试验真菌和细菌的分离培养和鉴定病理学研究方法文档格式.docx

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对于未履行职责的小组，多安排1次卫生清理任务。

三、学时分配：

共12个实验，每实验3学时，总计36学时，其中病虫部分30学时，啮齿类动物6学时。

四、时间安排：

共开设6周（第5周~第10周），每周6学时。

五、指导老师的职责：

实验操作讲解与示范。

六、实验辅助人员的职责：

实验准备、操作示范和学生管理。

实验一、草地植物病害症状观察（肉眼直接观察）

一、目的要求

植物病害症状是诊断植物病害的主要依据之一。

诊断病害是病害研究的最基本内容。

植物病害症状要根据病害的发生过程加以全面描述和记载。

认识植物病害的各种症状，为病害诊断打好基础。

二、仪器及用具

解剖镜、扩大镜、镊子

三、实验材料

苜蓿锈病、沙打旺白粉病、红豆草匐柄霉轮纹病（Onobrychisviciifola）、矮柱花草炭疽病（Colletotrichumtuifolii）、苏丹草云纹病（Rhynchosporiumsecalis）、赖草香柱病（Epichloetyphina）、老芒麦秆锈病（Pucciniagraminis）玉米大斑病、小麦根腐病、小麦秆锈病、小麦叶锈病、小麦黄矮病、小麦粒线虫

四、内容与方法

1、用肉眼观察各类植物病害的蜡叶标本，或在体视显微镜下或用放大镜观察，根据症状的特点，描述病害症状。

植物侵染性病害

植物真菌性病害标本（植物病害中90％为真菌性病害）：

病状和病征：

所有植物病害均有病状，即植物的异常生长或叶、茎、花、穗、果等器官的变色、斑点、坏死、腐烂等。

真菌性病害也不例外，而且通常可见病征，即病原真菌本事。

病征是鉴定病害最可靠的依据，而病状没有特异性。

真菌性病害的典型病征为：

粉状物（白粉病的无性孢子、锈病的夏孢子堆和冬孢子堆）、霉状物（各类各色霉层）、颗粒状物（分生孢子器、菌核等）。

苜蓿霜霉病（Peronosporaastivalis）

苜蓿黑茎病（Cerosporadavisii）

苜蓿锈病（UromycesstriatusSchroot）

猫尾草霜霉病（Sclerophthoramacrospora）

猫尾草长蠕孢叶斑病（Helininthosporumsativum）

草木樨夏季黑茎病（Cercosporadavisii）

草木樨白粉病（Erysiphepolygoni）

红豆草匐柄霉轮纹病（Onobrychisviciifola）

老芒麦秆锈病（Pucciniagraminis）

矮柱花草炭疽病（Colletotrichumtuifolii）

苏丹草云纹病（Rhynchosporiumsecalis）

赖草香柱病（Epichloetyphina）

植物细菌性病害标本：

病征为菌脓、菌溢、菌痂，病状为萎蔫、叶斑等。

植物病毒病害标本：

无病征，病状为花叶、矮化、黄化等

寄生性种子植物：

病征即为寄生性种子植物本身，病状为：

寄主植物生长不良，叶片变黄

植物非侵染性病害（生理性病害）：

缺素症、沤根、冻害等

害虫造成的为害称为害状，不属于病害，区别咀嚼式口器和刺吸式口器的害虫造成的害状。

人为和动物造成的伤害也不属于病害。

观察并掌握各种病害标本的病状类型的特点。

1、病状类型

1.1变色chlorosis，病毒病

1.2坏死necrosis，各类叶斑病

1.3腐烂rot，各类根腐病

1.4萎蔫wilt，沙打旺黄矮病

1.5畸形distoration，包括丛枝、矮化、徒长、肿瘤、叶片畸形

2、病征类型

2.1絮状物腐霉

2.2霉状物如青霉、灰霉、赤霉、霜霉等，主要有真菌的菌丝体和孢子梗组成。

霜霉病

2.3粉状物白粉病

2.4锈状物锈病、白锈病

2.5点粒状物白粉病的有性阶段闭囊壳、菌核、

2.6脓状物细菌性病害

2、植物病害的描述与记载常识

症状描述和记载根据：

发病部位、病斑大小、病斑颜色等。

采集的病害标本要压制成蜡叶标本，并注明：

寄主、病害名、病原、采集时间、采集地点、采集人等。

五、实验作业

分别列出5种病害的病征和病状

受害植物－寄主

病害名称

发病部位

症状类型

症状特点（病状，有病征则写出病征特点）

病害1

病害2

病害3

病害4

病害5

实验三准备：

实验接受后每组清洗培养皿30套、200～250ml三角瓶4个，晾于桌面，待下次使用。

实验辅助人员准备马铃薯3斤。

实验二、草地植物病原菌主要类群及其形态观察（借助显微镜观察）

了解植物病原真菌和病原细菌，以及线虫和寄生性种子植物种类。

重点观察植物病原真菌的形态特征。

显微镜、解剖镜、载玻片、盖玻片、蒸馏水、解剖刀、扩大镜、镊子、纱布、单面刀片及记载用具

1真菌性病害：

1.1霜霉病：

16猫尾草霜霉病、25小麦霜霉病、39黄瓜霜霉病、大豆霜霉病、马铃薯晚疫病、甘蓝霜霉病、萝卜白锈病、莴苣霜霉病

1.2子囊菌病害：

6沙打旺白粉病、34梨树白粉病、35苹果白粉病、41黄瓜白粉病、小麦全蚀病

1.3担子菌病害：

2披碱草黑穗病、17玉米丝黑穗、玉米瘤黑粉病、谷子黑穗病、高梁散黑穗病、高梁坚黑穗病、20小麦散黑穗病、21小麦秆黑粉病、22玉米黑粉病、23燕麦坚黑穗病、12苜蓿锈病、15老芒麦秆锈病（Pucciniagraminis）、19小麦秆锈病、50小麦叶锈病、小麦条锈病

1.4半知菌病害：

1草木樨夏季黑茎病、3矮柱花草炭疽病（Colletotrichumtuifolii）、4苏丹草云纹病（Rhynchosporiumsecalis）、5赖草香柱病（Epichloetyphina）、7蚕豆赤斑病、8猫尾草长蠕孢病害、9蚕豆轮纹病、10蚕豆褐斑病、11红豆草匍柄霉轮纹病、14苜蓿黑茎病18玉米小斑病、24小麦黄矮病、26小麦根腐病、27莴苣霜霉病、28谷子白发病、29莴苣锈病、30赖草褐斑病、31高梁坚黑穗病、32杨树白粉病、33苹果腐烂病、37苹果褐斑病、40番茄叶霉病、42西葫芦黄萎病、43茄子早疫病、44芹菜斑枯病、45甜菜褐斑病、46番茄早疫病、49玉米大斑病、51红豆草轮纹病（Onobrychisviciifola）、

2细菌性病害：

47柑桔溃疡病、玉米茎基腐病

3病毒性病害：

36苹果花叶病、38辣椒花叶病、玉米病毒病、大豆花叶病

4线虫病：

48小麦粒线虫、

5寄生性种子植物：

13苜蓿菟丝子、

做水装片，观察以下病害的病原特征

1黑粉菌的观察－高龄黑穗病

2锈菌的观察－小麦锈病，蚕豆锈病

3白粉菌的观察－梨白粉病

4霜霉菌的观察－黄瓜霜霉病，莴苣霜霉病

5半知菌的观察－芹菜斑枯病（分生孢子器）、番茄早疫病（分生孢子丛）

6子囊菌的观察－白粉病的有性阶段

6线虫的观察－小麦粒线虫

7寄生性种子植物的观察－苜蓿菟丝子

8细菌菌落和形态观察

绘出5种真菌性病害的病原特征图

实验开始时同时准备下次实验，每组派2名同学，全班制作PDA培养基3000ml，准备无灭菌水2000ml。

实验三、真菌和细菌的分离、培养和鉴定（病理学研究方法）

通过对某些植物病原菌的分离培养的实验操作，初步学会一般的植病技术，为进一步鉴定病原，从事植物病理研究和生产微生物农药打基础。

1灭菌室、超净工作台、培养箱、电炉、天平、烧杯、量筒、培养皿、高压灭菌器、试管、三角瓶、漏斗、接种针、接种环、解剖刀、镊子、解剖剪、载玻片、盖玻片、挑针、纱布、瓶塞用的棉花、玻璃铅笔、酒精灯、滴管、滤纸

2马铃薯、琼脂、牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖或蔗糖

3酒精、蒸馏水、升汞或漂白粉

4分离用的真菌和细菌病害标本，供接种试验用的盆栽幼苗、菌种和病菌孢子粉、滑石粉

真菌性病害－九转梅枝枯病（立枯丝核菌Rhzoctoniasolania）（新鲜标本）

沙打旺黄矮根腐病侵染的茎秆（沙打旺埃里砖格孢Embellisiaastragali）（腊叶标本）

红豆草黑秆病（校园采集的新鲜标本）

葱紫斑病（链格孢Alternariaalternata）（腊叶标本）

细菌性病害－黄瓜细菌性角斑病（细菌）（腊叶标本）

种子分离－沙打旺种子（多种种带真菌）

1玻璃器皿洗涤与灭菌

2载玻片、盖玻片的洗涤

3培养基的配制

3.1培养真菌常用的PDA配方：

马铃薯200g削皮切成小块，加水1000ml，煮沸30min，纱布过滤

加葡萄糖20g，琼脂17～20g，加足水总量至1000ml

分装在三角瓶试管中封口灭菌（121℃，30min）

分装在培养皿中，每皿10ml

3.2培养细菌常用的牛肉汁蛋白胨培养基配方：

牛肉浸膏5g蛋白胨5～10g食盐5g溶于1000ml水中

调节酸碱度到中性

加琼脂17～20g，融化后分装在试管或三角瓶中灭菌

分装在培养皿中

3.3分离培养

组织分离法（分离真菌常用方法）

病原材料的选择（非专性寄生菌，病健交接处）

组织表面消毒（70%酒精数秒，1%的NaClO2～5分钟，无菌水冲洗3～4遍）

用滤纸吸干无菌水

切成小块（2～3mm的组织块每皿5块）

置培养皿中，22～25度下的培养箱中培养

稀释划线分离法（分离细菌常用方法）

1ml的培养皿中加入1接种环从病组织中挤压出的细菌悬浮液，先用接种环蘸菌液在培养皿中划平行的5条线，再与此5条线垂直方向划5条线，置28度培养箱中培养。

重点分离：

1、红豆草黑秆病

上年生黑秆段，2皿/组，每皿5块

上年生黑秆髓部，2皿/组，每皿5块

新生茎秆2皿/组，每皿5块

新生叶片，2皿/组，每皿5块

根颈部，2皿/组，每皿5块

根皮层，2皿/组，每皿5块

根中柱，2皿/组，每皿5块

2、沙打旺黄埃根腐病

茎秆段，2皿/组，每皿5块

茎秆髓部，2皿/组，每皿5块

每组准备PDA培养基25个

3.4分离结果的统计（1周时）

描述分离时出现的所有菌落特征，鉴定菌物种类。

真菌：

统计每种菌的分离率＝带某一菌的组织块数/分离中总组织块数

细菌：

统计每种细菌菌落数

五、实验作业（详见下）

清洗培养皿、载玻片和盖玻片

实验四、昆虫外部形态、变态和虫态观察（昆虫形态学和生物学）

上次实验报告内容：

1、根据菌落特征的不同，初步确定为不同真菌。

2、在超净工作台下做水装片，在显微镜下观察孢子和产孢结构，根据教科书和有关文献鉴定菌种属名。

3、将每种真菌纯化2~3皿，写上详细说明：

寄主、分离部位、菌种名称、鉴定人、日期（如果未鉴定出的菌种描述主要特征做为菌种名称，如红色菌落等）。

4、统计每种菌的分离率，即在一个培养皿中每种真菌在组织块上出现的几率，分离率＝

，注意一个组织块上可出现多种真菌的菌落，组织块上出现的菌落认为是分离出的真菌，需要统计，而在组织块之外的培养基上出现的真菌认为是污染的真菌不予统计。

如果纯化工作已完成，可在实验台上打开培养皿盖，将培养皿下盖放到体式显微镜下观察产孢，可用拨针拨开菌落观察下面有无分生孢子器、菌核等产生。

也可放到显微镜下直接观察孢子特征（100~400×

以下放大倍数下观察）。

5、描述每种真菌的菌落正面和背面特征、孢子和产孢结构特征，菌落特征主要有：

颜色、大小、形状等；

孢子和产孢结构可绘图表示。

作业：

1、写出分离真菌或细菌的详细步骤及注意。

2、填写分离率表。

寄主

分离部位

菌1

菌2

菌3

菌4

红豆草

上年生茎秆-段

上年生茎秆-髓部

新生茎秆

新生叶片

根颈部

根皮层

根中柱

沙打旺

茎秆段

茎秆髓部

注：

菌1、2、3等要鉴定到属。

因未产孢未能鉴定到属的真菌用主要特征代替属名。

3、描述每种真菌的菌落特征、孢子和产孢结构特征，并绘制孢子图。

一、实验目的

认识昆虫体躯外部形态基本构造和特征，掌握昆虫的触角、眼、口器、胸足和翅的基本构造及类型；

认识全变态和不全变态昆虫的不同发育阶段各种主要类型的形态特征，为进一步识别害虫和学习昆虫分类奠定基础。

二、实验材料

昆虫针插标本、生活史标本、体视显微镜

三、实验内容：

1、昆虫体躯的三个体段及其附肢和附器、外骨骼的观察

2、昆虫翅的观察翅的形状、质地和表面的特征以及翅脉

3、昆虫足的观察结构和类型

4、昆虫触角的观察结构和类型

5、胸足的观察结构和类型

6、口器的观察结构和类型

7、昆虫的虫态和变态观察昆虫幼虫、若虫、蛹、成虫的观察幼虫的类型、蛹的类型、若虫及其成虫的差异

8、蜘蛛和红蜘蛛的观察体躯、足、外形

（任选三题）

1、绘制一种昆虫的足、翅和触角

2、比较不全变态昆虫的若虫和成虫有何区别。

3、列表比较10种昆虫前足、中足和后足的类型，触角的类型和口器类型

4、根据生活史标本，列出5种昆虫的幼虫、蛹的类型。

5、解释若虫和幼虫的定义。

实验五、昆虫主要类群观察1（直翅目、鞘翅目、鳞翅目、膜翅目）（昆虫分类学）

一、实验目的：

掌握昆虫纲常见目的主要特征，了解草地植物害虫的主要类群。

二、实验材料：

昆虫针插标本

三、实验器材：

体视显微镜

四、实验内容：

1、不同昆虫目的观察

2、昆虫各目中主要科的观察

主要的目有：

直翅目、鞘翅目、鳞翅目、膜翅目

主要的科有：

直翅目：

蝗科、地下害虫中的蝼蛄科（非洲蝼蛄和华北蝼蛄2种）

鞘翅目：

金龟科、叩头甲科、瓢甲科、叶甲科（曲跳甲）、拟步甲科、豆象科、象甲科，地下害虫中的金龟甲（铜绿丽金龟甲、大黑鳃金龟甲和暗黑鳃金龟甲3种）和叩头甲（沟金针虫、宽背金针虫、褐金针虫和细胸金针虫4种）

鳞翅目－蝶类：

粉蝶科

鳞翅目－蛾类：

天蛾科、尺蛾科、螟蛾科、夜蛾科（苜蓿夜蛾、粘虫、、草地螟、沙打旺小食心虫、地下害虫中的地老虎（黄地老虎和小地老虎2种））

五、作业：

1、列表比较供试4个目昆虫（鞘翅目、鳞翅目、直翅目、膜翅目）的最大特点

2、列出供试昆虫中4个科的最大特点

3、随机挑选5种害虫标本，进行分类，写出所属目和科。

实验六、昆虫主要类群观察2（半翅目、同翅目、缨翅目、双翅目、蛛形纲中的蛛目和蜱螨目）（昆虫分类学）

3、蜘蛛和红蜘蛛的观察

昆虫纲中的半翅目、同翅目、缨翅目、双翅目；

蛛形纲中的蛛目和蜱螨目（即红蜘蛛）

半翅目：

蝽科、盲蝽科（三点盲虫、苜蓿盲虫）

同翅目：

叶蝉科（大青叶蝉）、蚜科

双翅目：

食蚜蝇科、叶蜂科、广肩小蜂科

缨翅目：

苜蓿蓟马多个种

其他害虫：

苜蓿籽蜂、蓟马、豆芫菁、苜蓿夜蛾、粘虫、蚜虫、飞蝗、沙打旺小食心虫

1、列表比较供试4个目昆虫（半翅目、同翅目、缨翅目、双翅目）的最大特点

实验七、种子健康检验（人工检查、洗涤法、PDA培养）

牧草病虫害的防治与粮食作物、果树和蔬菜作物以及经济作物不同，一般不采取化学药剂大田防治，而是采用播种健康的种子和选用抗病虫品种的措施，因此，种子的健康状况至关重要。

牧草中有多种种子携带的病菌和害虫，如豆科黄萎病（Verticilliumspp.）、苜蓿籽蜂、沙打旺黄萎根腐病（Embellisiaastragali）。

本实验的目的是掌握肉眼检验法、过筛法、洗涤检验法、吸水纸培养检验等种子病害检验的方法；

掌握种子害虫的检验方法。

二、仪器及用具/每组

肉眼检验中：

普通白纸、扩大镜或体视显微镜各一；

精度为0.01g的天平一台（公用）

洗涤检验中：

显微镜、量筒、小烧杯、2ml的注射器、血球计数板各一，离心机2台、离心试管6个（公用），盖玻片若干。

过筛检验中：

孔径1mm和0.5mm的筛子各一、瓷盘一个、

滤纸上培养中：

培养皿4个，滤纸、滴管和自来水若干。

种子上害虫的检验：

培养皿每组2个，盛装受害种子和种荚标本。

沙打旺种子、苜蓿种子、小麦种子、醉马草种子、红豆草种子、高粱黑粉病标本

（一）肉眼检验法-有麦角的醉马草种子

1、从待检醉马草（燕麦）种子中分出一半种子作试样，放在白纸上

2、称重

3、用肉眼及5~10倍扩大镜检查

4、挑出麦角（病粒），并称重

5、计算感染病害的种子百分率

（二）过筛法-不做

1、取筛子按筛孔大小叠好[孔径（1mm）上层、孔径（0.5mm）下层]

2、将过筛的醉马草种子称重

3、将试样倒入上层筛内，用旋转法筛理2分钟

4、将各层筛上物倒入瓷盘内，摊成薄层

5、用肉眼及扩大镜分别检测各层是否有病原物、病粒等

6、将底层的筛出物倒于白纸上，在解剖镜下检查，拣出病原体并称重

（三）洗涤检验-人为拌入黑粉菌的沙打旺种子，每组各200粒左右

1、准备待检种子（箭舌豌豆、红豆草、苜蓿和沙打旺）

2、从待检种子中取试样2.0g，数清其粒数，倒入三角瓶内

3、在三角瓶内加蒸馏水5ml

4、在回旋式振荡器上振荡5min

5、将洗涤液倒入离心试管内，在自动平衡微型离心机1000转/min离心5min

6、吸取上清液，约留1ml悬浮液于管底，用手稍加振荡

7、用吸管将悬浮液滴在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下检查

8、每片检查10个视野，记载病原体种类及每视野的孢子数，并按下列公式计算每粒种子的孢子负荷量＝（平均一个视野中的孢子数×

一张盖玻片内的视野数×

1ml溶液的滴数）÷

2克种子的粒数

常用的盖玻片的边长为20mm，400×

下1个视野的直接为2.1mm，则可以计算出1个盖玻片相当于多少个视野（115.5个）。

第6步－第8步可测量离心后吸取上清液所剩下的液体体积，再用血球计数板测量液体中孢子的浓度（平均每小格孢子数×

4×

106，单位：

个孢子/ml，通常观察80个方格中的孢子），计算液体中孢子总数（＝液体体积×

孢子浓度），继而计算出每粒种子上孢子的负荷量（孢子总数÷

种子总数）。

钮鲍尔血球计数板的小方格边长0.5mm，深度为0.1mm，面积为0.0025mm2，容积为0.00025mm3。

（四）滤纸或水琼脂或PDA上培养检验-苜蓿、沙打旺、红豆草、箭舌豌豆等种子

1、准备待检种子

2、每份种子各取100粒

3、将滤纸在蒸馏水中浸湿，平铺于直径90mm的培养皿内，每皿铺3层（或制作培养基）

4、每皿均匀摆放25粒种子

5、在20℃，昼夜光照交替12小时条件下培养7天检查

6、统计每种菌感染（带菌）的种子数，计算每种真菌的种子带菌率

7、对每种菌落在显微镜下做水装片观察、鉴定真菌种类（根据分生孢子和分生孢子梗的形态）（五）种子中害虫的检验-沙打旺籽蜂为害的种荚和种子

肉眼检测法、盐水或自来水检测法、种子萌发培养法。

刚成熟的种子收获后放入培养皿中，带害虫从种子中化出后统计。

五、实验作业（下次交）

写出实验过程和种子检验结果

有关计算公式：

，其中孢子数量采用血球计数板测定。

实验八、草地植物病害的早期诊断技术和昆虫饲养与鉴定（榆中校区病虫普查）

上次实验结果统计：

种子带菌率统计，完成上次实验作业。

侵染性植物病害是植物病理学研究的主要内容，而非侵染性病害通常属于栽培学研究的内容。

由于侵染性植物病害通常会引起栽培植物受害，甚至有时可引起严重的经济损失，因此，植物病害的防治应在其造成严重受害前进行。

为有效防治一种病害，首先要准确诊断病害，其次要掌握病害发生的过程和侵染循环。

由于植物病害在发生初期表现的症状往往不典型，真菌性病害的各类孢子往往在病害发生的后期产生，再加上许多真菌性病害和所有病毒病、类病毒病的病原不能人工培养，另外侵染性植物病害容易与虫害的害状、机械伤害、药害、生理性病害相混淆，因此，病害的早期诊断较为困难。

由于昆虫存在者变态，而且大多数昆虫的不同虫态（卵、幼虫、若虫、成虫）生活在不同的场所（土壤、植株表面或植株内部），同时，昆虫的准确鉴定通常需要成虫阶段，所以，我们在田间发现的昆虫往往难以鉴定。

本实验的目的为掌握病害早期诊断的技术和昆虫鉴定的基本方法。

二、仪器及用具

放大镜、剪刀、滤纸、培养皿、记录本

兰州大学榆中校区树木、花卉、草坪、牧草及其上的病虫害

四、内容和方法

教师带领全班，普查校区西区主要的虫害。

对于病害，记录病害的寄主、症状和可能的病原，记录土壤和其它生长环境条件。

发现的如果是真菌或细菌性病害，则采集发病部位进行保湿培养。

对于昆虫，采集并放入培养皿中，同时采集足够的食物，饲养数周，待发育为成虫时鉴定。

4.1病害的诊断技术和流程

第一步：

发现植物生长异常

第二步：

排除机械伤害、虫害和药害

第三步：

排除环境因素（空气污染、土壤缺素、光照过强或过弱、水分过多或过少、温度过低或过高）的可能

第四步：

观察是否由病毒或类病毒引起

第五步：

观察是否由