酶工程复习Word格式文档下载.docx

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3、反馈抑制

是微生物细胞中变构调节的典型方式，因此非常重要，应用广泛。

概念:

生物合成途径的最终代谢产物抑制该途径的前面第一或第二个酶的催化活性;

通过变构调节进行抑制

4、分解代谢物阻遏

微生物与容易同化的碳源或氮源相接触，使有些酶的合成速率相对降低的作用

早期的实验现象为二次生长（diauxie）现象，又称为葡萄糖效应，在同时含葡萄糖（快速利用碳源）和乳糖（缓慢利用碳源）的培养基中培养大肠杆菌时，微生物首先利用葡萄糖生长，当葡萄糖耗尽，经过短暂的延滞后，才开始利用乳糖实现菌体的第二次对数生长。

后来发现，在以混合碳源培养微生物时，其它一些易于利用的碳源也具有与葡萄糖类似的作用

5、反馈阻遏

书上称为末端产物阻遏，P27定义：

生物合成途径的终点代谢产物极其衍生物在转录的水平上抑制该途径的所有酶的生物合成。

反馈阻遏的例子：

色氨酸操纵子

6、微生物的代谢调节和代谢工程

在发酵工业中，可根据微生物代谢调控的原理，使用合适的手段提高生产效率，包括生理水平、代谢途径水平和基因调控水平上的各种调节。

（反馈抑制、反馈阻遏、酶的诱导调节、分解代谢物阻遏、酶的共价修饰。

）

三、生产菌种的来源

1、发酵菌种的分离

根据所需要分离的微生物在自然界中的分布，从自然环境中取样并在选择性培养条件下分离目标菌株。

1、选择合适分离培养基2、选择合适的pH3、加入选择性抑制剂4、菌种的培养

2、含微生物材料的采集和处理方法

获得微生物和新产物，关键是：

选择合适的微生物源；

建立科学的筛选方案（检测系统）。

选择性强、灵敏度高。

菌种来源选择标准：

1、天然材料（土壤等）来源越广泛，含有目的菌的可能性越大，获得新菌种的可能性越高；

2、可寻找已适应苛刻环境的微生物类群。

3、利用同一生态环境内的不同环境条件分离出更多种类的菌株。

4、自然环境的菌群可因人类的活动而改变。

5、更新的生态环境仍有待开发

材料的预处理：

物理法①、热处理：

可减少材料中的细菌数。

因许多放线菌比细菌细胞耐热。

②、膜过滤：

样品中细胞数较少时（如水），可采用膜滤法浓缩。

滤膜的品种对收集菌的类型有重要的影响。

③、离心法：

处理放线菌繁殖体含量很低的海水，可先将样品离心后再过滤。

④、搅动释放孢子法：

收集腐烂稻草和其他植物材料中的嗜热放线菌孢子可在空气搅动下进行。

并可用一风筒或一简单的沉淀室收集孢子。

然后，用取样器将空气撞击在含培养基的平板上。

这样可以减少分离平板中的细菌数目。

化学法：

在分离前加一些固体基质（把几种基质加在土壤中）或洒些可溶性养分来强化培养基。

（3）诱饵技术：

将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。

3、筛选工业用菌株时宜考虑的指标:

①、营养特征；

②、生长温度最好>

40℃（降低发酵过程的冷却成本）；

③、对设备和生产过程的适应性。

④、遗传稳定性。

⑤、产物得率和产物浓度。

⑥、产物回收的难易度。

（要求获得高产菌株的同时,还要考虑生产过程中的经济问题.）

四、微生物优良菌种的选育

1、诱变选育

诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包括诱变和筛选两个步骤。

概念：

利用被称为诱变剂的物理因素或化学试剂处理微生物细胞，提高其基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。

原理：

在诱变剂的作用下会出现染色体畸变（染色体或DNA片段发生缺失、易位、重复等）；

基因突变（少数碱基改变）。

诱变选育的基本步骤：

选择出发菌株：

具有特定生产性状的能力或潜力；

形态、生理强壮，产量较高；

对诱变剂的敏感性大；

变异幅度大。

制备菌悬液：

尽可能均匀，避免因多细胞聚集造成诱变筛选得到的菌落不纯。

诱变剂及剂量的选择：

可以选择单一诱变剂，也可以选择复合诱变剂。

2、杂交育种

长期诱变会使菌种生活能力下降。

借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换（获优良性状集中的重组体）。

诱变育种：

变异的范围小，一个或少数几个基因发生突变，不太可能通过诱变获得新产品；

杂交育种：

变异的范围大，可能导致大范围遗传物质的改变，有可能通过杂交获得新产品。

3、原生质体融合

基本概念：

原生质体融合（protoplastfusion）：

在高渗的条件下把两个亲本的细胞通过酶解瓦解，得到原生质体，并在助融合剂如PEG的作用下使两个亲本的原生质体发生融合的过程。

原生质体：

在高渗溶液中出去细胞壁的细胞。

五、菌株保藏的原理和方法

斜面保藏法和穿刺保藏法：

斜面保藏法：

将菌种接种在斜面上，待长好后，放入4℃下保藏。

1月以内。

穿刺保藏法：

将菌种穿刺接种到软琼脂培养基中，待长好后，在其上覆盖石蜡油，放入4℃下保藏。

软琼脂培养基的成分和斜面相同，但琼脂的加量为1%，高度2cm，穿刺在其高度一半处。

1年以内。

2、真空冷冻干燥保藏法

原理：

使活的菌种在干燥、低温、无氧的环境下保藏，其生长代谢活动处于停滞状态，利于长期保藏。

方法：

在有保护剂、低温的条件下下快速将微生物细胞或孢子冷冻，在减压下使水分升华，干燥后密封，隔绝氧，这样可以长期保存。

优点：

保藏时间长（数年），可在常温下运输。

1、低温保藏法

多数微生物在-20℃低温下可保藏1年以上，在-80℃低温下可保藏数年。

方法：

对数生长后期的细菌、酵母，或培养成熟的孢子，加入15%的甘油或二甲亚砜中（这两种物质均为保护剂），放相应的温度下冷冻即可。

注意：

保藏过程中不能融化，否则会影响效果。

六、培养基及其制备

1、培养基的成分：

能源物质：

碳源物质氮源物质无机盐微量元素和生长因子水前体物质促进剂和抑制剂淀粉水解糖的制备：

酸解法、酶解法、酶酸结合法

2、不同碳、氮源的利用速度

一般情况：

单糖比双糖快；

双糖比多糖快；

纯多糖比杂多糖快（淀粉最好）。

快者为速效碳源，慢者为迟效碳源。

氨及铵盐等氮源的利用速度常随碳源的利用速度而变。

糖代谢中间产物是氨基酸的前体。

氨浓度过高或过低，特别是过高，对某些产物（如：

青霉素）的形成不利。

3碳氮比例的调节

碳氮比能直接影响微生物的生长和发酵产品的积累。

碳氮比严格讲指元素比，但通常指原料比。

产物不含氮，细菌，100:

0.2-2.0；

酵母菌，100:

20；

霉菌，100:

10。

如：

酒精发酵。

产物含氮，碳氮比较高。

谷氨酸生产，100:

15-21。

七、灭菌

1五种主要的灭菌方法；

化学药剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌

2根据灭菌方程，无论灭菌多长时间，发酵罐内的杂菌数量都不会降到0。

因此在计算灭菌时间时可设定一个灭菌后杂菌数量的目标值NS，如取NS为0.001个。

则根据灭菌方程，完成灭菌所需的时间为：

培养基灭菌：

计算时取对热抵抗力较大的芽孢杆菌的k进行计算，这时A取1.341036s-1，E可以取2.844105J/mol，于是式5-4变为：

某发酵罐，内装培养基40m3，在121℃下进行分批灭菌。

设每毫升培养基中含耐热的芽孢为1107个，求理论灭菌时间？

解：

3、空气的过滤除菌

压缩空气的冷却空气的除水除油

4、连续灭菌过程：

预热加热保温冷却