《基因工程技术》课程复习题解答版Word格式.docx
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在病毒DNA包装过程中，催化特异性地切割病毒DNA连环体，产生单位长度的基因组，并参与基因组包装的酶类。
DNA连接酶：
也称DNA黏合酶，催化相邻核苷酸的游离5’-磷酸基团和3’-羟基之间形成磷酸二酯键的核酸酶。
连接酶的催化作用需要消耗ATP。
DNA修饰酶：
泛指能够参与改变DNA组成和结构的一类酶。
DNA聚合酶：
是指催化以DNA单链为模板，以4种脱氧核糖核苷酸为底物，合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
以DNA为复制模板，从将DNA由5'
端点开始复制到3'
端的酶，是细胞复制DNA的重要作用酶。
载体：
是一种具有特定功能能自我复制的DNA分子，能将外源DNA片段携带进入受体细胞，并在受体细胞中稳定维持和表达。
质粒载体：
一种裸露的、比病毒更简单的，有自主复制能力的双链超螺旋共价闭环DNA分子（简称cccDNA）。
在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。
柯斯质粒载体：
是一类人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
由三个部分组成：
含有一个pBR322的完整复制子，两个抗性基因AmpR和TetR及一个带有λ噬菌体cos序列。
噬菌体载体：
噬菌体是一类感染细菌病毒的总称，在噬菌体DNA分子中，除具有复制起点外，还有编码外壳蛋白质的基因。
噬菌体主主要有双链噬菌体和单链丝状噬菌体两大类。
双链噬菌体为λ类噬菌体，单链丝状噬菌体有M13、f1、fd噬菌体。
重组DNA技术中常用的噬菌体克隆载体主要有λ类噬菌体和M13噬菌体。
温和噬菌体：
具有溶原周期的噬菌体。
在短时间内不能连续完成吸附、侵入、增值、成熟和裂解这五个阶段而实现繁殖的噬菌体为温和噬菌体。
的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列以及选择标记性状，具有多克隆位点。
cDNA文库：
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
基因组文库：
把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。
感受态细胞：
理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
Southern印迹杂交：
利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量的技术。
转染作用：
将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。
转化作用：
将携带某种遗传信息的DNA分子引入宿主细胞，通过DNA之间同源重组的作用，获得具有新遗传性状生物细胞的过程谓之转化作用。
转导作用:
当病毒从被感染的细胞释放出来，再次感染另一细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。
操纵子：
指包含结构基因、操纵基因以及启动基因的一些相邻基因组成的DNA片段，其中结构基因的表达受到操纵基因的调控。
主要见于原核生物，但在真核生物中也存在。
启动子：
位于结构基因5'
端上游的DNA序列※，是指位于转录起始点上游的特异序列（通常位于基因转录起点上游的100bp范围内，长约20-200bp），是转录起始时RNA聚合酶识别和结合的部位，与转录的启动有关，但本身并不转录。
启动子的结构可以影响它与聚合酶的亲和力，从而影响表达水平。
多顺反子：
多顺反子见于原核生物意指一个mRNA分子编码多个多肽链。
这些多肽链对应的DNA片段则位于同一转录单位内，享用同一对起点和终点。
增强子：
是一段能增强启动子转录效率的特定序列，从而明显地提高基因转录的效率。
特点：
①远距离调控②无方向性
信号肽：
在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，该氨基酸序列就被称为信号肽序列，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。
密码子偏好：
是指各种生物体偏爱使用三联密码子（即编码相同氨基酸的密码子）的现象。
基因表达：
细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
此处指外源基因在受体细胞中从mRNA转录到功能蛋白质翻译的过程。
Pribnow框：
原核生物中，在启动子上游有一个由5-6个核苷酸组成的共有序列，以其发现者的名字命名为Pribnow框。
SD序列：
原核生物mRNA起始密码AUG（相应DNA上的起始密码ATG上游约-10处）的上游约4-7个核苷酸之前有一富含嘌呤的5′-AGGAGGU-3′的短小序列，称为SD序列（ShineDalgarnosequence），能与细菌16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。
2.判断题（占5%，5个判断题）
3.选择题（占10%，5个选择题）
4.问答题（占60%，6个选择，从8个选择中选6个）
简述基因工程的基本技术路线？
分离目的基因：
从生物有机体的基因组中分离出带有目的基因的DNA片段；
体外目的基因和载体重组：
在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子；
转化受体细胞：
将重组DNA分子转化到寄主细胞中；
扩大培养（按需）：
重组体在细胞中扩增繁殖，获得大量的细胞繁殖菌落；
检测筛选转化细胞：
从菌落中，筛选出重组DNA分子克隆菌落；
研究与鉴定：
将选出的克隆菌落进一步研究分析，使目的基因的功能在细胞水平上表达。
生产应用
简述基因工程有哪些主要研究内容与应用领域?
研究内容：
基础研究：
克隆载体系统研究、工具酶系统研究、受体系统（即表达系统）研究、目的基因功能及其调控机制研究、基因重组及修饰技术研究、基因组学研究等
应用研究：
基因工程药物研究（医学领域）、转基因植物研究（种植业领域）、转基因动物研究（畜牧业领域）、其他方面研究（食品、化工、能源、环境等）
应用领域：
医学领域：
基因工程药物、基因治疗、基因芯片
农业领域：
转基因植物、转基因动物
能源环境领域：
转基因能源植物（玉米、木薯、红薯等）、转基因超级细菌和制剂（粪便污染、油污、重金属、塑料）
军事领域：
基因武器
简述提取天然DNA的基本步骤及其主要方法？
生物材料的准备：
动物和人DNA样品的采集与保存：
主要是血样和组织样，冷冻保存、甲醛乙醇等防腐保存；
植物DNA样品的采集与保存：
主要有根、茎、叶、花果等组织器官，采集时避免有病虫害、损伤的组织器官，将材料清洗用无菌吸水纸吸干保存或冷冻保存；
细菌DNA样品的制备：
通过合适的培养基进行细菌增殖，获得菌液或菌落，离心收集菌体，冷冻保存；
病毒或噬菌体DNA样品的制备：
由于病毒或噬菌体寄生于细胞内，必须从宿主细胞中分离，过程相当复杂。
细胞裂解：
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）裂解法、SDS裂解法（十二烷基磺酸钠）、蛋白酶K裂解法、液氮冻融
DNA的分离和抽提：
酚-氯仿抽提法、盐析法、氯化铯密度梯度离心法、固相萃取法
纯化和浓缩：
在抽提DNA溶液中往往含有少量的RNA、蛋白质及实验试剂残留物，必须去除进一步纯化DNA：
RNase处理：
加入适量的RNase在常温条件下放置几分钟就可以降解DNA溶液中的RNA。
琼脂糖凝胶电泳洗脱法：
用于少量的DNA纯化。
氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法：
大量的DNA纯化。
离子交换层析法：
由于DNA磷酸基团与固相阴性交换离子相互作用，DNA能结合在层析柱固体介质（羟基磷灰石、层析树脂）上，然后再用一定浓度梯度盐溶液洗脱。
基因组DNA的沉淀：
用0.1倍体积的3MNaAc（乙酸钠）或2.5倍体积的100%乙醇沉淀DNA,用70%乙醇除去DNA沉淀中的盐离子。
基因组DNA的溶解与保存：
将基因组DNA溶解在TE缓冲液中，置4C保存。
制备基因组DNA时应注意：
防止内源性DNase
保证得到高分子量的基因组DNA
保证基因组DNA不被蛋白质和实验残留物所污染
阐述PCR引物设计原则有哪些？
引物长度适中，一般为18~30个核苷酸：
引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度72℃，亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。
引物中的碱基尽可能随机分布：
避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。
尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。
否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。
引物中G+C的含量在45~55%左右。
设计引物时要考虑3′端和5′端引物具有相似的Tm值。
Tm=4（G+C）+2（A+T）。
引物长度要确保解链温度不低于54℃。
引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构：
按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。
两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补形成二聚体。
引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性，尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。
引物3′端的最佳碱基选择是G和C。
因为它们形成的碱基配对比较稳定。
引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。
简述荧光定量PCR化学原理？
※
实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
检测方法：
SYBRGreenⅠ法：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。
TaqMan探针法：
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；
PCR扩增时，Taq酶的5'
－3'
外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP）。
简述构建质粒克隆载体的基本策略？
必须含有在受体细胞内有效的复制起始位点Ori，最好是松弛型质粒复制起始位点；
必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，这样的位点（限制性内切酶识别位点）尽可能多，但是最好一种限制性内切酶只有唯一的识别位点；
必须含有供选择克隆子的标记基因，如抗药性标记Tetr、Ampr等，最好有两种选择标记基因，并且在选择标记基因内含有合适的克隆位点，以便外源DNA片段插入克隆位点后，标记基因失活，成为选择克隆子的依据。
构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小；
由于特殊需要，在构建的质粒克隆载体时需要组装各种“元件”。
例如在克隆位点的上游组装强启动子，下游组装相应的终止子，成为强表达质粒克隆载体。
在克隆载体的合适位置组入受体细胞染色体DNA的同源序列，成为基因整合平台系统的供体质粒克隆载体。
如何利用农杆菌Ti质粒构建植物克隆载体？
删除T-DNA上的tms和tmr的基因（卸甲载体或Onc-Ti载体），恢复植物细胞再生能力；
删除与T-DNA转化无关的冠瘿碱合成酶基因，进一步减少重复的酶切位点；
引入大肠杆菌复制子和选择标记，构建成穿梭载体便于重组子在大肠杆菌中的克隆与扩增；
引入植物启动子和Poly（A）信号序列，便于外源基因在植物细胞中高效表达；
加入多克隆位点连杆（MCS）。
简述构建基因组文库的基本步骤和流程？
载体的选择和制备；
高纯度、大分子量基因组DNA的提取；
基因组DNA的部分酶切与分级分离；
载体与DNA片段的连接；
转化或侵染宿主细胞；
筛选与保存。
简单归纳从基因文库中克隆目的基因有哪些方法？
通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：
核酸杂交法，原理是分子杂交：
首先把属于一个文库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养皿上以取得相当分散的菌落或噬菌斑，然后用硝酸纤维滤膜吸印，使培养皿和滤膜的相对应的位置上具有相同的克隆。
同时另行制备供分子杂交用的探针。
为了筛选真核生物的某种基因，常从它的转录产物mRNA经反向转录（见中心法则）合成相应的互补DNA（cDNA），再加入用32P标记的核苷三磷酸，用DNA多聚酶切口移位方法制成有同位素标记的探针。
把探针DNA和硝酸纤维滤膜上的菌落或噬菌体分别进行变性处理，然后进行分子杂交。
再将X光底片覆盖在经过处理的滤膜上以进行放射自显影。
在培养皿上找出和X光底片上的黑点相对应的菌落或噬菌斑。
这些菌落或噬菌体中便包含着所需要的基因，经过扩增便能得到大量的细菌或噬菌体，从中可以分离出所需基因的DNA片段。
PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来（使用的引物是目的基因特异引物）：
对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置
96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
简述（或图解）抑制消减杂交（SHH）技术的基本原理？
是以抑制性PCR反应为基础的cDNA消减杂交技术。
通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段，抑制非目的cDNA的扩增。
利用抑制性PCR能选择性扩增不同丰度差异基因和cDNA消减杂交特点,运用杂交二级动力学原理（即高丰度序列退火时产生同源杂交的速度大于低丰度序列）,使原本不同丰度的DNA序列相对含量趋于一致。
然后利用抑制性PCR特点,两端接上同一接头的非目的基因片段由于具有反向重复序列,在退火时容易形成发夹互补结构,在PCR中不能作为模板与引物配对扩增,从而选择性扩增目的基因而抑制非目的基因片段扩增。
消减杂交扣除了实验组和对照组之间同源序列,再结合抑制性PCR的动力学富集,实现高效分离低丰度特异性非同源片段。
简述（或图解）菌落（或噬菌体）原位杂交的基本步骤？
※
原位杂交就是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA释放出来，并使之固定在滤膜上。
然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DNA。
简述受体细胞的选择应符合哪些基本原则？
便于重组DNA分子的导入，例如细菌，容易诱导形成感受态的细菌细胞。
能使重组DNA分子稳定存在于细胞中，通常的做法通过修饰改造，选择某些限制性核酸内切酶缺陷型细胞，即限制与修饰体系缺陷型细胞。
便于重组体的筛选，选择与载体所含的选择标记互补匹配的受体细胞，例如重组子含有TetR基因，而受体细胞没有TetR基因。
遗传稳定性高，容易扩大培养或发酵生长。
安全性高，无致病性，不会对外界环境造成污染。
选用内源蛋白水解酶基因缺失的或含量低的细胞，利于外源基因表达产物在细胞内的积累。
受体细胞不能干扰重组子遗传密码的正确阅读与翻译。
具有较好的转译后的加工机制，便于真核目的基因的高效表达。
在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
简述真核生物前体mRNA转录加工过程的4种方式？
5‘末端“戴帽”：
转录开始后，在先导片段的5‘末端加上7-甲基鸟苷酸，这个“戴帽”可以保护5‘末端不受碱性磷酸酶和核酸酶的消化，使mRNA保持稳定作用，此外，它还有利于mRNA与rRNA的结合。
如果阻碍了mRNA戴帽，则mRNA的翻译能力大大降低。
线粒体和叶绿体中的mRNA转录物不发生戴帽。
3‘末端加尾：
通过多聚腺苷合成酶（末端转移酶）的催化作用，在mRNA3‘末端加接上一串腺苷酸（100-200个）尾巴即Poly（A）。
Poly（A）是mRNA由细胞核进入细胞质所必须的，同时，大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。
切除内含子：
真核生物前体mRNA的内含子5‘端和3‘端的剪接点各有一个共有序列，是剪接的识别位点（5′GT、3′AG）。
只有剪接后的mRNA才能从细胞核进入细胞质，否则不能穿过核孔。
甲基化：
前体mRNA上有的核苷酸出现甲基化修饰。
这也是保持mRNA分子稳定所需要的。
简述在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略？
优化表达载体的设计：
组合强启动子和强终止子，增加SD序列中与核糖体16SrRNA互补配对的碱基序列，调整SD序列与起始密码ATG之间的距离及碱基种类。
提高稀有密码子tRNA的表达作用：
采用点突变等方法将外源基因中的稀有密码子转换成受体细胞高频出现的同义密码子。
提高外源基因mRNA的稳定性：
对于原核细胞，最好选择一个RNase缺失的突变受体细胞或受体菌。
对于真核细胞，要考虑增加mRNA的正确加工。
此外，还可以通过改变mRNA的结构，使其不容易被核酸酶识别，从而达到不被降解的目的。
提高表达产物的稳定性
优化发酵过程：
由于大肠杆菌在实验室发酵罐的新陈代谢过程与大规模工业化发酵罐的新陈代谢是有差别的，在进行工业化生产时，工程菌株大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。
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