支原体衣原体立克次体文档格式.docx
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此两种方法可将支原体分成若干血清型。
5）抵抗力4℃放置不超过3天，56℃很快灭活。
对热、干燥非常敏感，冻干能长期保存。
因支原体无细胞壁，对青霉素、头胞菌素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对脂溶剂、去垢剂和石炭酸、甲醛等常用消毒剂敏感。
（2）临床意义
肺炎支原体是非典型肺炎的病原体，主要侵犯呼吸系统。
肺炎支原体黏附于黏膜上皮细胞的受体上，吸取宿主细胞的养料生长繁殖，同时释放有毒代谢产物如过氧化氢、核酸酶等使细胞受损。
主要通过呼吸道传播，青少年易感，冬秋季较多见，引起间质性肺炎和急性支气管炎，占肺炎发病率的15%~20%，病理变化以间质性肺炎为主。
（3）微生物检验
1）检验程序
标本
分离培养直接镜检PCR查DNA
（含血清和酵母浸膏培养基）
37℃、5%CO2
1～2周
典型的菌落
鉴定
革兰染色不着色生化反应血清学试验
电镜观察无细胞壁
图肺炎支原体的检验程序
2）标本采集一般可取病人痰、咽拭子、鼻咽洗液、支气管分泌物等。
因肺炎支原体有粘附细胞的作用，以拭子标本为好。
支原体对热和干燥敏感，取材后应立即接种或置转运培养基中（蔗糖磷酸盐缓冲液），4℃能保存72h，-70℃或液氮能长期保存。
3）检验方法
显微镜检查革兰染色不易着色，电子显微镜观察无细胞壁，易与细菌鉴别。
分离培养常用的培养基以牛心消化液为基础另加20%小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基。
在含5%CO2大气环境下培养，初分离时，一般10d左右长出菌落，呈致密圆形，常不出现油煎蛋状，需经数次传代后，菌落开始典型。
肺炎支原体的分离阳性率不高，对临床快速诊断意义不大，但对流行病学调查有重要意义。
4）鉴别要点
支原体的鉴定主要靠形态染色、菌落特征、生化反应及特异性生长试验等。
支原体在固体培养基生长有陷入培养基生长的趋势，经7~10d培养可形成细小的菌落，观察时最好用低倍显微镜或倒置显微镜。
支原体的菌落多为中心致密凸起，四周浅薄，呈典型的油煎蛋菌落。
用Diene染色，支原体菌落中心为翠蓝色，边缘浅蓝色，且不易褪色，其它细菌不着色。
与细菌L型的区别细菌L型也有多形性，也对低渗敏感，也可形成油煎蛋菌落，易与本菌混淆，但细菌L型在无抗生素等诱导因素作用下，可返祖为原菌，染色后易褪色，以此可鉴别。
种间的鉴别依据支原体对葡萄糖、精氨酸、尿素这三种物质利用情况不同可初步分类。
肺炎支原体分解葡萄糖和精氨酸，在含葡萄糖的培养基上生长产酸，使酚红指示剂变黄，尿素试验阴性；
解脲支原体不分解葡萄糖和精氨酸，尿素变红，尿素酶试验阳性；
人型支原体分解精氨酸，不分解葡萄糖，在含精氨酸的培养基中可分解精氨酸产NH3，使PH升高，酚红指示剂变红。
5）核酸检测：
PCR法快速、敏感、特异，目前有些实验室用这一技术检测患者痰中肺炎支原体DNA。
由于此法相当敏感，故试验操作时应特别小心，避免污染。
3．解脲脲原体
解脲脲原体（Ureaplasmaurealyticum,Uu）也称溶脲脲原体，是1954年Shepard首先从非淋球菌尿道炎（NGU）患者的尿道分泌物中获得，因其菌落细小，故曾称为T支原体（T-mycoplasmas）。
按其分解尿素的特性命名为解脲脲原体。
解脲脲原体是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌之一，它与人类的多种疾病有关。
（1）生物学性状
1）形态与染色解脲脲原体呈高度多形性，常见形态为球形、杆形及长丝形。
革兰染色阴性但不易着色，姬姆萨染色呈紫蓝色。
无细胞壁，细胞膜由三层薄膜构成，内、外两层由蛋白质组成，中层为类脂质。
2）培养特性解脲脲原体营养要求很高，需要供给胆固醇和酵母，常用的基础培养基为牛心消化液，在液体选择培养基中35℃培养18~24h，因分解尿素使培养基变成红色；
在固体培养基上35℃培养2~3d，形成细小（仅10~40m）、周边较窄的油煎蛋样菌落（需用低倍显微镜观察）。
3）生化反应不分解葡萄糖和精氨酸，但可利用尿素，放出氨气，能吸附豚鼠及绵羊红细胞，四氮唑还原试验阴性。
4）抗原结构解脲脲原体除脂多糖抗原和蛋白质抗原外，还有脲酶抗原，后者是解脲脲原体种特异抗原，可与其它支原体区别。
解脲脲原体有16个血清型，其中以第4型引起疾病的频率最高。
5）抵抗力由于解脲脲原体与其它支原体一样，无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易被脂溶剂、清洁剂、酒精、特异抗体和补体溶解。
对热抵抗力差，对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，常用于治疗并能获效的主要是大环内脂类、四环素内、林可霉素类及喹诺酮类等抗生素。
解脲脲原体主要引起人体泌尿生殖系统的感染，主要传播途径为性接触传播和母婴传播，其致病机制可能与其侵袭性酶和毒性产物有关，解脲脲原体吸附宿主细胞后，可产生磷脂酶分解细胞膜中的磷脂，影响宿主细胞生物合成。
尿素酶分解尿素产生氨，对细胞有毒性作用。
产生IgA蛋白酶，可降解IgA1形成Fab和Fc，破坏泌尿生殖道粘膜表面IgA的局部抗感染作用，有利于解脲脲原体粘附于泌尿生殖道粘膜的表面而致病。
解脲脲原体所引起的疾病最常见的是非淋菌性尿道炎，还可致子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎、自然流产、围产期疾病及死亡，也可引起肾盂肾炎、阴道炎和盆腔炎。
解脲脲原体与不育症的关系还有争论，已有资料表明解脲脲原体可吸附精子，影响精子的运动活力，使精子的代谢和功能受损
标本（尿道、阴道分泌物等）
PCR、DNA探针技术
检测DNA
图解脲脲原体的检验过程
2）标本采集用无菌棉拭子或无菌试管取非淋菌性尿道炎患者的尿道分泌物，慢性前列腺炎患者按摩后的前列腺液，原因不明不育症患者的精液，阴道炎与宫颈炎患者的炎性分泌物，羊水和血液等。
核酸检测以部分脲酶基因的核苷酸序列为模板，合成相应的引物经体外扩增后，解脲脲原体16个血清型均见460bp的DNA片段。
通过对PCR产物的核酸杂交和序列分析，可将各种支原体鉴别分类。
该法敏感性高，但假阳性较高，故不适用于临床。
ELISA不仅可以测定血清型别，还可测出Ig的类型（IgM、IgG），较敏感，特异性强，有早期诊断意义。
分离培养、鉴定及药物敏感试验应用选择鉴别培养基对解脲脲原体进行分离，配合使用鉴定、计数和药敏试验板，可同时对解脲脲原体进行鉴定、计数和多种抗生素的药敏测定，体外药敏实验有助于指导临床用药。
将标本接种于含营养、尿素、精氨酸和酚红指示剂的培养基中（pH6.3），标本如有解脲脲原体存在，在37℃培养24~48h,由于解脲脲原体生长，分解尿素或精氨酸，产氨使培养基变碱，pH上升至7.6~8.6左右，液体培养基颜色由橙黄色转变成红色可判定有解脲脲原体生长。
解脲脲原体在液体中不出现菌膜，浑浊及沉淀生长现象，如培养基出现浑浊，表明有杂菌污染，不能报告解脲脲原体阳性。
（二）衣原体
衣原体是一类能通过滤菌器、严格细菌内寄生、有独特生活周期的原核细胞型生物。
其共同特性：
①有DNA和RNA两种类型核酸。
②具有LPS和蛋白质所组成的细胞壁。
③通过独特的生活周期，二分裂方式繁殖（类似细菌）。
④有核糖体。
⑤有较为简单的酶系统，能进行一定的代谢活动。
⑥对许多广谱抗菌素敏感。
衣原体属（Chlamydia）是衣原体科唯一的一个属，包括沙眼衣原体（C.trachomatis）、鹦鹉热衣原体（C.psittaci）、肺炎衣原体（C.pneumoniae）和猫心衣原体（C.pecorum）4个种。
衣原体在宿主细胞内生长繁殖，有独特的生活周期，以两种发育类型存在：
①原体（elementarybody，EB）是衣原体胞外存在形式，圆形（直径0.25〜0.35m）,中央有一致密的拟核，有较致密而坚韧的细胞壁，是发育成熟的衣原体，Giemsa染色呈紫色，具有高度的感染性；
②网状体（reticulatebody）或称始体（initialbody，IB）,圆形（直径0.5~1.0m）或不规则形，中央成纤细的网状结构，无致密拟核，Giemsa染色呈兰色。
始体为宿主细胞内的繁殖体，代谢活泼，不能在胞外存活，无感染性。
原体与易感宿主细胞表面的特异受体吸附后，通过吞噬作用进入细胞内，形成吞噬小泡，阻止吞噬溶酶体融合。
原体在泡内细胞壁变软，增大形成网状体，RNA增多。
大约8h后，始体二分裂增殖，在细胞膜包裹的空泡内聚集、扩增，即称为包涵体（inclusionbodies）。
于感染1824h后，网状体浓缩形成具有坚韧细胞壁的原体，最后细胞破裂释放原体，再感染其他细胞，开始新的发育周期。
每个发育周期约需4872h。
1．沙眼衣原体
沙眼衣原体又分为沙眼、性病淋巴肉芽肿和鼠型三种生物变种。
前两种生物变种自然宿主都是人。
分别感染眼、生殖道、呼吸道以及淋巴结，鼠型在鼠间传播。
沙眼生物变种又可分为12个血清型（A-K），性病淋巴肉芽肿生物变种可分为3个血清型（L1-L3）。
（1）细菌特性
1）形态与染色沙眼衣原体的原体有较致密而坚韧的细胞壁，存在与细胞外，具有高度感染性。
原体用Giemsa染色呈红色；
始体（网状体）体积较大，呈深蓝色或暗红色。
沙眼衣原体在宿主细胞的细胞质内形成包涵体，由密集的颗粒组成，Giemsa染色呈深紫色，其基质中含有糖原，用碘液染色呈棕褐色斑块。
2）培养特性
HeLa-229或McCoy细胞分离方法有小玻瓶法和微量滴板法两种，前者在玻璃小瓶内盖玻片上培
养，后者用96孔（或24、48孔内置盖片的）平底塑料板培养，常在大量标本分离时应用。
一般塑料板培养不如小瓶培养敏感。
鸡胚卵黄囊接种各种衣原体均可在鸡胚卵黄囊内生长繁殖。
3）抗原衣原体的抗原性相当复杂，有属、种、型等特异性抗原。
属特异抗原：
所有衣原体都具有的共同抗原存在于衣原体的细胞壁中，并存在于衣原体的整个生活周期中。
在宿主体内可产生补体结合抗体，在血清学试验中可作为共同抗原。
种特异抗原：
位于主要外膜蛋白上，可用补体结合试验和中和试验检测。
型特异抗原：
也位于外膜蛋白上，用微量间接免疫荧光法可将沙眼衣原体分为15个型别。
4）抵抗力沙眼衣原体感染材料在35℃~37℃条件下，经48h左右即失去活力，56℃5~6min灭活。
-70℃可保存数年，冷冻干燥可保存30年以上仍有活性。
0.1%甲醛或0.5%石炭酸溶液24h杀死衣原体，2%来苏仅需5min。
红霉素、四环素、强力霉素或青霉素对衣原体有抑制作用。
沙眼衣原体引起的生殖道感染是最常见的性传播疾病之一。
女性经常引起严重的并发症，包括：
宫颈炎、尿道炎、子宫内膜炎、盆腔炎、异位妊娠和不孕症。
在生产过程中由母亲垂直传播给新生儿可引起眼结膜炎和新生儿肺炎；
男性可引起尿道炎和附睾炎。
至少40%的非淋菌性尿道炎是由于衣原体的感染引起。
在发展中国家，沙眼衣原体引起的眼结膜炎是主要致盲的原因。
（3）微生物学检验
1）检验程序
标本
直接检验分离培养
鉴定
（2）标本采集
眼和泌尿生殖道：
沙眼和包涵体结膜炎病人，用拭子在结膜上穹窿或下穹窿用力涂擦，或取眼结膜刮片。
沙眼衣原体尿道炎采样因其仅感染柱状及鳞-柱状上皮细胞，可取女性宫颈拭子，男性尿道拭子及男性尿液。
性病淋巴肉芽肿：
采淋巴结脓汁，用肉汤或组织培养营养液适当稀释，以供分离。
3）检查方法
显微镜检查：
由于衣原体在宿主细胞内出现包涵体，用光学显微镜观察有一定预诊意义，特别在眼结膜、尿道及子宫颈上皮细胞内发现典型包涵体更有沙眼衣原体感染的参考意义。
但包涵体的检出对急性、严重的新生儿包涵体性结膜炎的诊断价值大，而对成人眼结膜和生殖道感染的诊断意义次之。
a.Giemsa染色：
标本涂片干燥后，经Giemsa染色镜检，原体染成紫红色，网体呈兰色，此法简单易行，但敏感性较低。
b免疫荧光检查：
用直接法荧光抗体（DFA）染色检测上皮细胞内的典型衣原体抗原。
分离培养
a.细胞培养分离衣原体的细胞有HeLa-229或McCoy细胞等，在装有盖玻片的小培养瓶中加入HeLa-229或McCoy，加入Eagle氏液或199营养液、10%灭活小牛血清等，培养24小时使细胞长成单层。
然后接种标本，经37℃培养72小时后，取出盖玻片经姬姆萨染色或荧光染色，如标本中有沙眼衣原体染色后可见蓝色、深蓝色或暗紫色的包涵体。
b.鸡胚培养所选用的鸡胚必须来自饲料中不加抗生素的养鸡场，而且种鸡应无衣原体的感染。
培养后如卵黄囊膜涂片发现衣原体、连续传代鸡胚死亡，并经血清学鉴定为阳性者，即为阳性分离结果。
免疫学检测
金标快速检测法原理在检测卡的硝酸纤维膜的检测线上固定有抗衣原体属特异性抗原LPS的单克隆抗体，对照线上固定有抗鼠IgG的抗体，处理后的样品首先与结合了抗衣原体单克隆抗体的胶体金颗粒混和，并靠毛细管作用向检测线移动。
如果样品中含有衣原体则可形成双抗体夹心免疫复合物，并聚集在检测区形成一条红线。
无此红线则表示样品中无衣原体存在，无论样品中有无衣原体存在，对照区总应该出现一条红线，表示检测系统工作正常。
对女性子宫颈棉拭、男性尿道棉拭或尿液标本，采用此法可直接定性地检测衣原体抗原，用于诊断衣原体感染。
核酸检测
a.PCR检查尿道和宫颈拭子、初段晨尿等标本中特异性DNA片段。
此法敏感性较高，临床慎用。
b.核酸杂交用125I标记的沙眼衣原体rDNA探针检测宫颈标本的衣原体，该法检测只需1h,且无放射危害,其敏感性和特异性与细胞培养相比分别为82.8%和99.4%。
2．其它衣原体
（1）鹦鹉热衣原体
鹦鹉热衣原体也有衣原体独特的生活周期。
包涵体较致密，形态不一，不含糖原，碘染色阴性，是与沙眼衣原体鉴别要点之一（沙眼衣原体含糖原，碘染色阳性）。
主要使动物感染，一般存在于动物肠道，由粪便排出污染环境，人偶尔接触被感染的动物而引起呼吸道疾病，人与人之间的接触不被传染。
可采取病人血液、痰或咽喉含漱液，尸检材料取肺、肝和脾等组织，也可采腹腔和心包渗出液。
可通过显微镜检查、分离培养及免疫学方法进行检测。
（2）肺炎衣原体
肺炎衣原体也有独特的生活周期。
寄生于人类，主要引起青少年急性呼吸道感染，可引起肺炎、支气管炎咽炎和鼻窦炎等，起病缓慢，临床表现为咽痛、声音嘶哑等症状，肺炎衣原体慢性感染与急性心肌梗死和慢性冠心病的关系越来越引起人们的注意。
通常取咽拭标本或支气管肺泡灌洗液通过显微镜检查、细胞分离培养等进行检测。
（三）立克次体
立克次体是一类微小的杆状或球杆状、革兰氏染色阴性、绝大多数只能在宿主细胞内繁殖的原核细胞型微生物。
生物学分类属立克次体目（Rickettsiales）、立克次体科（Rickettsiaceae），对人类致病的立克次体主要包括立克次体科的立克次体族（包括立克次体属、罗沙利马体属和柯克斯体属）和埃立克体族（包括埃立克体属、库里克体属和新立克次体属）的20余个种。
立克次体属又分为3个生物群，即斑疹伤寒群、斑点热群和恙虫病群，其中以斑点热群的成员最为复杂。
常见病原性立克次体及其分布和所致疾病。
立克次体的共同特点是：
①大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出疹性疾病；
②以节肢动物为传播媒介或储存宿主；
③大小介于细菌与病毒之间，光镜下成多形态性，主要为微小的杆状或球杆状，革兰阴性；
④除少数外全是专性活细胞内寄生；
⑤菌体内同时含有DNA和RNA两类核酸；
⑥以二分裂方式进行繁殖；
⑦对抗生素敏感。
综上特点，分类学上将立克次体归入广义的细菌范畴。
1．细菌特性
（1）形态染色
立克次体具有明显的多形性，多呈球杆状，也有球状、短杆状、长杆状及长丝状，可单个也可成对排列，大小为（0.30.6m）（0.82.0m）。
有类似细菌的结构，在电子显微镜下可见细胞壁和细胞膜。
细胞壁结构包含双层磷脂组成的外膜、肽聚糖以及由蛋白质、脂类和多糖组成的其他层次，不含磷壁酸，与革兰阴性菌的细胞壁相似；
胞质内有核糖体和核质，无核膜与核仁。
常用的染色方法有Giemsa、Macchiavello和Gimenez染色。
（2）培养特性
除罗沙利马体可在没有活细胞的人工培养基上生长繁殖外，立克次体必须寄生在或细胞体内，不能在无细胞的培养基上生长，因为酶系统不完善，不能独立地进行新陈代谢，必须借助宿主细胞的中间代谢物质转成其本身所需要的物质和能量。
常用的培养方法有动物接种、鸡胚卵囊内接种及组织细胞培养等。
细胞培养通常需要34d，一般对细胞的选择并不严格，可以在鸡胚、哺乳动物和节肢动物等多种类型的细胞中生长。
大部分立克次体不引起感染细胞明显的细胞病变，但可形成空斑。
主要的繁殖方式与细菌一样，进行二分裂法繁殖，但生长速度较一般细菌慢，912h繁殖一代。
立克次体通过三羧酸循环氧化谷氨酸所生成的能量转化为ATP，除伯氏柯克斯体（Q热立克次体）外，所有病原性立克次体都不能氧化葡萄糖获得能量。
（3）抗原结构
在立克次体的细胞壁上有群和特异性抗原（脂多糖蛋白的复合物），用凝集反应和补体结合反应可以测定。
某些立克次体还具有耐热耐碱的多糖类抗原（又叫抗原），与部分变形杆菌菌株（O2、、O19、OK）有共同抗原，可发生交叉反应，因此可利用这些变形杆菌代替有关立克次体做凝集反应，以检查人或动物血清中的相应抗体，这种交叉凝集反应称为外斐氏反应（Weill-Felixreaction）。
（4）抵抗力
对理化因素的抵抗力，除Q热立克次外都较弱。
56℃30min均能灭活。
耐低温、干燥、在干虱粪和干蜱粪立克次体可保留传染一年以上。
对紫外敏感，30min即灭活。
对常用消毒剂如5g/L的石炭酸、0.5%皂酚液、0.1%甲醛液、70%酒精等均较敏感，数分钟既可杀死。
多种抗生素对立克次体均有抑制作用，但对磺胺类药物不敏感。
2．普氏立克次体
1）形态染色普氏立克次体有显著的多形性变化，基本形态为短杆状，大小约0.3m0.6m，也可见长杆状或球形；
单个或成双球状、链状排列。
革兰氏染色阴性，Giemsa染色呈紫红色，并有两极浓染；
用Gimenez或Macchiavello染色时均呈红色。
立克次体大量存在细胞质内，也有散在于细胞外的，这是由于细胞破裂立克次体被释放所致。
鸡胚卵黄囊培养以无菌法取病人患病初期的血或血块研磨悬液接种约68日龄的鸡胚卵黄囊内。
一般通过34代鸡胚即能逐渐适应于卵黄囊膜上而大量繁殖。
立克次体发育旺盛时多在48d使鸡胚死亡。
细胞培养常用单层细胞培养和空斑技术。
普氏立克次体在鸡胚纤维母细胞、鼠胚肌皮细胞、人羊膜细胞和豚鼠、地鼠、猴肾细胞以及Hela细胞、Detroit—6细胞等原代细胞与传代细胞中均能获得良好繁殖。
体虱培养人的体虱对普氏立克次体最为敏感，多用虱肛注射法或皮膜喂虱法。
小白鼠滴鼻感染培养用乙醚轻度麻醉小鼠后，将含普氏立克次体的感染材料用注射器针头向小鼠鼻孔滴入0.1ml，小鼠一般于感染后34d发病、死亡。
及时解剖，取肺组织，该立克次体在鼠肺中繁殖旺盛。
（2）临床意义
普氏立克次体是流行性班疹伤寒的病原体，它常以人虱为媒介在人群中进行传播，往往引起大流行。
它能使病人发生立克次体血症，引起高热、剧烈头痛和全身斑丘疹，故所致疾病称斑疹伤寒。
人感染普氏立克次体后，进经2星期左右的潜伏期，骤然发病，要症状为高热、头痛、皮疹，有的伴有神经系统、心血管系统等症状和其他实质器官的损害。
1）标本采集发病1周内，以无菌方式抽取患者血液注射于雄性豚鼠腹腔，逐日检测豚鼠体温并观察阴囊有无肿大，若体温超过40℃时，可取睾丸鞘膜、脑或脾，制成涂片，寻找细胞内繁殖的普氏立克次体，一般分散存在胞浆中。
若找不到病原体，可用脑组织悬液再接种豚鼠，盲目传代，以提高分离的阳性率。
未死的豚鼠可用已知普氏立克次体抗原检查其血清中有无相应抗体存在。
2）免疫学检测常用外斐氏反应及补体结合试验，也可用间接免疫荧光技术和凝集试验等方法进行检查。
3．恙虫热立克次体
1）形态染色恙虫立克次体为多形态，多为球杆状或短杆状，多成对分布，是双球菌样。
电镜观察
立克次体成圆形、卵圆形、短杆形和哑铃形等。
在感染动物组织和腹腔渗出液中，多数立克次体分布于大单核细胞质类，细胞核呈肾形，偏于细胞一侧，立克次体密集于细胞核旁或核的凹陷处，仅少数在细胞外散在。
Giemsa染色恙虫热立克次体呈紫红色，Macchiavello染色呈蓝色，Gimenez染色呈暗红色。
2）培养特性恙虫热立克次体能在广泛的宿主细胞内生长，如恙螨和某些昆虫的第二体腔细胞，虱的
中肠细胞，鸡胚纤维母细胞以及哺乳动物的各种细胞等。
细胞培养恙虫热立克次体可在多种细胞内获得良好发育，如Hela细胞、羊膜细胞，地鼠、小鼠、豚鼠、家兔和人胚的肾细胞，地鼠、大白鼠、豚鼠、家兔和猴的睾丸细胞以及鸡胚纤维母细胞等。
动物接种小白鼠和棉鼠对恙虫热立克次体很敏感，豚鼠、地鼠、家兔、猴次之，大白鼠不敏感，多呈无症状感染。
恙虫热立克次体（Rickettsiatsutsugamushi）是恙虫病的病原体，在恙螨和许多动物中广泛存在，具有典型的自然疫源性。
人、家畜和兔、猴等野生动物被含恙虫热立克次体的恙螨叮咬后感染。
恙虫热立克次体侵入人体后，随着血流播散，在血管内皮细胞即单核吞噬细胞系统中繁
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