10基地班基因工程习题与考纲Word格式文档下载.docx
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基因工程中的应用：
应采用缺少限制作用的菌株作为受体。
限制性内切酶含义及其类型
一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA双链结构的内切核酸酶。
类型：
已鉴定出的限制性内切核酸酶可分为4种不同类型：
I型酶（TypeI）、II型酶（TypeII）、III型酶（TypeIII）和IV型酶（TypeVI）。
限制性内切酶II为何是DNA重组技术中最常用的工具酶？
它具有哪些特性？
II型限制性内切核酸酶只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在，其识别和切割DNA分子具有严格的特异性。
①识别序列的特异性：
识别序列为4-6bp的双重螺旋对称结构的回文序列
②切割位点的特异性：
在识别序列处特异地切割双链DNA分子，水解磷酸二酯键，产生3’端羟基、5’端磷酸基团的DNA片段。
同切点酶、同尾酶的含义及其在基因工程中的应用
同切点酶：
又称同裂酶，是一类来源于不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。
基因工程中可以利用用同裂酶对甲基化位点的敏感性不同进行同样的切割，产生不同或相同的末端。
同尾酶：
来源不同，识别靶序列也不同，但切割后能产生相同的黏性末端的限制性内切核酸酶。
同尾酶可便于克隆载体的改造和构建，且可用于消除某些限制酶切点，但如果要回收重组克隆中的插入片段时，则要慎重选择适当的同尾酶。
限制性内切酶的星活性及其在使用过程中如何加以避免
酶的星号活性（staractivity）：
限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。
当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。
应该避免：
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，尽量遵循生产商推荐的反应条件。
DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化含义及其应用
完全酶切消化：
内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。
部分酶切消化：
内切酶在DNA上的所有位点只有部分被切开。
在实验中，通常通过缩短酶切消化的反应时间或降低反应温度以约束酶的活性以达到部分消化的目的。
根据DNA重组设计的需要，特异性地创造部分酶切的条件，可以获得需要的DNA片段，例如，在构建真核生物大片段插入基因组文库时，需要对基因组DNA进行随机的部分消化，才能得到一系列相互重叠的片段。
DNA连接酶含义及其催化的连接反应特点有哪些
DNA连接酶（DNAligase）：
是能催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。
连接反应特点：
1.连接反应需要在一条DNA链的3’末端具有一个游离的羟基、而另一条DNA链的5’末端具有一个游离的磷酸基团，才能发挥其连接DNA分子功能；
2.连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活因子；
3.DNA连接酶只能连接缺口，不能连接裂口；
4.被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分，不能够连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子。
大肠杆菌DNA聚合酶I有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值？
（1）5'
→3'
聚合酶活性
大肠杆菌DNA聚合酶I的聚合酶活性是以DNA为模板，利用体系中的4种脱氧核糖核苷（dNTP），催化单核苷酸分子加到引物的3'
-OH末端，沿5'
合成与模板互补的另一条DNA链。
（2）3'
→5'
外切酶活性
大肠杆菌DNA聚合酶I的3'
外切酶活性是沿3'
方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸，这种外切酶活性在体内DNA复制时主要起校对作用。
（3）5'
→3'
大肠杆菌DNA聚合酶I的5'
外切酶活性，是从5'
端降解双链DNA分子。
它也可以降解DNA:
RNA杂合体中的RNA分子，即具有RNA酶H的活性。
用途：
1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）（3'
外切酶活性）
2）补齐5’-突起端（5'
聚合酶活性）
3）合成第二条cDNA
4）切口移位制备探针（5'
外切酶活性）
Klenow片段和DNApolyI有何异同
大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow片段。
Klenow片段仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。
DNApolyI具有以上三种的酶活性。
为什么说反转录酶是一种特殊的DNA聚合酶，其主要作用是什么
反转录酶普遍存在于含RNA的反转录病毒中，它以RNA为模板，催化合成互补的DNA（complementaryDNA，cDNA）单链，进而合成DNA第二条链。
它具有合成DNA的功能，但是所用的模板是RNA，所以是一种特殊的DNA聚合酶。
主要作用：
1.以mRNA为模板合成其互补DNA（cDNA），用于构建cDNA文库和基因克隆；
2.对具5’端突出的DNA片段的3’端进行补平和标记，制备杂交探针；
3.代替大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段或测序酶，用于DNA序列分析。
末端脱氧核苷酸转移酶、T4多核苷酸激酶以及碱性磷酸酶的含义及其在基因工程中的应用
末端脱氧核苷酸转移酶：
简称末端转移酶，一般从小牛胸腺中提取的一种碱性蛋白，是一种在不需要模板的情况下将脱氧核苷酸添加到DNA分子的3'
-OH末端的酶，催化过程中伴随无机磷酸的释放。
末端转移酶主要用途有：
（1）用于克隆DNA片段；
（2）用于DNA片段3‘末端标记；
（3）按照模板合成多聚核糖核苷同聚物
T4多核苷酸激酶：
T4多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基转移到DNA或RNA的5'
－OH末端，使已脱磷酸化的5'
末端重新磷酸化。
应用：
1.标记DNA或RNA的5'
末端；
2.在DNA分子连接时，对缺乏5'
磷酸基团的DNA片段或人工合成接头进行磷酸化处理。
碱性磷酸酶：
碱性磷酸酶能够催化核酸分子脱掉5'
的磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5'
－P末端转换成5'
－OH末端。
碱性磷酸酶在基因工程中的用途：
1.DNA分子片段5'
末端的去磷酸化，防止自身连接；
2.在5'
末端标记之前，去除DNA或RNA分子的5'
末端磷酸基团。
核糖核酸酶H的含义及其应用
核糖核酸酶H（RNaseH）催化DNA:
RNA杂合链中的RNA部分的内切降解作用。
1.（特异地降解DNA）改为能特异地降解DNA:
RNA杂合链中的RNA部分；
2.在分子克隆中，RNaseH主要用于与大肠杆菌DNA聚合酶I和DNA连接酶一起参与cDNA克隆中cDNA的第二条互补链的合成。
3.通过反义寡聚DNA与RNA产生局部的RNA:
DNA双链体，诱发特异性的RNA降解，从而有效地对特定基因的表达进行调控。
如何正确利用各种核酸酶从mRNA获得双链cDNA
第三章
载体的含义及其功能类型
能携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具就称为载体（vector）。
功能类型：
1.运送外源基因高效转入受体细胞；
2.为外源基因提供复制能力或整合能力；
3.为外源基因的扩增表达提供必要的条件。
克隆载体的基本条件及其主要类型
克隆载体是用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体。
必须满足如下基本条件：
具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；
能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；
具有由单一限制性内切核酸酶识别位点组成的多克隆位点（MCS），可供外源基因的插入；
具有合适的选择性标记，用于含有重组质粒的宿主细胞筛选。
主要类型：
质粒载体；
噬菌体载体；
噬菌体—质粒杂合载体；
人工染色体
根据质粒在宿主细胞中的拷贝数，可将质粒的复制方式分为哪些类型，在应用上有何区别？
根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，可分为：
“严紧型”复制控制质粒（拷贝数少，为1-5个）和“松弛型”复制控制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。
作为载体的质粒应该是松弛型的。
质粒的不相容性的含义：
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒一般不能够在同一宿主细胞中稳定共存。
天然质粒往往需要哪些方面的改造才能成为合适的克隆载体
1.选择合适的复制起始位点，为了使构建的质粒克隆载体能在受体细胞有效复制，需要改变复制起始位点，一般选择组装松散型质粒复制起点；
2.加入合适的选择标记基因；
3.增加或减少酶切位点。
增加由多种单一限制性核酸内切酶识别序列的多克隆位点，减少部分重复的限制性内切酶识别位点。
4.缩短长度，小分子质量的质粒转化效率较高。
指出常用质粒载体pBR322与PUC18之间的差异，并列出pUC18载体的优点
差异：
1、pUC18的复制起点来自突变的pMB1，缺乏控制拷贝数的rop基因；
2、pUC18保留了pBR322氨苄青霉素抗性基因（ampr）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的限制性内切核酸酶的识别位点。
3、pUC18含有lacZ’基因，在特定的受体细胞中可表现α—互补作用，形成的蓝、白菌落可用于筛选重组质粒。
4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。
（删除：
但它并不破坏该基因的功能。
）
pUC18载体的优点：
1、具有较小的分子量和更高的拷贝数;
2、适用于组织化学检测重组体（蓝白斑试验）3、具有多克隆位点MCS区段适于具有不同黏性末端的外源片断的插入。
TA载体的含义及其应用
含义：
是一种5′端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶（T）线性质粒载体。
用该载体可进行PCR产物的直接克隆。
λ噬菌体载体类型及其应用上的差别
插入型载体和替换型载体。
插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆；
替换型载体则可以承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。
cosmid载体由哪些要素组成，如何使用该载体？
Cosmid克隆载体由质粒和含有cos位点的λDNA片段所组成，大小一般在5-7kb，包括质粒的复制起点、抗性标记基因、多克隆位点和λDNA的cos位点。
使用：
限制性内切酶酶切真核DNA和cosmid质粒；
体外连接酶切片段DNA；
体外包装重组DNA；
转染大肠杆菌；
DNA－cos杂种分子通过cos位点环化，并按质粒方式进行复制和表达其抗药性记号；
筛选转化子。
（p47第一段，课本重点写了如何体外包装重组DNA）
表达载体的含义及其主要类型
能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。
这类载体既有复制子，更要有强启动子。
1.质粒表达载体2.病毒表达载体3.大片段表达载体
原核表达载体包括哪些表达元件，各有何作用
元件
作用
启动子
【启动子是与RNA聚合酶特异性结合的DNA序列，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。
启动子本身并不控制基因活动，而是通过与转录因子结合而控制基因活动的。
】
（来自XX百科，课本中只有例子P50）
转录终止子
稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性，转录终止子一般在多克隆位点的下游。
核糖体结合位点
转录出的mRNA必须借助宿主细胞的蛋白质合成系统翻译出目的蛋白。
细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效核糖体结合位点以及其中的SD序列，从而启动临近的翻译起始密码子的蛋白质翻译。
穿梭载体的含义，为什么说真核表达载体多为穿梭载体
穿梭载体：
指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的载体。
因为真核表达载体（如酵母表达载体既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制），这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列（ARS）以及选择标记性状。
Ti质粒表达载体的含义以及双元Ti质粒表达载体的使用程序
是一种利用T-DNA可携带外源DNA并整合到植物基因组的特性，经对天然Ti质粒的改造，构建用于植物遗传转化的表达载体，分为一元表达载体和双元表达载体等类型。
首先要将外源基因构建到微型Ti质粒上，再将微型Ti质粒转入含有辅助Ti质粒的根癌农杆菌菌株中，用该菌株侵染植物组织，含有目的基因的T-DNA可整合到植物基因组中。
（p54）
RNAi的含义以及转基因RNAi载体和VIGS载体结构上有哪些不同
RNAi（RNA干扰）含义：
利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。
转基因RNAi由启动子、SiRNA正义链模板、间隔区、SiRNA反义链模板和终止子构成。
VIGS为由siRNA驱动，siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物结合后，特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合，并降解RNA模板。
第四章
凝胶电泳的含义及其影响因素
凝胶电泳：
以凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等）为支撑物的区带电泳。
琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持物，在适当的条件下对带电生物大分子进行电泳的技术，主要用于DNA分子的分离、纯化和鉴定。
凝胶电泳中影响DNA分子泳动的因素很多，主要有DNA分子特性和电泳条件两个方面
1）DNA的大小：
双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比
2）DNA的构象：
超螺旋环状＞线状＞切口环状。
3）凝胶浓度：
浓度越低，相同核酸分子迁移越快
4）凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭：
溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。
5）所用的电压：
低压时DNA迁移率与所用的电压成正比
6）电泳缓冲液：
常用的有TAE、TPE及TBE
聚丙烯酰胺凝胶电泳与脉冲电场凝胶电泳的含义以及二者之间的主要差异（黑体字）
聚丙烯酰胺凝胶电泳：
聚丙烯酰胶凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的垂直板凝
胶电泳，可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别分离物质。
聚丙烯酰胺凝胶既具有
分子筛效应，又具有静电效应，其分辨力高于琼脂糖凝胶电泳，适用于低分子DNA（1-1000
bp）、寡聚核苷酸和白质的分离，可分离只相差一个核苷酸的不同DNA片段，是DNA序列
分析中的关键技术之一。
脉冲电泳：
是一种交替变换电场方向的电泳，以一定的角度并以
一定的时间变换电场的方向，使DNA在微观上按“Z”字形向前泳动，从而达到分离相对分
子量大的DNA片段的目的，可区分长度为50kb或100kb以上，甚至Mb级的大片段
DNA。
（脉冲电泳是以琼脂糖凝胶作为支持介质）
核酸分子杂交的含义及其意义
核酸分子杂交：
具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。
意义：
通过检测是否存在某一段序列达到重组子鉴定、基因分离、DNA片段分析、基因表达研究等的研究，是基因工程技术之一。
如何采用切口平移法均匀标记探针
先用DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I5’→3’外
切酶活性，在缺口处按5’→3’方向切除单核苷酸；
同时DNA聚合酶I有5’→
3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。
随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。
DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。
在核酸分子杂交中，非放射性标记物有哪些，如何进行检测
非放射性标记物：
生物素、地高辛、辣根过氧化物酶。
如何进行检测：
生物素标记的dUTP可取代dTTP而被整合进DNA探针，被生物素标记的探针可特异地与抗生物素蛋白结合。
抗生物素蛋白上结合的碱性磷酸酶可使反应中的底物产生颜色，从而显示探针所在的位置。
被地高辛（DIG）标记的探针可与抗DIG的抗体结合，通过酶联免疫反应来完成DIG标记的检测，从而实现目标分子的检测。
（其原理类似生物素标记检测）
被辣根过氧化物酶（HRP）标记的探针与待测DNA杂交并清洗后，加入显色底物，HRP可使无色底物显色，因此可定位目的序列。
Southern杂交与Northern杂交的含义及其异同点
Southern杂交：
是先将分布在琼脂糖凝胶上大小不同的变性DNA片段转移到滤膜上，之后通过碱基互补配对，将滤膜与探针杂交，显色鉴定。
Northern杂交：
是将RNA样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素滤膜上，用同位素或生物素标记的DNA或RNA特异探针针对固定于膜上的mRNA进行杂交，洗脱除去非特异性杂交信号，对杂交信号进行分析，以确定目的基因是否转录。
异：
1、S杂交的被检测对象是DNA，W杂交的被检测对象是RNA；
2、变性：
RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性；
3、转膜：
RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理；
4、靶核酸为RNA，不需限制酶消化
同：
基本原理和基本过程与Southernblot基本相同（可以具体补充）
PCR技术原理及其基本成分与基本过程如何
原理：
在存在DNA单链、与DNA单链互补的寡核苷酸引物、dNTPs及DNA聚合酶的情况下，当引物与单链的互补区结合后，在DNA聚合酶的催化作用下进行DNA单链的5’→3合成反应。
实际上是模拟天然DNA复制过程。
基本过程：
变性（denatureation）：
92-96℃的高温处理可使模板DNA双链间氢键断裂，解离成单链但不改变其化学性质，变性的时间一般为30秒,如果模板的G+C含量较高，变性时间可适当延长。
变性后的单链DNA游离于反应体系中作为模板;
退火（annealing）：
体系温度降至合适温度，使加入的引物与模板DNA碱基序列互补结合。
退火的温度取决于引物的Tm值;
延伸（extension）：
在72℃温度下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3’-OH端，以互补的DNA单链为模板，沿着模板延伸合成模板DNA的互补链，称为延伸。
一般每1min/kb来保证充足的延伸时间。
基本成分：
1.缓冲液2.MgCl23.dNTPs4.模板DNA（Template）5.TaqDNA聚合酶6.引物（Primer-P）
PCR平台效应及其影响因素
平台效应（plateaueffect）：
PCR经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA片段不再呈指数累积，而是进入静止期即平台期。
影响因素：
引物及dNTP底物浓度降低；
酶与模板比例下降；
最终产物的阻化作用（焦磷酸盐、双链DNA）；
非特异性产物或引物的二聚体与反应模板的竞争作用；
变性和在高产物浓度下产物分离不完全。
引物的含义与设计原则
引物是指在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是单链DNA片段。
设计原则：
引物与模板的序列要紧密互补；
引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；
引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
逆转录PCR、锚定PCR、反向PCR、巢式PCR、原位PCR、多重PCR、不对称PCR、实时定量PCR的含义
反转录PCR：
扩增mRNA的一种实验技术。
先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。
锚定PCR:
用于扩增已知一端序列的目的DNA。
在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。
反向PCR:
是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片
段两侧的未知序列进行扩增.
巢式PCR:
巢式PCR又称套式PCR，它包括两轮PCR：
第一轮PCR使用的一对引物在模板的
外侧，称为外引物（outerprimer），第一轮PCR是15～20个循环的标准扩增。
将第一轮PCR产物稀释100～1000倍作为模板进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR
扩增所用的引物在同一模板的外引物内侧，称为内引物（interprimer）。
巢
式PCR降低了扩增多个靶位点的可能性。
实时定量PCR:
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析的方法。
原位PCR：
是直接利用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后特异探针进行原位杂交检测含目标序列的细胞的一种方法。
多重PCR：
它是在同一反应体系中用多种引物同时扩增几种基因片段的方法，主要用于同一原体分型及同时检测多种病原体。
不对称PCR：
两条引物比例相差较大的PCR，称非对称PCR，可用于扩增产生特异长度的单链DNA。
Sanger双脱氧链终止法测序的基本原理
DNA聚合酶能利用单链DNA为模板，离体合成其互补链，当反应液中存在2′,3′-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），它可以象2′-脱氧核苷三磷酸（dNTP）那样直接掺入新合成的DNA链中，但因ddNTP3′端不具－OH，所以寡核苷酸链不再继续延长，即DNA链合成中止了；
在4个反应管中同时加入同一种DNA合成的被标记的引物和待测序的DNA模板、DNA聚合酶Ⅰ、4种脱氧核苷酸三磷酸，同时在这4个管中分别加入4种不同的2′,3′-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）；
反应将产生不同长度的DNA片段混合物，它们都带有ddNTP的3′末端；
将这些混合物进行变性凝胶电泳分离，就可以获得一系列不同长度的DNA谱带；
再通过放射自显影术，直接读出DNA序列。
基因定点诱变的含义以及重组PCR定点突变的具体过程（过程参照P91）
基因定点突变是对基因或DNA序列中特定碱基实施取代、插入或缺失等操作，不仅是研究蛋白质结构和功能关系的有力工具，也是人们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
酵母单杂交系统、凝胶阻滞试验、DNAaseI足迹试验
酵母单杂交系统：
是用特异的DNA序列取代DNAGAL4结合位点，该序列是基因启动子上特定的顺式作用原件（cis-element），是转录因子等反式作用因子（transfactor）的结合位点，转录因子通过与顺式作用原件的结合，可激活基因的表达，从而启动下游的
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