引物设计条黄金法则 十Word格式文档下载.docx

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PCR引物设计的11条黄金法则

2008-08-1908:

12:

52|分类：

分子生物学知识|举报|字号订阅

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6.碱基要随机分

布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。

降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。

引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。

否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。

△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。

应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。

引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）

9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：

加酶切位点；

标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；

引入蛋白质结合DNA序列；

引入点突变、插入突变、缺失突变序列；

引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。

3′端也不能有形成任何二级结构可能。

10.扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G°

）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11.引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。

如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。

有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高

或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；

用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。

在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。

引物设计的要求：

1）避免重复碱基，尤其是G.

2）Tm=58-60度。

3）GC=30-80%.

4）3&

#39;

端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

6）PCR扩增产物长度：

引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；

80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。

7）引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。

对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。

关于引物设计的体会

11:

39|分类：

第一贴

记得当时搞引物设计的时候，还是我的大师兄领入门的，在此谢过了。

师兄教了一些基本原则后，就放羊了。

接着自己捣鼓来捣鼓去，在导师的实验室内设计了十几条引物，用起来还蛮好的，逐渐赚了点名气。

后来，就和上海鼎安合作了，帮别人设计引物在他们公司订购引物，拿点回扣。

别人拿给我设计的引物，都是很头痛。

因为客户往往都是自己捣鼓一下，不行了才到我这。

到现在已经成功设计了四五十对引物了。

不过至今money颗粒无收，就不了了之，主要是客户拖欠的问题，不过不后悔，毕竟是不错的经历啊。

所以，也算是有点个人观点，和大家分享，不对的地方请指正。

我用Primer5.0搜索引物、Oligo6.0评估引物，这是根据各自所长定的。

但有个朋友，他就只用Oligo，说设计的引物也还可以。

Primer5.0搜索引物：

1.PrimerLength我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必

要。

当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。

2.PCRProductsize最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。

至于上限倒也不必要求苛刻。

3.Searchparameters还是选Manual吧，Searchstringency应选High，GC含量一般是40－60％。

其它参数默认就可以了。

4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。

当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。

对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。

Oligo6.0评估引物：

1.在analyze里,DuplexFormation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，Themoststable3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol,ThemoststableDimeroverall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°

的时候，ThemoststableDimeroverall6.7kcal/mol没有问题。

2.HairpinFormation根据黄金法则

3.Falseprimingsites:

Primer的primingefficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。

4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimalannealingtemperature数值值得参考。

在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。

5.Internalstability很重要：

我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。

下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。

△G参照黄金法则，这其实很好理解：

把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。

最后说一句，敢于尝试就会成功。

第二贴

－－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。

就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。

－－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。

这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。

－－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°

的退火温度肯定和65°

对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。

－－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。

有T是不是一定不行，个人感觉不见得。

软件是评估，法

则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。

－－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。

我设计的时候，尽量两个都不得罪。

－－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。

所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。

谈一下我学这个引物设计的过程吧：

入门－－前面我说过是我的大师兄把我领进门的，之后我就自己捣鼓。

一开始严格按照引物设计的黄金法则来，primer搜出来的引物oligo评估，我就这样一条引物一条引物地反复评估，不厌其烦，到处查阅资料，一做就是几个小时，幸运的是捣鼓出来一两条符合标准的引物。

提高－－有了成功的经验后，就继续做，当时我们实验室要定很多引物，我就有了练手的素材，这也很重要－－什么东西不是练出来？

！

设计多了，问题也多了。

有些引物按黄金法则来，行不通了，怎么办？

1、我就把引物3端或5端延长或缩短一个或几个碱基，再反复评估

2、有些引物还不行，我就把5端突变一个碱基，再反复评估

3、再不行，我就放宽条件。

放宽到什么样可以，不好说，自己摸索。

有的一对引物，其中一条错配很厉害，而另一条很可以，在没有其它选择的情况下为什么不可以。

有的人担心，这不一定跑的出来啊。

对自己要有信心啊，原因有二：

1.自己的引物谁有功夫帮你设计？

所以啊，当时我就被“赶鸭子上架了”，反反复复搜索评估的基础上，出来的应该是目前最好的；

2、还有，我经常看国外文章的引物，有的评估起来表面上差的要命，人家照用，结果还不是出来了。

我就分析这样的引物，得出经验，胆子也大了。

当然失败肯定是有一两次的。

当然，有人说我就设计那么一条引物，输不起。

那只好说Sorry了!

总之，我的经验就是：

立即上手，遇到问题再解决问题，不厌其烦，不就是个软件嘛,还征服不了？

第三贴

个人觉得引物很有必要在NCBI上BLAST一下，看看非特异性引发如何！

楼主说得很对，设计引物的最后一步就是验证引物的特异性，我有一贴就是说引物验证的，在此不赘述，见下：

鉴于BLAST界面已改变，本人更新了依医战友的“图解BLAST引物验证教程”

注：

个人感觉一对引物设计出来，即使不做blast,非特异性引发的可能性也不是很大，当然这一步在设计引物里是不可省略的。

怎样增加blast检测中非特异性引发的可能性，我想也许可以增加expect值（见教程参数设置），给它设置成2000、3000、5000.....。

老版本，原来有个short片断blast的，可以用来验证引物，里面Ex

pect（期望值）默认是1000，我试过5000，没有看出有什么可观的改变，所以1000够了。

我猜想，Expect值增大，&

quot;

非特异性引发的可能性&

能够更好地被检测出,感兴趣的战友可以试试。

申明：

个人意见，或对或错，有兴趣的战友可以自己测试一下