高中生物高届高考复习资料选修三 第31讲Word下载.docx

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常用类型

E·

coliDNA连接酶

T4DNA连接酶

来源

大肠杆菌

T4噬菌体

功能

只“缝合”黏性末端

“缝合”黏性末端和平末端

结果

恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

（3）载体

①条件：

能在受体细胞中复制并稳定保存；

具有一至多个限制酶切点；

具有标记基因。

②种类

③作用：

携带外源DNA片段进入受体细胞。

2.基因工程的基本操作程序

（1）目的基因的获取

①目的基因：

主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。

②获取方法

（2）基因表达载体的构建——基因工程的核心

①目的：

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

②基因表达载体的组成

③构建过程

（3）将目的基因导入受体细胞的“三种类型”

①导入植物细胞——农杆菌转化法（花粉管通道法、基因枪法）。

其受体细胞为体细胞或受精卵。

农杆菌在自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，并将其Ti质粒上的T－DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。

②导入动物细胞——显微注射法其受体细胞为受精卵。

③导入微生物细胞——感受态细胞法，需用Ca2＋处理获得感受态细胞使其能吸收DNA分子。

3.目的基因检测与鉴定的“两个水平”

1.限制性核酸内切酶MunⅠ和限制性核酸内切酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是

和

。

如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。

适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？

并指明理由。

提示　适合的质粒是①。

由图可知，质粒②上无标记基因，不适合作为载体；

质粒③和④的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作载体。

2.下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。

请思考：

（1）EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的化学本质是什么？

其单体是什么？

两类酶识别的碱基序列及切割的位点分别是什么？

提示　蛋白质　氨基酸　EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；

SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。

（2）以上实例说明限制酶具有何种特性？

提示　专一性。

（3）要将图1中的末端再连接起来，需要用哪类连接酶，若连接图2的末端呢？

提示　连接图1中的黏性末端既可用E·

coliDNA连接酶，也可用T4DNA连接酶，连接图2中平末端只能用T4DNA连接酶。

3.已知限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—GGATCC—，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，根据图示思考下列问题：

（1）切割目的基因应选用哪类限制酶？

切割质粒呢？

请说明理由。

（2）限制性核酸内切酶Ⅰ和限制性核酸内切酶Ⅱ切割后获得的黏性末端是否相同？

（3）将基因表达载体导入受体细胞后，进行筛选时，培养基中应添加填“青霉素”还是“四环素”）？

为什么？

提示　

（1）由于限制酶Ⅰ识别位点—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ识别位点为—↓GATC—，由此可见限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，图中显示目的基因两端分别有限制酶Ⅰ、限制酶Ⅱ识别位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，然而，倘若使用限制酶Ⅱ切割质粒，则会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。

（2）相同（均具GATC—）。

（3）青霉素　因使用限制酶Ⅰ后，四环素抗性基因已被破坏。

[重点·

串讲整合]

1.诠释基因表达载体

（1）分段解读

（2）载体上标记基因的标记原理辨析

载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。

目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力——当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：

2.四类受体细胞的筛选与判定

当用相应的限制酶切割了目的基因与载体后，可将二者混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化受体细胞，其结果有如下四种：

上述四类受体细胞中通过“标记基因”（制备的培养基）可区分出①②与③④，而通过DNA分子杂交技术，可进一步区分③与④。

点悟：

“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入？

经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定（具有标记基因）的载体，然而，该载体上是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。

3.诠释基因组文库与部分基因文库

基因文库类型

基因组文库

部分基因文库（cDNA文库）

构建基因文库的过程

其他区别

①含某种生物全部基因

②有启动子、有内含子

③部分可与其他生物基因交流

①含该种生物“部分”基因

②无启动子，无内含子

③均可与其他生物基因交流

1.（2018·

全国卷Ⅱ，38）[生物——选修3：

现代生物科技专题]

某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。

某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。

回答下列问题：

（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是　　　　。

使用这两种酶进行酶切是为了保证　　　　，也是为了保证　　　　。

（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了　　　　和　　　　过程。

（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：

将能够产生绿色荧光细胞的　　　　移入牛的　　　　中、体外培养、胚胎移植等。

（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的　　　　（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。

解析　

（1）据图示信息分析：

将L1－GFP融合基因（甲）插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1－GFP融合基因的完整，又能保证L1－GFP融合基因与载体的正确连接。

（2）目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。

（3）将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。

（4）检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。

答案　

（1）E1和E4　甲的完整　甲与载体正确连接

（2）转录　翻译　（3）细胞核　去核卵母细胞　（4）核DNA

2.（2016·

全国卷Ⅰ，40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。

有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。

被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。

（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有　　　　（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。

（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_______________；

并且　　　　和　　　　的细胞也是不能区分的，其原因是__________________

_____________________________________________________________________。

在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有　　　　的固体培养基。

（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_______________________________________________________________。

解析　

（1）作为运载体必须具备如下特点：

①能自主复制，从而在受体细胞中稳定维持和表达；

②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择；

③具1～多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。

（2）在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。

而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，故不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr因而能在培养基中生长。

目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。

（3）噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。

答案　

（1）能自我复制、具有标记基因

（2）二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素

（3）受体细胞

考点二　基因工程的应用及蛋白质工程

1.基因工程的应用

（1）动物基因工程：

用于提高动物生长速度从而提高产品产量；

用于改善畜产品品质；

用转基因动物生产药物；

用转基因动物作器官移植的供体等。

（2）植物基因工程：

培育抗虫转基因植物（如抗虫棉）、抗病转基因植物（如转基因烟草）和抗逆转基因植物（如抗寒番茄）；

利用转基因改良植物的品质（如新花色矮牵牛）。

（3）比较基因治疗与基因诊断：

原理

操作过程

进展

基因治疗

基因表达

利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗（疾病）

临床实验

基因诊断

碱基互补配对

制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况

临床应用

2.蛋白质工程

（1）流程图

A.转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。

（2）手段：

基因修饰或基因合成。

（3）结果：

改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。

（4）应用：

主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。

1.既然存在基因工程，为什么还要改造蛋白质？

提示　基因工程只能产生自然界已存在的蛋白质。

2.（教材P26旁栏思考题解答）对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？

提示　毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：

（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。

如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的；

（2）蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造。

海南卷，31）[选修3：

甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。

为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。

（1）用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜　　　　（填“受伤的”或“完好的”）叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是__________________。

（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中　　　　已转移到植物细胞中且能够表达；

用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到　　　　（填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”）中。

（3）假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用　　　　作为外植体进行组织培养。

（4）通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

因此，基因工程的含义可概括为_____________________________________________________________

____________________________________________________________________。

解析　

（1）当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，因此用农杆菌感染时，优先选用黄瓜受伤的叶片。

（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，说明目的基因——甜蛋白基因在受体细胞中已经完成表达；

若甜蛋白基因整合到线粒体基因组或叶绿体基因组中，在遗传时遵循母系遗传，不会出现固定的分离比，所以子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组。

（4）基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出符合人们需要的新生物类型和生物产品。

答案　

（1）受伤的　叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞

（2）甜蛋白基因　核基因组　（3）茎尖　（4）按照人们的愿望进行设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型

2.（2015·

全国卷Ⅱ，40）已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。

如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质（P1）不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。

（1）从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的　　　　　　　　进行改造。

（2）以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰　　　　基因或合成　　　　基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括______________________________________________________________________

的复制；

以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：

_________________________

（3）蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_________________________________________________________________

和　　　　　　　　　　，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对合成蛋白质的生物　　　　进行鉴定。

答案　

（1）氨基酸序列（或结构）　

（2）P　P1　DNA和RNA（或遗传物质）　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质（或转录、逆转录、翻译）　（3）设计蛋白质的结构　推测氨基酸序列　功能

蛋白质工程与基因工程的比较

项目

蛋白质工程

基因工程

实质

定向改造或生产人类所需蛋白质

定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品（基因的异体表达）

生产自然界中没有的蛋白质

生产自然界中已有的蛋白质

联系

蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现

考点三　PCR技术与DNA的粗提取与鉴定

1.PCR技术

（1）PCR含义：

即多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

（2）原理：

DNA双链复制。

（3）前提：

有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便据其合成引物。

（4）条件：

除需引物及控制温度外，还必须有耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）

（5）PCR反应过程

过程

说明

图解

变性

加热至90～95℃，DNA解链为单链

复性

冷却至55～60℃，两种引物结合到互补DNA链

延伸

加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶（Taq酶）从引物起始进行互补链的合成

（6）结果：

上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加——PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

2.DNA的粗提取与鉴定

（1）实验原理

（2）操作流程

（3）DNA与蛋白质在NaCl溶液中的溶解度比较

物质的量浓度为2mol/LNaCl溶液

物质的量浓度为0.14mol/LNaCl溶液

溶解规律

DNA

溶解

析出

蛋白质

部分发生盐析沉淀

NaCl溶液浓度从2mol/L降低过程中溶解度逐渐增大

仔细观察图示过程，请思考：

（1）图中方法可以获得大量目的基因，这是一种什么技术方法？

其原理是什么？

（2）图中A、B分别是什么？

其单体是否相同？

（3）过程①②③的名称是什么？

过程①首先要将反应体系的温度升高到90～95℃，其目的是什么？

如果是在体内，该过程如何完成？

提示　

（1）图中方法为PCR技术，该技术是生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA双链复制。

（2）图中A为引物，B为热稳定DNA聚合酶（Taq酶），二者单体不同，前者单体为核苷酸，后者单体为氨基酸。

（3）①为变性，②为复性，③为延伸，过程①升温到90～95℃，目的是使目的基因受热变性后解链为单链，该过程若发生于体内，需在解旋酶作用下解旋为两条单链（且为边解旋边复制）。

1.（PCR技术）（2017·

经典高考）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。

PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

（1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过　　　　获得　　　　用于PCR扩增。

（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的　　　　位点。

设计引物时需要避免引物之间形成　　　　，而造成引物自连。

（3）图中步骤1代表　　　　，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。

（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。

退火温度过高会破坏　　　　的碱基配对。

退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但　　　　的引物需要设定更高的退火温度。

（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有　　　　。

（填序号：

①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物）。

解析　

（1）由mRNA获得目的基因片段需通过逆转录获得的片段为cDNA。

（2）为方便构建重组质粒，宜在引物中增加适当的限制酶位点以便使复制出的目的基因两端含限制酶切点；

设计引物时，需避免引物之间碱基互补配对，以防引物间自连。

（3）图中步骤1为高温下实现DNA变性解链。

（4）PCR扩增时，若退火温度过高会破坏引物与模板间的碱基互补配对，DNA片段中G与C间可形成三个氢键，G—C比例越高时DNA分子越稳定，其退火温度应越高。

（5）若PCR反应得不到任何扩增产物，则可通过降低退火温度及重新设计引物等措施，以便使引物与模板结合，从而进行后序扩增过程。

答案　

（1）逆转录　cDNA　

（2）限制性核酸内切酶　碱基互补配对　（3）变性　（4）引物与模板　G—C含量高

（5）②③

2.（DNA的粗提取与鉴定）DNA的粗提取与鉴定的实验（如图）：

（1）本实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡的全血，主要原因是鸡血细胞液中　　　　含量较高，另外本实验不适合用哺乳动物的血细胞液，原因是______________

（2）图中A所示加入蒸馏水的目的是__________________________________

___________________________________________________________________。

（3）通过图中B所示步骤取得滤液后，再向滤液中加入2mol/L的NaCl溶液的目的是_______________________________________________________________

（4）图中C所示加入蒸馏水的目的是____________________________________

（5）为鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA，可用　　　　试剂进行检验，在沸水浴条件下，冷却后可以看到颜色反应为　　　　色。

答案　

（1）DNA　哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核

（2）使血细胞吸水涨破，释放出核物质DNA

（3）使DNA溶解于NaCl溶液中

（4）使DNA的溶解度下降而析出

（5）二苯胺　蓝

（1）DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”

加蒸馏水2次

①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；

②加到含DNA的2mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14mol/L，使DNA析出

用纱布过滤4次

①过滤血细胞破裂流，得到含细胞核物质的滤液；

②过滤用2mol/L的NaCl充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；

③滤取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA（黏