纯化→再复筛→选出较优菌株→保藏
1、工业上对菌种选择有何要求？
A菌种不能是病原菌，不能产生任何有害的生物活性物质或毒素，确保其安全性。
B在较短的发酵周期内产生大量的发酵产物
C在发酵过程中不产生或少量产生余目标产品性质相近的副产物及其他产物，可提高营养物质的转化率，减少分离纯化的难度，降低成本，提高产品的质量。
D生长繁殖能力强，生长、反应速度快，发酵周期短，产孢菌应具有较强的产孢子能力
E原料来源广，价格低廉，菌种能高效地将原料转化为产品
F对需要添加的前体物质有耐受能力，并不能将前体作为一般碳源利用
G菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体能力强，以保证生产的稳定性
2、新菌种的分离、筛选的步骤及注意事项？
步骤：
调查定方案、采样、样品预处理、分离（选择性分离和随机分离）、发酵性能测定、筛选：
预处理、初筛、平板培养找到目的菌落、筛选产物高菌株
3、选择性分离法和随机分离法的原理及应用对象举例？
选择性分离：
根据菌种选择性特征（营养特征或生长特征）独特进行分离。
控制营养成分控制培养基酸碱度、添加抑制剂、控制培养温度、控制通气条件。
随机分离：
无选择性特征。
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。
（抗生素产生菌的筛选、生长因子产生菌的筛选）
4、简述平板复印法和铺菌法分离微生物的原理？
5、发酵工业菌种改良的目的及常用方法？
目的：
提高目标产物的产量；
提高目标产物的纯度，减少副产物；
改良菌种性状，改善发酵过程；
改变生物合成途径，以获得高产的新产品。
常用方法：
常规育种（诱变育种）、细胞工程育种、基因工程育种、代谢工程育种
6、诱变育种的主要流程及应注意的问题？
注意问题：
A选择合适的出发菌株，合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌株。
B复合诱变剂的使用，
7、诱变育种中淘汰野生型菌株和检出营养缺陷型菌株的主要方法及原理淘汰野生型菌株的方法有：
抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。
抗生素法：
A青霉素法（细菌），其基本原理是青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，因而能杀死生长繁殖的细菌，但不能杀死处于休止状态的细菌。
将诱变后的细菌培养在含有青霉素的基本培养基中，可淘汰大部分生长繁殖活跃的野生型细胞，从而达到“浓缩”营养缺陷型细胞的目的。
B制霉菌素法（真菌），制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起细胞膜的损伤，因为它只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌，所以也可用于淘汰相应的野生型菌株和“浓缩”营养缺陷型菌株。
菌丝过滤法:
适用于丝状生长的真菌或放线菌。
其原理是：
在基本培养基中，野生型的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。
因此，可将诱变剂处理后的孢子在基本培养基中培养一段时间后，再用擦镜纸等合适滤纸过滤。
重复数次后，就可去除大部分野生型个体，达到了“浓缩”营养缺陷型的目的。
营养缺陷型菌株的检出方法有：
逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。
夹层培养法：
先在培养皿上倒一薄层不含菌的基本培养基，待冷凝后加上一层混有经过诱变处理的菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基，使之成为“三明治”状。
经培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底上。
然后，再在皿内倒上一薄层第四层培养基--完全培养基。
再经培养后所出现的形态较小的新菌落，多数是营养缺陷型。
限量补充培养法：
把诱变处理后的细胞接种在含有微量（0.01％以下）蛋白胨的基本培养
基上，野生型细胞就迅速长成较大的菌落；
而营养缺陷型则在生长缓慢，并只能形成微小的菌落。
同样，如果想得到某一特定缺陷型菌株，也可直接在基本培养基上加入微量的相应物质。
逐个检出法：
把经诱变处理后的细胞涂布在平板上，待长成单个菌落后，用接种针或灭过菌的牙签把这些单个菌落逐个依次的分别接种到基本培养基和另一完全培养基上。
经培养后，如果在完全培养基的某一部位上长出菌落，而在基本培养基的相应位置却不长，说明这是一个营养缺陷型突变株。
8、菌种退化的原因及控制措施？
菌种的衰退是由于微生物细胞内的DNA结构发生了变化，从而使由DNA决定的性状发生相应的变化，引起退化主要有原因：
A、营养与环境条件引起的退化，菌种
连续传代是菌种发生衰退的直接原因；
B、自身突变（负突变）引起的退化，
菌种的自身突变和回复突变是引起菌种自身退化的主要原因。
控制措施：
A控制传代次数B选择合适的培养条件
C利用不同类型的细胞进行传代D选择有效的菌种保藏方法
9、常用的菌种保藏方法及应用对象
斜面低温保藏法：
细菌、酵母菌、霉菌、放线菌液体石蜡油封保藏法：
酵母菌、霉菌、放线菌、好氧细菌载体吸附保藏法：
耐干燥菌种如产孢子的丝状真菌、放线菌或产芽孢的细菌真空冷冻干燥保藏法：
除不产孢子的丝状真菌外的绝大部分微生物
液氮超低温保藏法：
各种微生物的保藏，尤适用于其他方法不理想、不产孢子的菌丝体
第三章
1、培养基的分类：
孢子培养基：
供制备孢子用
种子培养基：
满足菌种生长
发酵培养基：
满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累
2、培养基的组成：
碳源：
凡能提供微生物营养所需碳素的物质即为碳源（糖类、油脂、有机酸、烃类戒低碳醇）。
功能：
为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分；
为合成目的产物提供所需的碳成分。
氮源：
凡能提供微生物生长繁殖及产物合成所需氮元素的营养物质即为氮源（有机氮源：
黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、玉米浆等；
无机氮源：
铵盐、硝酸盐、氨水）。
功能：
构成菌体细胞物质和含氮代谢物。
无机盐和微量元素：
微生物在生长繁殖和产物合成过程中，需要某些无机盐和微量元素（如镁、磷、钾、钠、铁等）作为微生物的生理活性物质的组成或活性作用的调节物。
生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物，通常低浓度促进，高浓度抑制。
水：
功能，A作为溶剂，起到运输介质作用；
B参与细胞内一系列生化反应；
C维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定度天然构象；
D控制细胞内的温度；
E维持细胞自身正常形态；
F微生物通过脱水作用与水合作用控制由多压机组成的结构
生长调节物：
（一）生长因子：
广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子（又称
生长素），包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；
狭义说，生长素仅指维生素。
玉米浆、麸皮水解液、糖蜜、酵母等
（二）前体：
指加到发酵培养基中的某些化合物，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因其加入而有较大的提高。
（三）促进剂：
细胞生长非必需，但加入后却能提高产量的添加剂,称为促进剂。
※3、培养基成分选择的原则
A菌体的同化能力,
B代谢的阻遏和诱导
C合适的C、N比
D合适的Ph
第四章
1、连续灭菌的流程与设备
设备：
（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到，以免连续灭菌时由于料液与蒸
汽温度相差过大而产生水汽撞击声；
（2）连消塔：
用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度
（1）；
3）维持罐：
使料液在灭菌温度下保持。
因为：
连消塔加热的时间很短，光靠
这段时间的灭菌是不够的；
4）冷却管：
使料液冷却到后（冷水喷淋），输送到预先灭菌过的罐内。
流程：
无菌培养基
进发酵罐
※2、对数残留定律对数残留定律：
在一定温度下，微生物受热死亡的速率与任何瞬间残留的活菌数成正比
3、湿热灭菌的原理及缺点？
原理：
由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。
缺点：
会破坏培养基中的营养成分，甚至会产生不利于菌体生长的物质。
因此，在工业培养过程中，除了尽可能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可能减少培养基中营养成分的损失。
4、培养基在使用湿热灭菌时，灭菌温度与灭菌时间及对培养基营养成分的影响关系？
结论1：
当灭菌温度上升时，微生物杀死速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加
结论2:
在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。
5、湿热灭菌时，培养基灭菌时间的计算方法
㏑（Ct/C0）=－ktt=2.303/k[lg（C0/Ct）]
式中：
C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后的含菌数。
6、分批灭菌、连续灭菌优缺点？
连续灭菌
优点：
1.高温短时灭菌，培养基营养成分损失少。
2.发酵罐占用时间缩短，利用率高。
1.设备复杂，操作麻烦,染菌机会多。
2.不适合含大量固体物料的灭菌。
分批灭菌：
1.设备要求低，不需另外加热、冷却装置。
2.操作要求低，适合小批量生产规模
3.适合含大量固体物料的灭菌
1.培养基的营养物质损失大，灭菌后培养基质量下降
2.发酵罐的利用率较低
3.不适合大规模生产的灭菌
7、影响灭菌的主要因素有哪些？
杂菌的种类与数量
灭菌温度与时间
培养基成分
pH值
培养基中的颗粒
泡沫
1、简述空气两级冷却、加热除菌净化的流程及相关设备
1-粗过滤器；
2-空压机；
3-贮罐；
4，6-冷却器；
5-旋风分离器；
7-丝网分离器；
8-加热器；
9-过滤器
2、简述介质过滤除菌的原理及介质过滤除菌的必要性
深层介质过滤的原理：
微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层阻碍，使气流出现
无数次改变运动速度和方向的绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。
3、空气压缩后压力与温度的关系
T2=T1（P2/P1）（k-1）/k
式中T1,T2——压缩前后空气的绝对温度，KP1,P2——压缩前后空气的绝对压强，Pak——绝热指数，空气为1.4
若压缩为多变过程，则可用多变指数m（对于空气m=1.2-1.3）代替绝热指数k。
第五章
1、什么种子？
优良种子应具有哪些特点？
种子是指进入发酵罐之前的纯的微生物。
优良种子应具备的条件：
生长活力强，延迟期短；
生理状态稳定；
浓度及总量能满足发酵
罐接种量的要求；
无杂菌污染，保证纯种发酵；
适应性强，生产能力稳定。
2、简述工业发酵生产中种子制备的流程
※步骤：
A斜面培养基中活化；
B扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备
C一级种子罐，制备生产用种子；
视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；
D种子转种至发酵罐
3、如何确定种子扩大培养级数及发酵级数？
种子扩大的级数：
制备种子需逐级扩大培养的次数。
确定方法：
菌种的性质（如菌种传代后的稳定性）；
瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度；
发酵罐中种子培养液的最低接种量；
种子罐与发酵罐的容积比；
生产规模；
随工艺条件的改变作适当的调整。
4、种子质量评价及影响种子质量的因素有哪些？
种子质量的判断方法：
通常检测的培养液中参数（pH是否在种子要求的范围之内；
糖、氨基氮、磷酸盐的含量；
菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观；
有无杂菌污染、有无噬菌体污染），其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾气等。
影响种子质量的因素：
原材料质量、培养温度、湿度、通气与搅拌、斜面冷藏时间、培养基、pH
5、接种量对发酵结果可能有哪些影响？
不同的微生物应如何选择接种量？
接种量过多：
菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足种量过少：
延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌。
接种量以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据，接种量的大小直接影响发酵周期。
6、细菌与霉菌的种子制备流程及级数一样吗？
为什么？
细菌培养物的制备：
细菌斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。
牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源
细菌培养温度的大多数37℃，少数为28℃
细菌菌体培养时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培养5～10天霉菌孢子的制备：
霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。
这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。
霉菌的培养一般为25～28℃，培养时间为4～14天。
1、发酵过程控制的主要因素及其对发酵结果的影响？
因素
生物因素:
菌株特性（营养要求、生长速率、呼吸强度、产物合成速率）
外部环境因素:
a设备性能传递性能
b工艺条件:
物理：
AFR、T、Ms
化学：
pH、DO、基质浓度
影响最佳工艺条件的优选（即最佳工艺参数的确定）以及在发酵过程中通过过程调节达到最适水平的控制。
2、发酵过程中可以直接和间接检测的参数分别是什么？
对传感器的要求？
直接参数：
如T、pH、罐压、空气流量、搅拌转速、溶氧浓度等
间接参数：
将直接参数通过公式计算获得的如摄氧率（γ、）呼吸强度（QO2）、比生长速率
（μ）、体积溶氧系数（KLa）、呼吸商（RQ）等。
对传感器要求：
能经受高压蒸汽灭菌；
传感器及其二次仪表具有长期稳定性；
最好能在过程中随时校正，灵敏度好；
探头材料不易老化，使用寿命长；
安装使用和维修方便；
解决探头敏感部位被物料（反应液）粘住、堵塞问题；
价格合理，便于推广。
3、发酵过程中影响pH和溶解氧变化的主要因素是什么？
如何控制？
Ph:
主要因素下降阶段：
碳氮比过高，或中间补糖过多，或油脂类碳源过多糖类、脂肪等分解，产生酸性物质生理酸性盐的利用。
上升阶段：
碳氮比过低，或碳源过多，氨基氨释放中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多蛋白质、尿素等分解，产生碱性物质生理碱性盐的利用。
控制
1调节培养基的原始Ph，或加入缓冲剂制成缓冲能力强的培养基；
2培养过程中家如基质性酸碱调节剂；
3培养过程中加入非营养基质的酸碱调节剂；
4合理控制发酵条件，尤其是通过调节通气量来控制PH；
5
通过补料调节培养液的PH。
溶解氧
影响耗氧的因素:
Y菌种特性、培养基成分和浓度、菌龄、培养条件（T、pH）、
代谢类型
溶解氧控制的一般原则：
生长阶段：
即可产物合成阶段：
即可过高的溶氧水平反而对菌体代谢有不可逆的抑制作用控制方法
溶氧和补糖控制系统溶氧和pH控制的系统供氧方面：
提高氧分压（氧分含量），即，提高供氧能力改变搅拌转速：
通过改变KLa来提高供氧能力通气速率Ws↑：
Ws增加有上限，引起“过载”、泡沫
提高罐压：
，但同时会增加CO2的溶解度，影响pH及可能会影响菌的代谢，另外还会增加对设备的强度要求
4、pH对菌体生长和产物合成的影响？
生长影响
pH对生长的影响机制
对E合成的影响
对E活性的影响
对ATP生产率影响：
影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜的渗透性的变化，因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的分泌。
影响培养基某些重要营养物质和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用
产物合成影响
产物合成阶段的最适pH值和微生物生长阶段的最适pH往往不一定相同，这不仅与菌种特性有关，还取决于产物的化学特性。
pH影响代谢方向：
pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。
pH对青霉素发酵的影响：
在不同pH范围内加糖，青霉素产量和糖耗不一样。
5、最适发酵温度、呼吸强度、临界溶氧浓度、最适溶氧浓度、波谷现象等概念。
最适发酵温度：
最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的生成，它是一种相对概念，是在一定条件下测得的结果。
呼吸强度：
是指单位重量的干菌体每小时消耗的氧量，单位为mmol（O?
）/[g（干菌体）
临界溶氧浓度：
指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度。
最适溶氧浓度：
溶氧浓度对产物合成有一个最适范围，CL过高或过低，对合成都不利波谷现象：
批式发酵无DO控制情况下，溶氧变化规律为“波谷现象”
6、溶解氧的高位平衡和低位平衡分析，其分别处于微生物生长的什么时期？
生长和生产阶段对溶解氧浓度的一般原则？
7、泡沫产生的原因、危害及控制方法？
原因
（1）由外界引进的气流被机械地分散形成
（2）由发酵过程产生的气体聚结生成的发酵泡沫
（3）发酵液中糖、蛋白质和代谢物等的存在起到加强或稳定泡沫的作用危害
1）使发酵罐的装填系数减少
（2）造成大量逃液，导致产物损失（3）增加了染菌的机会
（4）增加了菌群的非均一性（5）消泡剂的加入给提取工序带来困难控制方法
机械消沫
化学消沫（消沫剂消沫）
8、碳源、氮源种类选择的原则及发酵过程中补料的依据？
碳源
种类：
葡萄糖
吸收快，利用快，能迅速参加代谢合成菌体和产生能量缺点：
有些品种产生分解产物阻遏效应。
种类：
淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油优点：
不易产生分解产物
阻遏效应。
有利于延长次级代谢产物的分泌期
溶解度低，发酵液粘度大。
补糖依据
残糖量
pH值
X指发酵液的菌体浓度，单位为（g干菌体/L）
粘度
溶氧
尾气中O2和CO2的含量发酵液的总体积
氮源
1.补加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源，如酵母粉、玉米浆、尿素等。
2.补加氨水或硫酸铵等无机氮源
当pH偏低又需补氮时，可通入氨气；
当pH偏高又需补氮时，可加入生理酸性物质如硫酸铵等。
补氮的依据：
残氮量、pH值、菌体量
9、微生物生长和次级代谢对磷源的需求有何不同？
微生物生长菌体生长所允许的磷酸盐浓度比次级代谢产物合成所允许的浓度大得多，两者平均相差几十至几百倍。
10mmol的磷酸盐就明显地抑制次级代谢产物的合成。
次级代谢磷酸盐对初级代谢产物合成的调节往往是通过促进生长而间接产生的，对次级代谢产物生物合成的调节有多种可能的机制。
第八章
1、发酵工程下游技术包括哪些内容？
经过了菌种选育、发酵生产之后，得到了发酵产物。
微生物工程产品的生产中，分离和纯化是最终获得商业产品的重要环节，相对于菌种选育
和发酵生产这些上游技术，分离纯化技术被称为下游加工工程
3、细胞破壁的技术种类？
4、什么是盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、凝胶过滤、离子交换层析和离子交换层析？
盐析
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离
有机溶剂沉淀
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。
等电点沉淀利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。
凝胶过滤凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。
当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；
相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。
中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。
这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。
离子交换层析
离子交换层析（IonExchangeC
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