卫生化学实验归纳预防医学Word格式.docx
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（5）测定标准系列和样品。
（6）测定结束后，应先关闭氩气阀门，待距焰熄灭后，再关闭电源。
3、标准曲线的绘制
（1）首先用浓度最高的混合标准溶液测定ATT值（告诉仪器最高浓度是多少，测完之后用纯水洗一下），然后依次测定不同浓度混合标准溶液中各元素的发射强度，测量结束后，仪器自动绘出标准曲线。
4、发样的测定
用与标准系列同样方法测定光强度，然后从标准曲线上查出发样中各元素含量。
若某种元素浓度超过最高浓度限值，要进行稀释。
【结果及公式】
以c为横坐标，原子发射谱线强度（
）为纵坐标，根据样品中各元素的
从标曲中得到其浓度cx
【注意事项】
器皿等玻璃器材不要随意放置，以免污染。
进样：
样品→毛细管→雾化器雾化→雾化室进一步雾化→炬管→光学系统
紫外分光光度法测定蛋白质的含量
【实验原理】
蛋白质分子结构中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，具有吸收紫外光的性质，其最大吸收波长为280nm左右。
在一定实验条件下，蛋白质溶液的吸光度与其浓度符合Lambert–Beer定律，据此可对蛋白质进行定量分析。
结构：
光源→单色器→吸收池→检测器→显示系统
此次试验用紫外光，所以选用石英比色杯。
Q或者S表示石英的意思，放置时字母要朝同一个方向。
比色杯为成对的，不能混用。
1.吸收光谱曲线的绘制：
以生理盐水作参比，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，从200～400nm扫描任一牛血清白蛋白标准液的吸收曲线并找出最大吸收波长（λmax）。
2.标准曲线的绘制：
移取5.00mg/ml牛血清白蛋白标准应用液0.00、0.50、1.00、1.50和2.00ml，分别置于10ml比色管中，用生理盐水稀释至刻度，摇匀。
以生理盐水作参比，在λmax波长下测定吸光度，以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3.未知蛋白质溶液的测定：
准确移取血清样本0.1ml，置于10ml比色管中，定容至刻度。
以生理盐水作参比，在λmax波长下测定吸光度。
【实验结果】
Cx=C×
稀释倍数
其中Cx为待测蛋白质溶液的质量浓度；
C为由标准曲线确定的被测溶液蛋白质的质量浓度
1.由于蛋白质的紫外吸收峰常因溶液pH的改变而改变，测定时未知溶液与标准溶液的pH要一致。
2.紫外分光光度法测定蛋白质的准确度较差，其主要原因为不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，使得不同蛋白质溶液在280nm的吸光系数也不同。
样品中若含有核酸，可分别测定在280nm和260nm的吸光度值，用经验校正公式计算蛋白质的浓度。
蛋白质浓度=1.45×
A280－0.74×
A260（mg/mL）
【仪器电脑操作】
仪器连接自检→光谱扫描（设置200～400nm高速扫描）→方法设置（选择λmax，多点，固定波长，改单位）→进行测定（输入号码和浓度，记录吸光度值）
荧光分析法测定尿中核黄素（VB2）含量
核黄素（VB2）在一定波长的光波照射下发荧光。
在PH6~7的溶液中荧光最强，在其他条件恒定时，荧光强度F与VB2浓度C成正比，即F=KC；
当PH>
11时荧光消失。
尿中共存物质干扰VB2的测定，需要将尿液通过硅镁吸附柱，使其中VB2被硅镁吸附柱吸附，再用洗脱液洗脱，测定洗脱液中VB2的荧光强度。
采用标准曲线法进行测量。
光源（氙弧灯200~800nm；
高压汞灯卤钨灯一般用于荧光计）→分光系统（两个单色器，第一单色器在光栅和样品池之间用于选择发射波长；
第二单色器位于样品池和检测器之间与激发光源成90°
以消除透过光影响，选择荧光波长）→样品池→检测器→显示系统
比色皿四面光滑
1、装柱脱脂棉塞住吸附柱下端→硅镁吸附剂与蒸馏水混合装柱（约占柱长的2/3左右）→用双蒸水测试流速，控制流速在60~80滴/分，柱内应无气泡。
2、标准曲线的的绘制
标准液配制（0.5mg/L）：
取25mg/L的标储液1ml于50ml棕色容量瓶，定容混匀。
（1）吸附：
取VB2标准应用液0.00,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50ml，分别过柱，用15~20ml热水（60~70℃）淋洗柱子（去除共存杂质）。
（2）洗脱：
将10ml比色管接在柱子下方，每个吸附柱中加入5ml洗脱液（洗脱VB2），待流尽后再用不足5ml的蒸馏水淋洗柱子，流出液一并盛入比色管中，双蒸水定容至10ml。
混匀，避光保存。
（3）测定：
取任意标准管溶液，固定荧光波长535nm，在350~500nm的波长范围内，测定不同激发光波长下的荧光强度，以激发光的波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制激发光谱，选择激发光波长（λex）。
固定激发波长λex，在450~600nm的波长范围内，测定不同荧光波长下的荧光强度，以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制荧光光谱，选择荧光光波长（λem）。
在固定λex和λem的条件下，分别测定不同浓度标准溶液洗脱液中VB2的荧光强度，以VB2的浓度C为横坐标，相对荧光强度
为纵坐标，挥之标准曲线。
洗脱液（丙酮：
冰醋酸：
超纯水=5:
2:
9）
3、测定样品
取尿样5ml，通过吸附柱进行吸附（VB2和杂质都会被吸附，热水将杂质洗脱，VB2易溶于有机溶剂，被保留在吸附柱上）、洗脱（洗脱液洗脱VB2）和荧光测定。
【电脑操作】
打开荧光光度计电源预热30min→打开操作软件→采集模式选光谱模式→λex（激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标）→λem（以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标）→改为定量模式→输入λex，λem→测定
【实验结果及处理】
公式：
尿中VB2含量（mg/L）=样品管中VB2浓度×
10÷
取尿量
1、操作应在避光下进行。
2、装住时要与水混装，以免柱内形成气泡和空隙。
3、测定前用洗脱液通过硅镁吸附柱，检查是否有荧光物质，有则用丙酮清洗烘干待用
石墨炉原子吸收法测定样品中铅的含量
样品用基体改进剂稀释后直接注入石墨管中，通过程序升温将样品灰化及原子化。
在λ=283.3nm条件下测定铅基态原子蒸汽的吸光度，在一定实验条件下，其吸光度与溶液中铅的浓度呈正比，即A=Kc，据此进行定量分析。
组成：
铅元素灯共振线→石墨炉中原子→分光系统
水循环系统防止石墨管氧化，高纯氩气保护石墨管
原子化过程：
干燥、灰化、原子化、净化
1、血清样品处理
用微量移液管吸取血清100μg置于1.5ml的塑料离心管中，加入0.9ml的纯水（稀释10倍），在漩涡混合器上充分震摇均匀。
2、仪器工作条件
λ=283.3nm，灯电流为13mA，狭缝宽度为0.4nm，氘灯背景矫正，氩气流量0.6L/min。
石墨炉工作条件使用仪器推荐条件（因本次试验不使用基体改进剂，灰化温度应改为550℃）。
进样体积20μl，读数方式为峰面积。
3、工作曲线的绘制
将100μg/ml的铅储备液逐级稀释1000倍至100μg/L的铅标准溶液放入自动进样器，用稀释液稀释（机器自动稀释）到10、20、30、40μg/L，以稀释液为标准空白，依次进样测定，得到工作曲线。
4、样品测定
按仪器测定条件测定血清样品和试剂空白。
1、铅标准应用液的配制应采用逐级稀释法，以减小误差。
（1ml→10ml→1ml→10ml→1ml→10ml）
2、铅是高温下易挥发元素，在不使用基体改进剂时，灰化温度不能超过600℃。
【仪器操作】
1、开机预热→光源开关打开→接通氩气→打开电脑系统（xxx32xxA？
？
）→将元素灯点亮（预热15min~30min）→背景校正（看AA，BG值是否正常）→建立方法（newmethod）→设置（settings）测量次数、温度→自动采样量、设置采样位置→标准系列（方程选择回归线性过零点，看单位，设置标准系列稀释浓度及储备液位置）
2、设置样品信息→设置样品位置、样品身份（血清）、体积
3、看看灯的稳定性（预热时间不够，寿命等影响稳定性）
4、石墨炉设置→手动校准自动进样器→自动检查→清洁石墨炉
5、检测→稀释剂的纯水放在1号位→铅的标准品2号→血清样品3号
电化学实验
实验一溶出伏安法测定水中铅含量
当在工作电极上加上一定电位进行预电解时，待测样品中的铅还原富集在电极上并与电极上的汞生成汞齐，然后施加反向扫描电压，此时汞齐中的铅便氧化溶出，其氧化电流与待测样品中的铅浓度成正比，因此可作定量分析。
1.打开LK2006A型电化学分析系统，选择“线性扫描溶出伏安法”，设置镀汞实验。
参数:
灵敏度 10μA/V；
起始电位0.000V；
滤波参数 10Hz；
电沉积电位-1.000V；
放大倍率 1；
扫描速度 100mV/s；
平衡时间 10s；
电沉积时间 30s电位增量 1mV；
终止点位0.00V
2.将玻璃电极作工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作对极，连接到LK2006A型电化学系统，并确认电化学主机与微机系统的连接正常。
3.取30.0ml镀汞液与50ml烧杯中，插入三电极系统，接镀汞实验参数设定，镀汞，检查汞膜完好，即可测定样品，记录峰电流值h1。
4.取30ml待测样品于烧杯中。
选择“方波溶出伏安法”，设定样品测定的实验条件参数:
灵敏度 10μA/V ；
起始电位-0.100V ；
方波周期 40ms
滤波参数 10Hz ；
电沉积电位-1.000V ；
方波幅度 20mV
放大倍率 1 ；
电位增量 4mV ；
电沉积时间 30s终止电位0.00V
5.在待测样品中加入5ml铅标准溶液按上述步骤进行测定，记下峰电流值h2。
【结果计算】
根据公式：
Cx=h1×
Cs×
Vs/h2（Vx+Vs）-h1×
Vx
5、讨论
本次实验过程中出现了一个错误：
待测液和铅标准溶液的加样顺序搞混了，即在30ml的铅标准溶液中加入了5ml的待测溶液，故我们的实验结果可能存在误差。
实验二酸度计测水溶液PH
酸度计主要是由参比电极（银-氯化银电极）、测量电极（玻璃电极）和精密电位计三部分组成。
银-氯化银电极由金属银、氯化银和饱和氯化钾溶液组成，电极电位不随溶液的PH变化而变化，在一定温度下和浓度下是一个定值。
在25℃时为0.2V。
玻璃电极：
电极电位会随溶液的PH变化而变化。
主要部分头部的玻璃球泡，是由特殊的敏感玻璃膜构成。
玻璃膜对氢离子敏感，浸入被测溶液时，被测溶液的氢离子与电极玻璃球泡表面水化层进行离子交换，玻璃球泡内层也同样产生电极电势。
由于内层氢离子浓度不变，外层氢离子浓度变化，因此内外层的电势差在变化，所以该电极电势随待测液的PH值不同而改变。
离子选择性电极电位与待测离子呈能斯特响应。
K值包括内参比电极电位和难于测量和计算的液接电位，因此要用已知PH的标准缓冲液（与被测溶液PH接近）进行校正，减小由液接电位和不对称电位带来的误差。
1.使用前浸泡于蒸馏水或缓冲溶液中活化玻璃膜表面
2.玻璃电极的使用范围：
pH=1~9
3.避免碰碎或擦伤玻璃膜
4．不能测含F-的溶液和具有脱水性的溶液
5．复合pH电极需浸泡在KCl溶液中
6．电极浸入溶液需足够的平衡稳定时间
7．间隔中用蒸馏水浸泡，以稳定其不对称电位，用已知pH值的标准缓冲溶液进行定位校正可消除不对称电位的影响
8、读取PH时，还要读取温度！
★离子选择性电极电位有两部分组成，一个是内参比电极电位，一个是膜电位。
当玻璃膜与待测溶液接触之后，就会由于玻璃膜相和待测溶液相的氢离子浓度的不同进行离子交换，经过一段时间达到平衡，就产生了两个相间电位，其差值就是膜电位。
电极电位与待测溶液中氢离子离子呈能斯特响应。
实验三电导率的测定
电解质具有导电能力，并遵循欧姆定律
在一定条件下，一定浓度的电解质溶液的电阻与电极间的距离成正比，与电极截面积成反比
电导是衡量电解质溶液导电能力的物理量，是电阻的倒数
（其中k为电导率：
两电极板为1
，距离1m的平行电极板之间电解质溶液的电导）与电解质溶液的浓度有关。
1、电导率仪要预热30min才能进行电导率的测定。
2、测定前用纯水清洗电导电极。
高效液相色谱法（HPLC）测定饮料中山梨酸和苯甲酸
【实验方法与原理】
苯甲酸和山梨酸广泛用于食品防腐剂，能够引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏等。
因此国家严格限制其使用量。
在本实验中，样品首先经过超声和加热除去二氧化碳和乙醇，然后过滤注入高效液相色谱仪，经反相C18液相色谱柱分离后，紫外检测器230nm波长处检测。
以色谱峰的保留时间定性，色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量分析。
1、样品处理
碳酸饮料（雪碧）：
吸取10ml碳酸溶液超声5min（脱气），然后用微孔滤膜（0.22μm）过滤，滤液备用。
吸取100μl滤液于离心管中，并加入900μl超纯水（稀释了10倍），混合均匀标记为样品。
2、配制标准溶液
（1）取一定量的苯甲酸储备液，经滤膜过滤于离心管中。
吸取滤液50μl于另一离心管并加入950μl超纯水，得到50μg/ml的苯甲酸标准品，做好标记。
（2）同理得到50μg/ml的山梨酸标准品，做好标记。
（3）混合标准品配制：
分别吸取500μl过滤后的苯甲酸和山梨酸储备液于离心管中混合均匀，得到500μg/ml的混合标准品。
吸取50μl混合标准品（500μg/ml）于离心管中并加入950μl超纯水，得到25μg/ml的混合样，标记为混标。
3、色谱条件：
色谱柱：
C18反相键合色谱柱
流动相：
甲醇-0.02mol/L醋酸铵溶液（5:
95）
流速：
1ml/min检测波长：
230nm进样量10μl
4、标准品和样品测定
（1）分别进苯甲酸（50μg/ml）、山梨酸（50μg/ml）标准品，确定保留时间。
（2）记录混合标准品（25μg/ml）的峰面积并按下式计算样品中苯甲酸和山梨酸含量：
（3）测样品中的待测物质，根据保留时间确定苯甲酸，山梨酸的峰面积。
计算方法：
Cx=F×
Ax÷
As
式中：
Cx—为样品中被测物的含量（μg/ml）；
Cs—为苯甲酸或山梨酸标准品的含量（μg/ml）。
F—为稀释倍数；
Ax—样品的峰面积；
As—标准品的峰面积。
平衡柱子→标准样测试（样品名、进样模式-标准样、方法-建立好的方法、位置-样品放置的位置、进样量、时间）→inject进样
1、如果被测溶液含有气泡，对测定和仪器的使用均有影响，因此需要将被测溶液超声加热除去二氧化碳。
同时试验中所用的所有试剂均需脱气处理。
2、苯甲酸的灵敏波长为230nm，山梨酸的灵敏波长为254nm，在此波长测定时苯甲酸的灵敏度较低。
因此波长选择230nm。
3、平衡前用甲醇：
水（5:
95）冲洗柱子15min，再用甲醇-0.02mol/L醋酸铵溶液（5:
95）进行平衡。
4、开机顺序：
高压输液系统、进样系统、柱温箱、检测器、电脑软件。
5、使用盐做流动相的时候：
水：
甲醇=95:
5冲洗柱子20min以上；
然后用甲醇冲洗色谱柱20min以上，保存色谱柱。
6、关机：
清洗结束后，点击并将泵流量输入为0，等压力降为0时，关掉泵电源，退出Breeze工作站，再关闭仪器各部分电源及计算机。
GC-MS（气相色谱与质谱联用仪）法测定N-亚硝胺类化合物
利用色谱对混合物的高分离能力和质谱对化合物的而准确鉴定能力，可以对N-亚硝胺类化合物进行定性定量分析。
气相色谱的流动相为惰性气体，气固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。
当多组分混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附能力不同，经一段时间后，各组分在色谱柱中运行速度不同，吸附能力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器。
因此各组分可以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器，记录下来。
质谱分析是通过被测样品离子的质荷比的测定进行分析的一种方法。
被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比分开而得到的质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性，定量结果。
【知识点】
1、原理:
利用组分在两相中分配系数不同进行分离
2、载气：
惰性，
3、•检测器：
火焰离子化，电子捕获、火焰光度、氮磷、热导
•FID：
氢气与带样载气混合，引入空气，火线点火，形成氢焰，将组分离子化，在外加电场作用下，产生离子流，经信号放大，由色谱工作站记录。
•氢气：
空气：
载气=1:
10:
1
•检测器的温度要大于100℃——为了防止水在离子室冷凝，降低灵敏度
•NPD:
对环境污染物中痕量N、P化合物具有高选择性
•检测器温度>
进样口温度>
柱箱温度
4、分离条件的选择
载气流速：
最佳载气流速（此时塔板高最大，柱效最高）
柱温：
样品进样后迅速气化，气化室温度大于组分沸点
程序升温：
保证各组分都能与固定相充分接触（注意：
柱温要低于固定相的沸点）
GC-定量（内标法）
MS-确定结构，定性-全扫描（根据出峰时间定性）-sim（离子检测）定量（外/内标，选择合适的特征离子进行定量）
开始时间设为3min，使溶剂都出去再进行质谱扫描。
1、仪器保持良好的真空度-保证定量的准确度
2、防止离子源被污染
3、实验前进行柱子老化处理
4、二氯甲烷容易挥发，要及时盖好试管塞
打开气瓶-气相部分-质谱部分
软件操作：
抽真空→设定气相色谱条件→质谱条件
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