疟原虫镜检技术培训手册-1Word文件下载.doc
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恶性疟原虫和三日疟原虫无迟发型子孢子，因而恶性疟和三日疟也无复发现象
（二）红细胞内期
红外期裂殖子从肝细胞释放出来进入血液后，一部分被吞噬细胞消灭，一部分在数分钟后侵入红细胞并开始发育，进行裂体增殖，这个时期称为红细胞内期（简称红内期）。
裂殖子进入红细胞后，其细胞质内出现一个较大的空泡，最初为圆形，细胞质少，围绕着空泡，细胞核在虫体的一侧，颇似戒指的宝石，发育成早期滋养体（亦称环状体）。
以后逐渐发育，虫体和细胞核都渐渐增大，细胞质增多，并分解血红蛋白产生疟色素，其色泽、形状有种的差别，此时的疟原虫称为晚期滋养体（亦称大滋养体），因其细胞质向外伸出不规则的伪足，能呈阿米巴样运动，也称为阿米巴样体。
恶性疟原虫的环状体，在外周血液中经十几个小时的发育，逐渐隐匿在微血管、血窦或其他血流缓慢处，发育成大滋养体及裂殖体，因此在外周血液中很难看到这两个时期。
疟原虫由小滋养体发育成大滋养体的时间间日疟约须8-10个小时，恶性疟原虫10余个小时。
大滋养体发育成熟后虫体变圆，胞质内的空泡消失，核开始分裂，逐渐发育成为成熟裂殖体。
成熟裂殖体的每个核被一份胞质包绕，核的数量因不同虫种而异，一般为8～32个，称为裂殖子。
裂殖体成熟后，被寄生的红细胞破裂，释放出裂殖子。
破裂的红细胞碎片、裂殖子和疟色素等进入血液，引起疟疾临床发作。
一部分裂殖子被巨噬细胞吞食，一部分裂殖子再侵入正常红细胞，开始新一轮的红内期发育，如此循环往复，称为裂体增殖周期。
红内期发育成熟的时间，因不同虫种而异，间日疟原虫和卵形疟原虫为48小时，恶性疟原虫为24~38小时，三日疟原虫为72小时，产生相应的间日发热和三日发热等不同发热周期。
红细胞内的疟原虫经过数次裂体增殖后，部分侵入红细胞的裂殖子不再进行核分裂，而逐渐发育成为雌、雄配子体，或称大、小配子体，这是疟原虫有性生殖的开始。
成熟的雌、雄配子体被雌性按蚊吸入后，便在蚊胃内进行有性生殖。
疟原虫的生活史参见图1-1。
在按蚊叮吸携带有雌、雄配子体的人血时，红内期疟原虫进入蚊胃，但只有雌、雄配子体能在蚊体内发育和繁殖，其余各期均被消化。
雌、雄配子体在蚊体内的发育和繁殖，包括配子生殖和孢子增殖两个期。
（一）配子生殖
在蚊胃内，雌配子体的核经过减数分裂，形成圆形不活动的雌配子。
雄配子体的核分裂成4～8个，细胞浆伸出鞭毛状细丝，每1细胞核进入一条鞭毛状细丝内，形成雄配子。
雄配子游近雌配子，雌、雄配子结合形成圆形的合子，并进一步发育成长形能蠕动的动合子。
动合子穿过蚊胃壁的上皮细胞，停留于上皮细胞和弹性纤维膜之间，发育成卵囊。
此时约为吸血后的第24～72小时。
（二）孢子增殖
在卵囊内核反复分裂，形成许多梭状子孢子。
蚊胃壁上的卵囊可有数个到数十个或上百个，一个发育成熟的卵囊内可有1000到10000个子孢子。
疟原虫在蚊体内发育时间的长短与温度和湿度有关，室温24℃～26℃，相对湿度75％～80％，是蚊体内疟原虫孢子生殖最适宜的条件。
气温低于16℃或高于30℃时，发育变慢，并退化变性，直至死亡。
成熟子孢子通过卵囊的微孔逸出或卵囊破裂后扩散入血腔，最后聚集于唾腺内。
当含子孢子的雌蚊吸血时，子孢子随唾液进入人体，疟原虫开始其在人体内的发育过程。
表14种人体疟原虫的生物学特征
恶性疟原虫
间日疟原虫
卵形疟原虫
三日疟原虫
红外期发育天数
5
8
9
14-15
休眠体
无
有
红外期裂殖子数
30000
10000
15000
裂体增殖周期（小时）
36-48
48
72
寄生的红细胞特征
幼红细胞
Duffy阳性网织红细胞和幼红细胞
网织红细胞和幼红细胞
正常红细胞
红细胞胀大
明显胀大
略胀大
红细胞斑点
茂氏点
薛氏点
齐氏点
疟色素
黄褐色
棕黄色
深褐色
红内期裂殖子数
8-26
12-24
6-12
配子体
新月/腊肠形
圆形
蚊内发育天数
10
8-9
12-14
卵囊内疟色素
链状和条状
皇冠羽毛状
交叉线
聚集于边缘
图1-1疟原虫的生活史
第二章疟原虫镜下形态
采患者的血液制作涂片并染色后，可以在显微镜下观察到疟原虫形态。
常用的血涂片有两种：
一种是借推片将血液薄薄地涂在载玻片上，使每个红细胞平铺在玻片上，称薄血膜，因薄血膜血液干燥快，原虫形态极少变形，多用于以观察疟原虫形态与鉴别虫种；
另一种是把较多的血液涂成圆形，血膜中血细胞重叠，原虫较为集中，称为厚血膜。
厚血膜涂布面积小，阳性检出率高，厚血膜的镜检效率比薄血膜约高六倍。
现常用的一张载玻片上同时做厚薄血膜各一，厚血膜用来检查，薄血膜供编号和鉴别虫种用。
薄血膜涂制均匀时疟原虫着色良好，结构清晰，便于观察形态和鉴别虫种。
薄血膜上各种红内期疟原虫的形态，见表2-1和图2-1
核
被寄生的红细胞
胞浆
空泡
薛氏小点
表2-1四种疟原虫薄血膜形态鉴别（吉氏染色）
被寄生红细胞
大小形状
胀大
正常
正常或缩小
正常或稍胀大，卵圆形或边缘呈伞矢状
颜色
褪色
正常或稍紫
斑点
薛氏点出现稍晚，红色，细小数多
茂氏点红色，粗大数少
齐氏点淡红色，微细
薛氏点出现较早粗大，数多
小滋养体
大小
较大，约占红细胞直径的1/3
小环状体较小，约占红细胞直径1/6,大环状体与间日疟原虫相似
中等
1个
1或2个
较薄
小环状体纤细，大环状体与间日疟原虫相似
较粗厚
色素
偶见细小褐色颗粒
大滋养体
较大
较小
多见1个
阿米巴样，常含空泡
圆形，空泡不显著
带状，空泡不显著
黄褐色，细小，杆状，散在分布
黄褐色，细小，结成
团块后，呈黑褐色
深褐色，粗大，沿边缘分布
棕黄色，较粗大
未成熟裂殖体
2个以上
圆形或不规则，空泡消失
圆形，空泡消失
圆形或卵圆形，空泡消失
黄褐色，分布不匀
黑褐色团块状
深褐色，分布不匀
棕黄色，分布不匀
成熟裂殖体
大于正常红细胞
小于正常红细胞
裂殖子
12～24个，常为16～18个，排列不规则，较大
8～26个，常为8～18个，排列不规则，较小
6～12个，常为8个，常排列如菊花状，较大
6～14个，常为8个，排列不规则，较大
黄褐色，常聚集一侧
黑褐色团块
深褐色，常聚集中央
棕黄色，聚集中央或一侧
雌
大于正常红细胞，圆形
较大，新月形，两端尖锐
小于正常红细胞，园形
小于正常红细胞，圆形
1个，较小，深红色，
位于一侧
位于中央
1个，较小，深红色，位于一侧
深蓝色
黄褐色，均匀散在
黑褐色，紧密分布于核周围
深褐色，均匀散在
棕黄色，散在
雄
形状
大于正常红细胞，园形
较大，腊肠形，两端钝园
1个，较大，淡红色，位于中央
浅蓝色
浅蓝色或淡红色
黑褐色，松散分布于
核周围
厚血膜由于用血量多，细胞重叠，干燥缓慢，以致虫体皱缩，空泡消失，胞质变形，加之红细胞溶解，所以虫种和虫体的鉴别比薄血膜困难。
厚血膜中4种疟原虫形态鉴别要点，见表2-2
表2-2四种疟原虫厚血膜形态鉴别（吉氏染色）
较大。
核1个，较大，胞浆较厚。
常呈"
！
"
或"
，"
状
较小。
核1～2个，较小，胞浆纤细。
、"
飞鸟"
Ｖ"
和"
断环"
中等。
核1个，较大，胞浆粗厚。
常呈"
环状"
鸟眼"
大小与间日疟原虫相似，胞浆致密，核较大。
呈阿米巴样，形状不规则。
核位于胞浆之中或外边，胞浆常缩成圆形或断裂成数块。
色素分布不匀
常呈圆形，色素细小或结成1～2个团块
常呈圆形，色素粗大
大小与间日疟原虫相似，胞浆呈深蓝色，核较大
裂殖体
裂殖子12～24个。
裂殖子较大
裂殖子8～26个。
裂殖子较小
6～12个。
裂殖子大于间日疟原虫裂殖体
大小与间日疟原虫相似，裂殖子6～14个，核较大
圆形，色素粗大。
雌配子体较大，核小，胞浆深蓝色，雄配子体较小，核大，胞浆浅蓝色
雌配子体新月形，雄配子体腊肠形
与间日疟原虫相似，但较小。
色素较粗大
卵圆形，大小与间日疟原虫相似，雌配子体核致密，偏于一侧，雄配子体核疏松
黄褐色，细小。
杆状，或结成粗大颗粒。
分布不匀
黄褐色，颗粒细小，结成团块后，呈黑褐色。
配子体色素粗大，分布于核周围
有时小滋养体可见色素，深褐色，较粗大。
沿边分布
色素颗粒较大，呈深棕色，分布弥散
被寄生
红细胞
常见红细胞“影子”和薛氏点
可见红细胞“影子”和茂氏点
可见红细胞“影子”
小滋养体时即可见薛氏点
其他
常可查到各阶段的疟原虫
仅见小滋养体（或）和配子体。
一般不见大滋养体和裂殖体
常可查到各阶段疟原虫
图2-1间日疟原虫形态
图2-2恶性疟原虫形态
图2-3三日疟原虫形态
图2-4卵形疟原虫形态
发热病人血涂片的显微镜检查（简称发热病人血检）是疟疾控制和检测的重要手段，因此掌握显微镜的使用方法和日常维护是十分必要的。
显微镜通常有4个部分组成：
A.支撑系统；
B.放大系统；
C.照明系统；
D.调节系统；
见图3-1。
图3-1显微镜的构造
（Ａ）支撑系统：
1，镜座；
2，镜臂；
3，镜头座；
4，载物台；
5，持片夹（图3-2）。
图3-2显微镜支撑系统
（Ｂ）放大系统：
1、目镜：
放大尺寸为10倍（图3-3）；
图3-3显微镜目镜
2、物镜：
放大倍数分别为10倍、40倍、100倍，在使用100倍时需要使用镜油（图3-4）。
图3-4显微镜物镜
（C）照明系统：
1，反光镜；
2，聚光器；
3，光圈；
固定在聚光器内，它可以调节通过聚光器的光线的强弱（彩图3-5）。
图3-5显微镜照明系统
D）调节系统：
1，粗对焦螺旋；
2，细对焦螺旋：
缓慢移动观察物用以精确调节；
3，光圈调节杠杆；
4，持片夹：
控制玻片向前向后向左向右移动。
（一）使用环境与工作习惯
显微镜的工作场所应当清洁、干燥、无震动、无腐蚀性气体存在。
台面和凳子的高度要适当。
镜检时，即便用单目显微镜，也须两眼同时睁开。
（二）聚光器及可变光阑的用法
一般的聚光镜，在平行光照射的情况下，其焦点落在它上端透镜平面中心上方约1.25mm处。
当使用高倍或油镜时，由于放大率大，镜像亮度小，需要较强的照明。
因此，应把聚光器升至最高，以便使聚光镜的焦点正好落在标本平面上。
但在使用低倍镜时，可将聚光器适当下降。
可变光阑一是控制射向标本的光通量；
二是改变聚光器的数值孔径。
在这两个作用中，后者是主要的。
为了使物镜的分辨率得到充分的利用，从原则上说，聚光器的数值孔径应与物镜的相同。
否则，分辨率或清晰度就要下降。
（三）物镜的正确调焦
对光完成后，升高镜筒，将标本玻片夹在移动器上，并将欲检查的部分移至载物台通光孔的中央，然后开始调焦。
无论作何种检查，均应从低倍镜开始。
调焦时，先用粗动手轮将镜筒下降，使低倍镜的前透镜与盖玻片之间的距离略缩小于该物镜的工作距离（5mm以下）。
为了避免物镜压在载玻片上，可从侧面窥视。
然后，一边从目镜中观察视野，一边利用粗动手轮将镜筒徐徐上升，待初见物像后，改用微动手轮作精细调焦，直至物像最清晰为止。
低倍物镜的视场大，有利于观察标本的全貌。
从低倍镜转换为高倍镜时，如果物镜是显微镜的原配物镜，所用的载玻片、盖玻片有符合标准，一般都可以进行"
等高转换"
。
即转换后，只要稍微调节一下微调旋钮，即可看到清晰的图像。
但油镜不强求齐焦，最好先将镜筒升高后再转换，最后按低倍镜的调焦方法重新调焦。
用油镜观察时，要先将物镜移开，在要观察的部位加一滴香柏油，然后将油镜放正，并慢慢转动粗调节器，降下镜筒，使镜头浸入油滴中。
可下降至几乎与制片接触，但切不可压及玻片。
然后，向上微微转动粗调节器，使镜筒上升，当视野中出现有模糊的影像时，改用细调节器向上转到直至影像清晰为止。
在使用油镜时，在聚光镜与标本之间滴加浸油，可提高物镜的分辨率。
在整个调焦过程中（尤其是高倍物镜和油镜的调焦），每个动作都要缓慢进行。
否则，物像会一闪而过，找不到观察目标。
油镜使用完毕后，要及时将浸油擦拭干净。
镜头上可先用干净的擦镜纸擦干净即行。
聚光镜的擦拭方法与此相同。
（一）取出显微镜时，要用右手握住执手，左手托住镜座，小心地放到桌面上，不可单手拎着移动。
（二）任何旋钮转动有困难时，绝不能用力过大，而应查明原因，排除障碍。
如果自己不能解决时，要向专业人员请求解决。
所有的镜头均经校验，请勿自行拆开。
（三）保持显微镜的清洁，尽量避免灰尘落到镜头上，否则容易磨损镜头。
同时要尽量避免试剂或溶液滴到显微镜上，特别是用高倍物镜观察时，镜头很容易被染料或试剂玷污，一旦被玷污，应立即用擦镜纸擦拭干净，油镜头还应使用清洁剂擦拭。
由于光学玻璃比一般玻璃的硬度小，易于损伤。
因此擦拭光学透镜只能用专用的擦镜纸，不能用棉花、棉布或其它物品擦拭。
擦时要先将擦镜纸折叠为几折，从一个方向轻轻擦拭镜头，每擦一次，擦镜纸就要折叠一次，以免沾在擦镜纸上的灰尘损伤透镜，使镜面出现一条条的划痕。
（四）每次使用结束时，并光源调节器调至最小后关闭，并将物镜转成“八”字形垂于镜筒下，然后降下镜筒，避免物镜镜头下落时与聚光器相碰撞。
显微镜应存放于阴凉干燥的地方，若放在潮湿处，一旦镜片上着生霉菌，就会腐蚀镜片，且很难除去。
（一）防高热：
显微镜是由精密的机械和光学镜头组成的，由于各种材料热膨胀系数不同，所以显微镜不能在阳光了曝晒，也不能放在靠近火炉和暖气的地方。
只能室内存放，其工作的温度范围一般为5～40℃。
（二）防潮：
如果长期受潮，透镜很容易发霉，表面还会腐蚀，所以应在干燥环境下保存。
在31℃时湿度不得大于80％，温度每升高3摄氏度，相对湿度要设法降低10％。
（三）防尘
：
灰尘不仅会影响成像质量，而且灰尘中往往也带有含酸、碱等腐蚀性的尘粒，容易腐蚀镜面。
而硬度大的尘粒还可能在擦拭镜头时在镜面上划出伤痕，损坏镜头。
此外，灰尘掉进机械活动部分时容易造成机械部分转动不灵活，甚至损坏。
（四）防腐蚀
：
显微镜不能接触酸类和碱类物质。
也不要与挥发性很强的化学药品及其它有害药品放在一起，以免腐蚀镜头。
（五）防震
显微镜是精密仪器，剧烈的震动会造成精密度的降低。
要轻拿轻放，搁置要平稳，使用时动作应轻柔。
（六）擦拭：
.机械装置的擦拭:
机械装置如有污渍，可用干净的柔软细布擦拭；
如果擦不掉，可用擦镜纸或细绸布蘸点二甲苯擦拭。
应注意不能用酒精、乙醚等化学品，以免腐蚀装置表面的油漆。
光学镜头的擦拭：
一般采用先吹，后刷，再擦拭的方法。
吹，就是用吹气球（或用洗耳球）吹掉镜头表面的附着物。
但不能用口直接吹气。
吹不掉时，可用干净的专用清洁毛刷轻轻地刷。
经上述两种方法处理后镜头表面仍有污物时，用擦镜纸稍蘸一点二甲苯或是专用清洁剂轻轻擦拭。
如果发现镜头发霉长雾时，可用擦镜纸蘸少许无水酒精和乙醚的混合液擦拭，但液体不能太多，停留时间要短，以免渗入镜头内部造成腐蚀。
油镜头每次用过后要及时擦拭，先用干擦镜纸擦一两次，把大部分介质油去掉，再用二甲苯滴湿擦镜纸擦两次，最后再用干擦镜纸擦一次。
（一）所需器材
1、载玻片：
玻片使用前应清洗。
新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中10~20分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。
用于特殊的目的时，最后可将玻片浸泡在95％酒精中5~10分钟，再将玻片擦干擦亮。
已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中1~2小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中1~2小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。
洗净的玻片每10~20张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。
2、采血针：
使用一次性釆血针。
3、玻片盒：
为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥。
4、75％酒精棉球：
用于采血前后的消毒。
5、记号笔或铅笔：
用于玻片上书写号码。
（二）采血部位及取血方法
采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。
先用75％酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。
（三）涂制血膜
取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。
用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部刮取血液1~1.5μl。
将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10个白细胞为宜）。
用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°
～35°
角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。
每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。
标准血膜的位置如图4-1所示。
取干净玻片及推片各一张，用右手大拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4～5μl（约火柴头大小），再用该端中部刮取血液1～1.5μl。
将左下角的血滴涂于载片的中央偏右，由里向外划圈涂成直径为0.8～1cm的圆形厚血膜（厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜）。
用干棉球抹净角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°
角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。
薄血膜厚血膜标记处
图4-1
（四）血膜的保存
血膜制成后，立即将受检者号码写在玻片上，血膜朝下插入直竖的标本盒内，让血膜自然干燥后才能染色。
吉氏染色时薄血膜在染色前须经甲醇固定，而厚血膜在染色前必须溶血，但新制作的厚血膜也可直接染色。
血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。
不能及时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。
临用时，将干燥器放置室温中1~2小时后取出血片。
（一）染色液的制备
目前常用的血膜染剂有吉氏和瑞氏两种。
吉氏染剂不仅适用于厚血膜和批量血膜的染色，而且效果稳定，染色时间和染液浓度对染色结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长，同时吉氏染剂能长期保存而不变质，染色技术也易掌握，被推荐使用。
吉氏粉5g，甲醇250ml，甘油250ml。
将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。
在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗净研钵为止。
塞紧瓶塞，充分摇匀，室温内放置，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。
另一种方法是在带有紧口瓶塞的硬质玻璃瓶中放入约50个玻璃珠（直径3~5mm）。
用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇缓慢地把所有染料粉冲入瓶内，将瓶塞塞紧，置于室温内，每天用力摇动5分钟，3天后即可使用，保存时间长则更好。
（二）染色用水
常用的染液的稀释用水和染色的冲洗用水，是中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水，也可用井水、河水、泉水或雨水。
为了使血膜着色较好，应用pH7.0～7.2水效果最佳。
为此，可配制缓冲液用于染液的稀释和染色后的冲洗。
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