AFLP技术及其在植物学应用中的研究进展Word格式.docx
《AFLP技术及其在植物学应用中的研究进展Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《AFLP技术及其在植物学应用中的研究进展Word格式.docx（8页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
表2不同部位插条生根情况
扦插部位生根数/条根长/cm生根率/%上（稍中下（基
7.5613.457.62
8.7612.849.58
62.294.168.1
表3不同部位扦插方差分析表
方差来源平方和自由度方差F值F0.05F0.01组间误差总变异
308.7431.34340.08
268
154.375.22
29.56
5.14
10.92
表4不同生根促进剂对生根率的影响促根剂生根日/月生根数/条生根率/%成苗率/%IBAIAAGGR对照
15/717/713/719/7
14.7513.4818.968.84
83.289.196.772.0
10010010095
表5扦插不同处理方差分析表
方差来源平方和自由度方差F值
F0.05
F0.01组间误差总变异
1638.6938.751677.44
31215
546.233.23
169.163.49
5.95
表6温室播种繁殖情况处理方法播种粒数
出苗率%成苗率%裸播
505024222020遮荫网505032343032覆土5050
3836
!
AFLP技术及其在植物学应用中的研究进展
刘峰（黑龙江省科学院自然与生态研究所,黑龙江哈尔滨150040
摘要:
AFLP（扩增片段长度多态性是一种基于PCR的高分辨DNA指纹分析方法,是一种新的DNA分子标记技术。
与其它标记技术相比,它具有相对便宜、简便、快速、可靠的优点。
本文阐述了AFLP的原理、技术关键,及其AFLP目前在植物学方面的研究进展。
关键词:
AFLP技术;
植物学;
分子标记
AFLPTechniqueanditsInvestigativeProgressofBotanicalApplication
LIUFeng（InstituteofNaturalResourcesandEcology,HAS.,Harbin150040,China
Abstract:
Amplifiedfragmentlengthpolymorphism（AFLPispolymerasechainreaction（PCR-basedmarkerwithhigh-resolutionfortherapidscreeningofgeneticdiversity.ItisanewDNAfingerprinttechnology.Comparedwithothermarkers,ithasrelativelyinexpen-sive,simple,fast,andreliableadvantages.Thispaperdescribestheprinciple,keytechnology,anditsInvestigativeProgressofbotanicalaspectsinAFLP。
Keywords:
AFLP;
botany;
moleculartechnology
国土与自然资源研究
·
88·
TERRITORY&
NATURALRESOURCESSTUDY
2011No.3
文章编号:
1003-7853（201103-0088-03
中图分类号:
Q94
文献标识码:
A
AFLP（AmlpifiedFragmentLengthPloymorphsim是由荷兰科学家Zebeau发现,并由Vos发展起来的一种检测DNA多态性的一种方法。
该技术于1993获得欧洲专利局专利（欧洲专利号EP0534858A1,被Keygene公司以专利的形式将其买下,但不久予以解密。
该方法是继RFLP（RestricitionFragmentLengthPloymorphsim、SSR（SimpleSequenceRepeat和RAPD（RandomAmplifiedPolymorphsimDNA之后发展最快的DNA指纹技术,是DNA指纹技术的重大突破,也是目前国际上最新最适用的DNA指纹技术。
1AFLP原理及优越性
AFLP是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术,其基本原理:
先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段,再进行选择性扩增。
使用双链人工接头（Articialadapter与基因组DNA的酶切片段相连接作为扩增反应的模板DNA,用含有选择性碱基的引物（primer对模板DNA基因选择性扩增,获得的DNA扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测,根据扩增片段长度的不同检出多态性。
近年来分子标记技术取得了很大进展,从第一代的RFLP产生到现在已经有十几种分子标技术相继问世,与其他分子标记技术相比,AFLP的优越性主要表现在:
1.1RFLP相比,AFLP是基于PCR的分子标记技术,它只需要少量的模板DNA即可。
1.2ARPD相比,AFLP的引物为16~20个核苷酸组成,而ARDP只有10个引物,其可靠性和重复性更高。
1.3和SSR相比,AFLP不需要预先知道模板DNA的序列,而SSR设计引物时需要构建CDNA文库,并进行大量的测序,成本昂贵。
1.4AFLP是一种半随机扩增,AFLP能产生更多的多态性,比RFLP、SSR、ARPD多10~100倍。
1.5AFLP易于标准化和自动化,适合大批量样品分析。
随着检测技术的不断提高,同位素标记已经不再是AFLP的唯一检测方式,银染技术、荧光标记、地高辛标记相继出现,大大降低了同位素的危害性,同时荧光标记技术也由单纯标记引物转变为标记dNTP。
Bachem等于1996年将AFLP技术应用于mRNA差异分析,发展成为一种mRNA指纹图谱技术,即cDNA-AFLP技术。
2AFLP标记的关键技术
AFLP分析步骤多,流程长,对操作人员的素质要求较高。
现将AFLP标记技术的主要技术关键总结如下4个方面。
2.1模板DNA的质量。
AFLP中模板DNA用量少,但是对DNA的质量要求严格。
基因组DNA是否消化完全是AFLP分析成败的决定性因素,因此分离到高质量的基因组DNA至关重要,基因组DNA260/280的值应为1.8左右。
在制备DNA的过程中要特别注意避免核酸酶及各种失活物质的污染。
2.2限制性内切酶的选择和组合
限制性内切酶的选择对AFLP分析的准确度具有关键性作用,其选择要根据分析对象的种类和所要达到的分辨度决定。
AFLP分析可以采用的酶有许多种,包括EcoRI、HindⅢ、ApaⅠ、TaqⅠ、MspⅠ、HpaⅡ、MseⅠ、PstⅠ等。
一般采用两种不同限制性内切酶（四碱基和六碱基,在不同物种基因组的AFLP分析过程中,所选用的限制性内切酶也不尽相同。
EcoRI可靠、高效而价廉,是六碱基内切酶的首选酶类。
四碱基内切在分析植物和微生物基因组时大多选用MseI。
因为其基因组内富含-AT序列,而MseI的识别序列为TTAA,与其它四碱基内切酶相比,在植物中我们通常选择EcoR-MseI组合,可以获得更多的便于PCR扩增和凝胶电泳分离的小片段DNA。
2.3引物和接头
引物和接头合成是AFLP技术中重要的步骤,AFLP技术的独特之处就在于人工设计合成了限制性内切酶的通用接头以及可与接头序列配对的专用引物,为此在不需要事先知道DNA序列信息的前提下,就可对酶切片段进行传统的PCR扩增。
接头是人工合成的一段短核苷酸双链,由一个通常长11~17碱基的中心序列和内切酶识别序列组成。
除了与相应的酶相匹配的粘性末端不同外,低频内切酶的接头与EcoRI接头（5'
-CTCGTA-GACTGCGTACC-3'
相同,TaqI与Msel接头（5'
-GACGATGAGTCCTGAG-3'
相同。
AFLP的PCR引物由3部分组成,与连接器序匹配的中心序列,相应的酶切位点和3'
端的选择碱基。
引物的设计是PCR扩增的关键,而引物设计主要在选择碱基数目及组合上。
可采用同位素（r33PATP,T4DNA连接酶进行末端标记,也可以采用生物素标记或荧光标记。
如EcoRI引物:
5'
GACTGCGTACCAATTCNNN3'
中心序列EcoRI切点选择性碱基
2.4反应条件
在利用AFLP技术分析较为复杂的基因组时,酶切片段要经过连续两次PCR扩增。
第一次PCR扩增反应（预扩增,引物中只含一个或不含选择性核苷酸,预扩增反应条件与常规PCR反应条件也大致相同,然后利用具有3个选择碱基的引物进行扩增,可以提高指纹图谱的清晰度,也可以减少扩增过程中的非特异谱带。
因为预扩增反应对选择扩增反应的模板起到了选择性纯化作用,也为以后的AFLP分析提供了足够的模板。
DNA选择性扩增的反应条件与普通PCR有所不同,它是采用温度梯度PCR。
其PCR开始于高温复性（一般采用65℃以期获得最佳选择性。
以后复性温度逐步降低0.7,一直降到复性效果最好的温度（一般是56℃。
然后保持这个复性温度,完成其余的PCR循环周期。
3AFLP技术在植物方面的应用
在生物种群区分和鉴定方面,AFLP技术显示出巨大优势,其一次检测的位点数之多是其它分子标记所无法相比的。
随着应用的深入,AFLP首先在植物育种遗传标记方面应用最广泛,在构建植物遗传图谱、遗传多态性研究、种质资源鉴定、作物育种辅助选择等众多领域有着其它分子标记技术不可比拟的优势。
刘峰AFLP技术及其在植物学应用中的研究进展·
89·
3.1构建遗传图谱（高密度
AFLP技术由于重复性好,且在一次实验中观察到大量的DNA多态性片段,AFLP不仅能缩小抗病基因与连锁标记之间的距离,而且在RFLP遗传图上,可增加染色体末端标记和填充RFLP空隙,不干扰RFLP标记簇（Becker等1995,因而AFLP可以构建高密度的遗传图。
对于构建遗传图谱,AFLP被认为是迄今最有效的分子标记技术。
近几年来,利用AFLP技术已对桉树、杨树、松树、垂枝桦、桃树进行了遗传图谱的构建并取得了巨大的进展。
3.2遗传多样性的研究
AFLP标记是进行种质亲缘关系分析和检测种质多样性的有效工具,可以确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系,从而确定亲本间遗传距离,并进而划分杂交优势,提高杂种优势潜力。
可以用杂合度和多态位点比例来衡量群体内的遗传多样性。
利用DNA多样性还可以进行种间亲缘关系分析,即计算种群间的遗传距离。
AFLP现已广泛用于植物的遗传多样性的研究,特别是在作物遗传多样性的种系方面,如用AFLP分析水稻、大豆、大麦,结果显示在种系间存在显著遗传差异,从获得的数据显示AFLP技术在鉴定低水平的遗传差异性和辨别高度相关性的基因型方面,具有足够高的灵敏度。
3.3品种、品系鉴定的研究
AFLP技术可在较短的时间内检测出大量的多态性标记,因而很适合鉴定种系DNA指纹,这是AFLP最适的应用范围,也是Zabeau和Vos申请专利的关键。
如Tohme等用AFLP分析了114个菜豆的基因型,并将它们分为4个基因库。
最近,由祝军等人将AFLP标记技术用来鉴定苹果品种,从68对引物中筛选出了4对多态性高、分辨能力强的引物。
分析了P32M46引物绘制的我国25个苹果重要品种的AFLP指纹图谱的遗传多样性。
罗志勇等首次用AFLP技术构建了人参（PanaxginsengCAMeyer和西洋参（PanaxquinquefoliumL。
的DNA指纹图谱,具有丰富的多态性,这对于鉴别人参品种、真假人参等提供非常有效的工具。
3.4辅助育种
AFLP技术有助于克服早期选择亲本基因组的盲目性。
Vantoai等利用AFLP研究了大豆轮回选择过程中、亲本基因组DNA对于子代的贡献,其结果发现,经过两次轮回选择,2个适应性亲本在后代的基因组中占75%,而4个外地品种只占后代基因组成分的25%。
此试验表明,根据AFLP标记可以进行轮回选择,可以跟踪基因的转移情况,如果AFLP标记与要选择的基因紧密连锁,这样就可以在早期筛选植物分离群体中分离出含目的基因的植株。
陈受宜等用RFLP、SSR和AFLP三种标记分析了大豆属的11个种,构建了大豆相关种的分子系统树并确立了半野生种G.gracilis的分类地位,对栽培大豆G.max的起源、进化和育种具有重要意义。
4展望
AFLP标记无法比拟的优点,和cDNA-AFLP的出现,使AFLP技术得到了快速的推广和应用。
通过阅读近年来的资料,统计分析发现,用AFLP标记进行研究的文献比率呈逐年上升趋势。
随着AFLP操作步骤的简单化、规范化和自动化,AFLP分析的效率会进一步提高,应用范围会不断扩大,AFLP标记将成为遗传学和分子生物学工作者手中强有力的研究工具。
[1]Barbier,EB,Burgess,JC,Folke,C.ParadiseLost.TheEcologicalEconomicsofBiodiversity[M].London:
EarthscanPublicationsLtd,1994.JiaJ,LiC,DengQ,WangB.ActaBotanicSinica,2003,45（5:
614~620.
[2]ZhejiangDaXueXueBaoYiXueBan.Establishmentoffingerprintdatabasefordrug-resistantstrainofAcinetobacterbaumanniibyAFLPmethod.2007Nov;
36（6:
537~42.Chinese.
[3]PradhanAK,GuptaV,eta.lTheorApplGenet,2003,106:
607~614.[4]LuGY,YangGS,FuTD.Plantbreeding,2004,123:
262~265.[5]NegiMS,DevicM,DelsenyM,LakshmikumaranM.TheorApplGenet,2002,101:
146~152.
[6]BeckerJ,VosP,KuiperM,etal.CombinedmappingofAFLPandRFLPmarkersinbarley[J].MolGenGenet,1995,249:
65~73.
[7]DasmahapatraKK,LacyRC,AmosW.EstimatinglevelsofinbreedingusingAFLPmarkers.Heredity.2007Nov7;
64~88.
[8]MIFTAHUDINGJ,SCOLESJ,GUSTAFSONP.AFLPmarkerstightlylinkedtothealuminum-tolerancegeneAlt3inrye（Secalece-realeL.[J].Theor.Appl.Genet.,2002,104:
626~631.
[9]周志勇,周钢,周肆清,等。
AFLP法构建人参、西洋参基因组DNA指纹图谱[J].药学学报2000,35（8:
626~629.
[10]李丽,郑晓鹰.AFLP分子标记应用于白菜品种鉴定[J].分子植物育种,2006,4（5:
685~689.
[11]唐静,蒲志刚,张敏,等.小麦锈菌AFLP分子标记技术体系的建立[J].中国农学通报,2005,21（8:
325~329.
[12]鹿金颖,毛永民,申莲英,等.用AFLP分子标记鉴定冬枣自然授粉实生后代杂种的研究[J].园艺学报,2005,32（4:
680~683.
[13]VosP,HogersR,BleekerM,etal.AnewconceptforDNA[J].NucleicAcidsRes,1995,23:
4407~4414.
[14]段会军,马峙英,张彩英,等.西瓜品种间亲缘关系的AFLP分析[J].河北农业大学学报,2007,30（1:
27~30.
[15]王斌,李传友,郑洪刚.水稻的AFLP研究初报—反应条件的优化及对温敏不育等位突变系的分析[J].植物学报,1999,41（5:
502~507.
[16]邸宏,陈伊里,金黎平.RAPD和AFLP标记分析中国马铃薯主要品种的遗传多样性[J].作物学报,2006,32（6:
899~904.
[17]李锡香,朱德蔚,杜永臣,沈镝,孔秋生,宋江萍.园艺学报,2004,31（3:
309~314.
[18]周李华.广东茶树种质资源遗传多样性AFLP分析[D].湖南农业大学硕士学位论文,2006.
[19]鲁凤娟.梨属植物AFLP反应体系的建立及其应河北农业大学硕士学位论文,2004.
[20]黄建安.茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基SNP研究[D].湖南农业大学博士学位论文,2004.
作者简介:
刘峰,男,研究实习员。
（2011-03-24收稿袁海峰编辑
《国土与自然资源研究》投稿地址:
黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平路103号,《国土与自然资源研究》编辑部收。
邮箱:
guotuyanjiu@;
guotuyanjiu@。
以上两种方式均为有效投稿,请作者写明详细的电话和地址等,以便联系。
90·
刘峰AFLP技术及其在植物学应用中的研究进展
升级会员 