植物化学大实验Word文档下载推荐.docx

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利用这个性质，我们可以用有机溶剂把黄酮化合物提取出来。

黄酮是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的自由基，如花青素可以抑制油脂性过氧化物的溢出，其抗氧化能力是维生素E的十倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生

葛根素的提取：

（1）葛根简介：

葛根为为豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根。

葛根含异黄酮成分葛根素、葛根素木糖甙、大豆黄酮、大豆黄酮甙及β-谷甾醇、花生酸，又含多量淀粉（新鲜葛根中含量为19～20%），是中国南方一些省区的一种常食蔬菜，其味凉可口，常作煲汤之用。

（2）形态特征：

多年生藤本，长达10米，全株被黄褐色粗毛。

块根肥厚。

叶互生；

具长柄；

3出复叶，顶端小叶的柄较长，叶片菱状圆形，有时有3波状浅裂，长8～19厘米，宽6.5～18厘米，先端急尖，基部圆形，两面均被白色伏生短柔毛，下面较密；

侧生小叶较小，偏椭圆形或偏菱状椭圆形，有时有2～3波状浅裂。

总状花序腋生，总花梗密被黄白色绒毛；

花密生；

苞片狭线形，早落，小苞片线状披针形；

蝶形花蓝紫色或紫色，长15～19厘米；

花萼5齿裂，萼齿披针形；

旗瓣近圆形或卵圆形，先端微凹，基部有两短耳，翼瓣狭椭圆形，较旗瓣短，通常仅一边的基部有耳，龙骨瓣较翼瓣稍长；

雄蕊10，两体（9+1）；

子房线形，花柱弯曲。

荚果线形，扁平，长6～9厘米，宽7～10毫米，密被黄褐色的长硬毛。

种子卵圆形而扁，赤褐色，有光泽。

花期4～8月。

果期8～10月。

（3）葛根功效：

葛根，味甘、辛，性平，归脾、胃、肺、膀胱经。

解肌退热；

发表透诊；

生津止渴；

升阳止泻。

主外感发热；

头项强痛；

麻疹初起；

疹出不畅；

温病口渴；

消渴病；

泄泻；

痢疾；

高血压;

冠心病,胃寒者慎食。

葛根素：

分子式：

C21H20O9 

葛根素亦称葛根黄素。

是从中药葛根中分离的具有扩冠作用的异黄酮类衍生物

葛根素存在于豆科植物野葛的根中。

为无色结晶；

熔点203～205℃；

在水和有机溶剂中溶解度都不大，加热可溶于水、甲醇、乙醇，但不溶于乙醇乙酯、氯仿、苯；

不被酶解，也不易被稀酸水解，只有用缓和的氧化反应

葛根素的生理活性：

◆含有皂苷类化合物，对肝组织免疫损害具有保护作用。

◆可有效逆转化学诱导的肝纤维化。

◆增强心肌收缩力，保护心肌细胞作用。

◆能扩张血管、降低血压、改善微循环。

◆保护红细胞的变形能力，增强造血系统功能。

◆具有抗血小板聚集，增加纤溶活性，降低血粘度作用。

◆对肾炎、肾病肾衰模型均有保护作用。

◆对非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫有明显的调节作用。

◆可促进正常人和肿瘤病人的淋巴细胞转化率，增强自然素作用。

◆对干扰系统有明显的刺激和诱生作用。

槐米中黄酮类化合物的提取纯化及氧化性能测定

一、实验目的

（1）掌握槐米中黄酮类化合物的提取方法

（2）熟悉掌握旋转蒸发仪的使用方法

（3）熟悉黄酮类化合物的分离纯化方法

（4）熟悉黄酮类化合物的测定方法

（5）学会AB-8型大孔树脂对提取物的纯化的工艺条件

二、实验原理

1.黄酮化合物的提取

（1）相似相溶：

“相似”是指溶质与溶剂在结构上相似；

“相溶”是指溶质与溶剂彼此互溶。

1．极性溶剂（如水）易溶解极性物质（离子晶体、分子晶体中的极性物质如强酸等）；

（2）非极性溶剂（如苯、汽油、四氯化碳等）能溶解非极性物质（大多数有机物、Br2、I2等）

（3）含有相同官能团的物质互溶，如水中含羟基（—OH）能溶解含有羟基的醇、酚、羧酸。

黄酮类化合物为极性物质，所以本实验用工业酒精作为溶剂。

2.硝酸铝比色法测定黄酮含量

其测定黄酮类化合物的基本原理是：

在碱性条件下，利用硝酸铝与黄酮形成红色螯合物为特征颜色反应，以芦丁为标准对照品，测定其最大吸收峰时的吸光度，在通过计算求出待测液的黄酮含量。

3.大孔树脂的分离纯化

大孔吸附树脂属于功能高分子材料，由聚合单体和交联剂、分散剂、致孔剂等添加剂经聚合反应制备而成。

他的内部有大大小小、形状各异、互相贯通的孔穴。

在干燥条件下，其内部孔隙率较高的，孔径较大，一般在100-1000nm之间。

大孔树脂的表面积较大、理化性质稳定、选择性好、交换速度较快、机械强度高、使用周期长、抗污染能力强、热稳定性好等诸多优点。

它不溶于酸、碱及各种有机溶剂，不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响，在水溶液和非水溶液中都能使用，主要通过表面吸附、表面电性或形成氢键等能从水溶液中有选择性地吸附有机物质。

大孔吸附树脂是吸附性和筛选性原理的分离材料，它能针对性的富集、分离不同母核结构的药物。

4.黄酮提取物还原能力的测定原理

黄酮类化合物可络合诱导氧化的过渡金属离子如Fe3+、Cu2+等。

Fe3+离子可催化使O2生产危害性更大的·

OH。

所以抗氧化剂与金属离子的反应在清除自由基等抗氧化过程具有重要的作用。

此实验是还原铁的一个体系，具有较强还原力的物质能把Fe3+还原成Fe2+，溶液的颜色由黄色变成绿色。

故可以通过显色反应来判断还原的程度，反应后绿色越深，吸光度越大，说明该物质的还原能力越强。

5.黄酮提取物清除·

OH自由基的实验原理

由于羟自由基性质非常活泼，存在时间很短，除了电子自旋共振法（ESR）外，一般难于直接测定，故常用间接法测定。

本实验利用Fenton体系产生羟自由基，它对a-脱氧核糖分子有氧化破坏作用，通过对比加入不同浓度异黄酮溶液后脱氧核糖被保护情况，确定黄酮是否对·

OH具有清除能力。

三、试剂、仪器和材料

1.试剂：

工业酒精,无水乙醇、芦丁标准溶液、水杨酸、BHT、Vc、过氧化氢、硫酸亚铁、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝。

2.仪器：

烧杯、比色管50ml，比色管架、移液管1ml,2ml,5ml,10ml、层析柱、玻璃棒、容量瓶50ml、量筒50ml、抽滤瓶、布氏漏斗、旋转蒸发仪、722N型吸光光度仪

3.材料：

槐米、大孔树脂

四、实验步骤

1.实验流程

称取槐米200g

加入600ml乙醇超声提取30m

滤渣加入600ml乙醇继续超声提取30min

过滤，重复上操作

合并滤液

浓缩至50ml左右

加入95%乙醇后放入冰箱保存

过夜

过滤除去糖分

旋转浓缩至20ml左右

转移至50ml容量瓶用70%乙醇定容

测量吸光值

过滤除去杂质

洗脱

先用700ml蒸馏水洗，再用400ml乙醇洗

乙醇洗脱液

浓缩至20ml左右，转移，定容至50ml

芦丁标准曲线的制作

测定纯黄酮的含量

分别测三组硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸混合溶液的A0值

每组分四等份

每组分别依次加入不同浓度的黄酮、BHT、Vc乙醇溶液

测每等份的A值

算清除率

2.树脂的处理

大孔吸附树脂中有致空剂、聚合单体、分散剂等杂质，使用前必须先进行处理，具体操作如下：

用100ml的烧杯量取100ml的树脂，加入250ml的95%乙醇侵洗，23h后加入适量的蒸馏水，反复洗至无白色浑浊，然后加250ml5%的NaOH溶液浸泡6h，接着用蒸馏水洗至中性，然后用250ml的5%HCl浸泡6h，蒸馏水洗至中性备用。

3.样品的处理

将提取液从冰箱中取出来，立即过滤，滤液利用旋转蒸发仪旋蒸至20ml左右，转入50ml容量瓶中，再加70%乙醇并定容，贴上标签备用。

4.芦丁标准曲线制作：

吸取10ml芦丁标准品定容到50ml容量瓶中为标液，分别取芦丁标准溶液0.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml转入6只比色管中，用70%乙醇补充至12.5ml，加入0.7mlNaNO2（5%）,摇匀，静置5min后，加入0.7mlAl（NO3）3（10%）,静置5min后，加入5ml1mol/L的NaOH溶液，摇匀，最后以70%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置10min后于波长510nm处测定吸光度A值。

以芦丁浓度C（g/L）为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。

取不同体积的样品溶液，配置溶液，并测定吸光度A值，取待测液的吸光度A值在线性范围内的溶液体积，再平行测定3组试验。

5.分离纯化

将处理好的树脂采用湿法上柱到层析柱中

具体操作如下：

（1）

塞棉花。

取一小块棉花铺平，弄成和层析柱直径一样的圆形，放入层析柱的底部，用一小根较长的玻璃棒压着棉花，关闭层析柱活塞，加一点洗脱液浸润棉花，赶走棉花中的空气。

（2）敲柱子。

用橡皮管敲击柱子，赶走层析柱树脂中的气泡，然后打开活塞，流出洗脱液，让树脂自然沉降，等到柱子快干时关闭活塞，就可以加样了。

通常如果拌树脂时加的洗脱液较多，是不会有气泡的。

（3）上样

（4）用蒸馏水冲洗柱子（除糖和杂质）（蒸馏水用量700ml左右）。

（5）用75%乙醇洗脱（共400ml左右）。

（6）洗脱液浓缩至20-30ml左右。

（7）定容至50ml。

（8）测定纯化后黄酮含量。

A.标准曲线的制作：

B.取不同体积的样品溶液，配置溶液，并测定吸光度A值，取待测液的吸光度A值在线性范围内的溶液体积，再平行测定3组试验。

6.黄酮提取物清楚·

OH自由基的能力分析测定

（1）.配制浓度为60，100，120，140mg／L的黄酮乙醇溶液，每个浓度配制25ml.根据分离纯化后的黄酮含量计算。

（2）.配制浓度为60，100，120，140mg／L的BHT乙醇溶液，每个浓度配制25ml.

（3）.配制浓度为60，100，120，140mg／L的Vc乙醇溶液，每个浓度配制25ml.

（4）.在烧杯中依次移入25mL2mmol／L硫酸亚铁溶液和25mL6mmol／L过氧化氢溶液，混合均匀后加入75mL6mmol／L水杨酸溶液。

在36～37℃的恒温水浴中反应20min后于510nm处测定其吸光度值，此值记为Ao，参比溶液为70%乙醇溶液。

将Ao值的测定体系分成4等份，放人50mL比色管中，每份25．0mL，1号管加人3．0mL60mg／L的黄酮乙醇溶液，2号管加人3．0mL100mg／L的黄酮乙醇溶液，3号管加人3．0mL120mg／L的黄酮乙醇溶液，4号管加人3．0mL140mg／L的黄酮乙醇溶液.36～37℃的恒温水浴中反应15min后于510nm处测定其吸光度值，此值记为A1每组做2个重复实验

（5）.在烧杯中依次移入25mL2mmol／L硫酸亚铁溶液和25mL6mmol／L过氧化氢溶液，混合均匀后加入75mL6mmol／L水杨酸溶液。

将Ao值的测定体系分成4等份，放人50mL比色管中，每份25．0mL，1号管加人3．0mL60mg／L的的Vc溶液，2号管加人3．0mL100mg／L的Vc溶液，3号管加人3．0mL120mg／L的Vc溶液，4号管加人3．0mL140mg／L的Vc溶液.36～37℃的恒温水浴中反应15min后于510nm处测定其吸光度值，此值记为A1每组做2个重复实验.

（6）.在烧杯中依次移入25mL2mmol／L硫酸亚铁溶液和25mL6mmol／L过氧化氢溶液，混合均匀后加入75mL6mmol／L水杨酸溶液。

在36～37℃的恒温水浴中反应20min后于510nm处测定其吸光度值，此值记为Ao，参比溶液为70%乙醇溶液。

将Ao值的测定体系分成4等份，放人50mL比色管中，每份25．0mL.号管加人3．0mL60mg／L的BHT乙醇，2号管加人3．0mL100mg／L的BHT乙醇，3号管加人3．0mL120mg／L的BHT乙醇，4号管加人3．0mL140mg／L的BHT乙醇.每组做2个重复实验.36～37℃的恒温水浴中反应15min后于510nm处测定其吸光度值，此值记为A1，以上每组做2个重复实验。

清除率=（Ao—A1）／Ao×

100％

五、结果与讨论

1.粗黄酮含量

芦丁浓度（g/l）

0.007334

0.014669

0.022003

0.029338

0.036672

吸光度A

0.0595

0.1325

0.208

0.2695

0.3495

将粗黄酮稀释100倍，再取0.5ml于50ml比色管中稀释，测得吸光度A=0.107

代入方程y=9.3557x,x=0.011437

则粗黄酮浓度c=0.011437x10000=114.37mg/ml

2.分离纯化后的黄酮含量

0.0073344

0.069

0.149

0.224

0.294

0.375

芦丁标准曲线

将样品溶液量取0.1ml放入50ml比色管，测定吸光度A=0.313.则黄酮浓度c=15.4mg/ml

3.黄酮提取物清除·

浓度mg/L

60

100

120

140

清除率（黄酮）

19.2%

15.6%

20.3%

15%

清除率（Vc）

36.6%

40.4%

46.8%

44.7%

清除率（BHT）

18.0%

16.9%

15.8%

由数据可知Vc的清除率大于黄酮和BHT,黄酮和BHT的清除率相接近。

但三组数据都没呈线性变化，这可能与实验的操作误差，溶液在配制过程中的用量、反应时间、温度有关。

分析与讨论

装柱时由于棉花没有润湿，所以底端出现气泡，影响洗脱速度。

做清除·

OH自由基能力分析测定时，三组数据都没呈线性变化，只能得出Vc的清除率大于其他两项，这可能与实验的操作误差，溶液在配制过程中的用量、反应时间、温度有关。

另外硫酸亚铁溶液、过氧化氢、水杨酸混合后反应时间可能不够，存在颜色过深的现象，影响吸光度的测定。

葛根素的提取分离与鉴定

一、实验目的

1.掌握植物化学实验的基本流程；

2.掌握异黄酮类化合物的性质以及提取分离与鉴定；

3.掌握大型仪器的使用。

2．实验原理

1.葛根素的提取

葛根素为极性物质，所以本实验用95％乙醇作为溶剂。

（4）回流提取：

应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。

小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。

瓶内装药材为容量的1/3－1/2，溶剂浸过药材表面1－2cm。

在水浴中加热回流，一般保持沸腾约1小时。

放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。

此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。

在碱性条件下，利用硝酸铝与黄酮形成红色螯合物为特征颜色反应，以芦丁为标准对照品，测定其最大吸收峰时的吸光度，在通过计算求出待测液的黄酮含量

3.结晶及重结晶：

结晶是溶质从溶液中析出的过程，可分为晶核生成（成核）和晶体生长两个阶段，两个阶段的推动力都是溶液的过饱和度（结晶溶液中溶质的浓度超过其饱和溶解度之值）。

重结晶是利用固体混合物中目标组分在某种溶剂中的溶解度随温度变化有明显差异，在较高温度下溶解度大，降低温度时溶解度小，从而能实现分离提纯。

4.薄层层析：

薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板（常用玻璃板，也可用涤纶布等）上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。

薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析（吸附剂）薄层分配层析（纤维素）、薄层离子交换层析（离子交换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。

一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。

5.吸附是表面的一个重要性质。

任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。

在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。

物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子（离子或原子）和固体内部分子所受的吸引力不相等。

在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。

而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而，气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。

吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。

在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。

吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。

三、试剂、仪器、材料

95%乙醇、过氧乙酸、甲醇、氯仿、FeCl3-K3Fe（CN）6显色剂

烧杯、漏斗、玻璃棒、量筒、铁锅、胶头滴管、电炉、铁架台、布氏漏斗、抽滤瓶、冷凝管、离心机、离心管、层析板、层析杠、旋转蒸发仪、荧光检测仪、薄层扫描仪、722N型吸光光度仪

葛根粉

1.流程图

葛根粉200g

加热回流1.5h（800ml乙醇）

过滤

滤液残渣（400ml乙醇加热回1.5小时）

滤液

合并滤液

抽滤

浓缩至200-300ml

冷藏

除糖

滤液

减压浓缩

加入等体积过氧乙酸（冰浴结晶

）离心10min

葛根素粗品

用甲醇溶解

点样、跑板

检测

2.葛根素的提取

在台天平上称取200g葛根粉，加入1000ml烧瓶内，然后向烧瓶内加入800ml95%的乙醇，搅匀后，放入水浴锅中，连接好回流装置，加热回流1.5h。

拆下装置，将烧瓶里面的液体通过纱布过滤在500ml烧杯中，再将滤渣放入烧瓶中，加入400ml95%乙醇，搅匀后，放入水浴锅中，连接好回流装置，继续加热回流1.5h。

同上过滤，将两次滤液混合，用布氏漏斗抽滤，然后将抽滤液倒入干净的1000ml烧瓶中，用旋转蒸发仪减压浓缩至体积大约为200~300ml。

将浓缩液倒入烧杯中，贴上标签，放入冰箱中过夜。

3.粗提取物中黄酮含量的测定

芦丁标准曲线的制作：

4.葛根素的分离纯化

将过夜的溶液，用漏斗过滤，除去烧杯底部的糖分，然后将滤液倒入干净的烧瓶中，减压浓缩至体积小于50ml，转入50ml容量瓶中，加70%乙醇并定容。

剩余葛根素溶液倒入干净的烧杯中，将烧杯放入冰浴锅中，然后向烧杯中缓慢加入等体积的50ml过氧乙酸（甲液：

乙液=1:

1），等待晶体析出。

有晶体析出后，用离心机在3000r下离心10min，取下沉淀放入干净的小烧杯中，用甲醇溶解，得样品液。

取少量标准品于小烧杯中，用甲醇溶解，得标准液。

5.葛根素的鉴定

在层析缸内加入10ml氯仿、2ml甲醇混合30min后配制成展开剂，取两片硅胶板（5cm*10cm），在距离硅胶板一头的1cm处画起始线，以等间距为1cm点出4个均匀的点，从左往右依次点上标准液、样品液、样品液、样品液。

放入层析缸内让样品展开直到展开剂高度超过硅胶板的2/3时停止展开，取出硅胶板，风干。

将硅胶板放入薄层扫描仪内测量样品液与标准液的峰值，以此来判断样品液是否含有葛根素。

再将硅胶板放入荧光检测仪中，观察硅胶板上标准液与样品液的蓝色点是否在同一高度。

最后把硅胶板放入显色剂中染色，风干后比较样品液与标准液的点。

五、结果及分析

1.粗提取物中黄酮含量的测定

芦丁浓度mg/ml

0.0109

0.0218

0.0327

0.0436

0.0545

0.099

0.2

0.326

0.4115

0.555