兽医细菌学附兽医真菌学课程论文文档格式.docx

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SS在血平板上产生α或β溶血，一般起先为α溶血，延时培养后则变为β溶血。

或者菌落周围不见溶血，刮去菌落则可见α或β溶血。

SS2型在绵羊血平板呈α溶血，马血平板则为β溶血[2]。

SS可发酵乳糖、菊糖、海藻糖、水杨苷、棉子糖,不发酵甘露糖、山梨醇[3]。

不同链球菌细胞壁内含多种氨基酸糖，构成了其群特异性抗原，根据链球菌群特异性抗原的不同，用兰氏（Lancefield）血清学分类，可将其分成20个血清群（A-V，缺I和J）。

我国猪链球菌病病原主要有C、D、E、L、R、S等群，再根据荚膜抗原的不同，将SS分成35个荚膜血清型[2,4]。

其中，具有群特异抗原R和荚膜抗原血清2型是属于人兽共患猪链球菌。

可用专门实验室提供的分型诊断血清进行乳胶或玻片凝集实验来确定血清型。

2.猪链球菌的毒力相关因子

有研究表明，并不是所有的SS都有致病性，猪群是否会发生SS感染与其带菌率的高低并无直接关系，而是与菌株是否表达毒力相关因子有很大关系[4,5]。

目前,有关SS毒力相关因子的研究主要集中在2型,主要有荚膜多糖（capsularpolysaccharide，CPS）、溶菌酶释放蛋白（muramidase-releasedprotein，MRP）、胞外因子（extracellularfactor，EF）、猪溶血素（suilysin，Sly）、orf2毒力相关基因、谷氨酸脱氢酶（gluta-matedehydrogenase,GDH）、纤连蛋白结合蛋白（fibronectin-bindingprotein）、IgG结合蛋白、Sao蛋白及DNase等[5,6]。

2.1荚膜多糖（CPS）

SS2型的CPS由葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、鼠李糖和唾液酸构成。

荚膜的存在降低了SS被吞噬的程度，而其无荚膜的突变株很容易被吞噬，荚膜厚度增加能提高菌株抵抗猪多形核白细胞杀伤的能力。

在体内和体外生长条件下的致病株和非致病株的比较中，致病株在体内荚膜明显增厚，而非致病株无变化。

SS2型的荚膜是一个重要的抗吞噬因子，也是一个重要致病因子，但许多非致病株也存在荚膜。

有研究表明，有着与毒力株相同大小的荚膜和唾液酸含量的SS无毒株并不能像毒力株那样引起猪脑膜炎。

另有研究显示，恢复期动物仅含有少量的荚膜抗体，而荚膜抗体也仅能产生部分保护力。

2.2溶菌酶释放蛋白（MRP）与胞外因子（EF）

MRP又称类M蛋白，为细菌的胞壁蛋白。

对MRP基因序列进行分析发现，其结构中有一个类似于A群链球菌M蛋白基因的锚式序列。

M蛋白是一种重要的毒力因子，其阳性菌株能抵抗巨噬细胞的吞噬作用并能黏附上皮细胞。

曾巧英等发现，MRP是主要的黏附素，能使SS2型黏附于人和猪的多种组织细胞上，从而促进SS2对宿主的感染。

同时通过电镜观察和流式细胞分析首次确证MRP具有诱导血管内皮细胞、上皮细胞融合和凋亡的功能，是SS2感染过程中突破扁桃腺和大脑血脑屏障的关键分子之一。

EF是一种仅能从细菌培养物上清液中检出的胞外蛋白。

MRP和EF与毒力因子之间存在密切的关系，但这2种蛋白对2型菌株的致病性并非不可缺少，Smith等的试验表明，MRP基因的突变株与原菌株的致病性一致。

不产生MRP和EF的菌株不一定是非致病株，如从加拿大分离的菌株并不表达MRP和EF。

Galina等1996年报道，能引起脑膜炎的菌株表型为MRP-及EF-，表明还存在其他毒力因子。

2.3溶血素（Sly）

SS2型溶血素是细菌生长过程中分泌的一种蛋白质，属于具巯基活性的毒素。

溶血素基因在细菌染色体中为单拷贝，编码含497个氨基酸的蛋白，其溶血活性与温度、血清白蛋白、氧气等因素相关，人O型红细胞对其最敏感，其次为马、绵羊、牛和猪的红细胞。

Jacob等用纯化的溶血素免疫的BALB/c小鼠，其体内不仅产生专一的溶血素抗体，而且能在受到致死剂量的全菌攻击时全部得到保护，对照组则全部死亡。

用纯化的溶血素免疫的猪，体内产生专一的溶血素抗体，而且受到全菌攻击时只表现轻微的临床症状，对照组表现严重的临床症状，因此猪链球菌溶血素可能是一种保护性抗原。

2.4orf2毒力相关基因

李干武等根据文献报道的orf2相关序列，通过PCR技术，首次在我国SS2分离株HA9801中检测到orf2毒力相关序列，并且发现orf2不仅存在于R群，也存在于A、B、C、D及其他血清型链球菌猪源分离株中。

说明该毒力基因在SS中普遍存在，至于其具体的致病作用如何，尚待用基因敲除法做进一步研究[7]。

2.5谷氨酸脱氢酶

谷氨酸脱氢酶是新近发现的一个与SS2毒力相关的因子[8]。

SS的谷氨酸脱氢酶属于GDH蛋白家族,在细胞表面表达,酶活性是NAD（P）H依赖型的,作用底物为L-谷氨酸,其编码基因在SS2中保守存在。

SS2的GDH有保守的抗原性,能与感染有SS的猪的血清反应,可作为检测SS的重要标志性抗原,有实验证明基于GDH蛋白的检测可区分SS2的强毒株、弱毒株和无毒株[8]。

2.6纤连蛋白结合蛋白

近来有研究显示,SS的纤连蛋白结合蛋（fibronectinandfibrinogen-bindingproteinofS.suis,FBPS）是一种新的毒力因子[9]。

SS的fbps基因存在于除32和34型以外的所有类型中，它与Streptococcusgordonii的FN/FGN（fibronectin/fibrinogen）结合蛋白基因及化脓性链球菌FBP54（fibronectinandfibrinogen-bindingprotein）基因同源。

很多种细菌的FN结合蛋白都是重要的毒力因子,参与细菌黏附上皮细胞和内皮细胞。

化脓性链球菌的FBP54在人类宿主中表达，参与细菌粘附口腔上皮细胞，并能诱导宿主产生保护性免疫。

实验显示猪链球菌FBPS突变株毒性低于野生株[9]。

2.7IgG结合蛋白

IgG结合蛋白为SS2所特有的毒力因子，相对分子质量为6000，属于热休克蛋白家族，能结合人和猪的IgG的Fc片段。

IgG结合蛋白不仅存在于细胞表面，也存在于细胞培养上清中[10]。

该蛋白可通过亲和层析进行纯化，电镜观察发现其呈细丝状结构，直径约4nm，尿素和乙醇胺可破坏这种结构。

IgG结合蛋白结合IgG的作用弱于蛋白A和蛋白G，但可与蛋白A和蛋白G竞争结合IgG，且能结合鸡IgG，而其他IgG结合蛋白则无此结合能力。

直接在硝酸纤维素膜上培养链球菌，再用人IgG作用，即可得到菌体表面的IgG结合蛋白[10]。

在酸性环境中加热或使用变溶菌素，可增加IgG的溶解度。

2.8Sao蛋白

Sao蛋白是一个C-末端锚定在SS表面的保守蛋白，相对分子质量为110000，具有革兰阳性菌膜锚定表面蛋白的典型特征[10]。

Li等通过对其分子特征进行分析和电镜观察发现，用含有重组Sao蛋白的SS2接种仔猪，可引起仔猪显著的体液免疫应答，且处于恢复期的猪血清仍可对该蛋白有较高的效价[11]。

表明Sao蛋白是一个在猪被感染后可以表达的潜在抗原。

2.9DNase

DNase为一种胞外核酸外切酶，在初核质和一些致病菌株的毒力因子中很常见。

目前发现，这种核酸酶（SsnA）在SS2的致病菌株的上清中存在，在1型和9型致病菌株中也可发现。

DNase有3126个碱基，通过表型核酸酶阴性pGh9：

Iss1插入突变株，序列分析发现，该酶是由35个氨基酸作为隐蔽信号序列、22个氨基酸作为DNA结合区域和一个典型的革兰阳性菌细胞壁分类基序组成。

该酶的活性需要通过Ca2＋、Mg2＋激活。

应用逆转录PCR技术，证明了SsnA在整个细胞生长阶段均有表达[10,11]。

用2型链球菌抗-SsnA抗血清与截断的SsnA（rSsnA△）进行Western杂交，证明SsnA在细胞内表达,并且抗-rSsnA△的抗体可有效中和SsnA的活性。

对该毒株的亚细胞及其突变株进行DNA-containing聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot分析，证明SsnA位于细胞壁上，与毒力相关。

3.猪链球菌的基因组

2006年上海的魏武等以SS2为例，分别对从病猪中分离出的菌株89-1591和来自英国WellcomeTrustSanger研究中心的菌株P1/7的全基因组序列进行了比较分析[12]。

StreptococcusSuis89-1591与StreptococcusSuisP1/7基因组的基本特征见表1。

研究表明，StreptococcusSuisP1/7基因组由一个环状的染色体组成。

基因组中总共找到了1969个ORF，编码蛋白质的ORF是1874个，对其中1447个CDSs给出了预测的功能，占总的CDSs的73.5%，含有448个操纵子（operon）。

而在StreptococcusSuis89/1591中预测的ORF是1918个，其中1486个赋予了功能注释，占总数的77.5%。

将Streptococcussuis89-1591中所有的连接群与StreptococcussuisP1/7整个基因组进行序列联配,在177个contig中,与P1/7基因组序列具有相似性的连接群有152个,总长为1788339bp,占总长的90.4%,含有418个操纵子[12]。

表1S.suis89-1581与S.suisP1/7菌株基因组基本信息比较

菌株名称S.suis89-1581S.suisP1/7

染色体基本信息

基因组大小/bp19782182007491

（G+C）含量（%）

整个基因组41.0341.30

编码蛋白区域35.4534.18

核糖体RNAs12

转运RNAs56

转座酶5125

CDS总数19181341

CDS平均长度/bp883902

CDSs按序列变化分类

所有同源基因13511341

直系同源基因总数13061306

核酸序列完全相同3131

核酸序列长度相同,具SNPs848848

核酸序列有插入或缺失427427

旁系同源基因总数4535

各自特有的基因567628

4.猪链球菌的检测方法

4.1生化鉴定

SS的生化反应活泼,不同血清型或同一血清型不同菌株之间的生化反应有差异,故生化鉴定只能作为补充性鉴定。

其生化特性：

伏波试验阴性,七叶苷水解阳性，6.5%NaCl中生长阴性，在绵羊血琼脂平板中缺少β溶血反应,SS2还有马尿酸盐、pyrrolidonylarylamidase和甘露糖阴性的特性[6]。

4.2血清学鉴定

根据SS荚膜多糖抗原性的不同,将其分为35个不同的血清型,该抗原亦作为SS血清学鉴定的基础。

①协同凝集试验：

先将血清和金黄色葡萄球菌A蛋白混匀,再与待测菌体混合,进行凝集试验,形成大颗粒凝集沉淀的为阳性；

②平板凝集试验：

在含SS选择性添加物的脑心培养基中再加入5%的抗血清，制成平板，然后接种待检菌,能形成大的沉淀圈的为阳性；

③免疫印迹分析：

提取待测菌株的荚膜多糖,凝胶电泳分离,转移到硝酸纤维素膜上,用特异性抗体杂交,最后酶联显色,产生特征性条带的为阳性；

④酶联免疫吸附法（ELISA）：

用荚膜多糖作抗原的ELISA（CPS-ELISA）鉴定SS时,结论不一：

KatokaY等（1996）报道CPS-ELISA法灵敏度和特异性均良好,但DelCampoSepulveda等（1996）报道说,CPS-ELISA法不同血清型间交叉反应高,特异性欠佳,不宜作为鉴定的方法;

用两种单克隆抗体的双抗体夹心ELISA法（doubleantibodysandwich-ELISA,DAS-ELISA）则更为可靠、快捷和简单；

⑤利用多克隆抗体的间接免疫荧光法和过氧化物酶-抗过氧化物酶法可检测组织切片中SS的类型,能进行细胞内SS的定位研究或诊断[6]。

4.3分子鉴定

4.3.1多位点酶电泳法（muilocusenzymeelectrophoresis,MEE）

不同型SS基因的差异导致胞内酶分子氨基酸序列的差异,也导致酶分子的电荷差异,在电泳时就表现为相对迁移率的差异,基于这一点就可用多酶电泳法区分不同型的猪链球菌[13]。

4.3.2脉冲场凝胶电泳法（pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE）

脉冲场凝胶电泳法通过电泳时电场的不断改变,使凝胶中DNA分子的泳动方向做相应改变,不同DNA分子泳动速率不同,故在凝胶上按染色体大小而呈现出不同的电泳带型。

PFGE是最有效的分子分型方法之一,能显示不同SS菌株之间复杂的基因差异,与传统血清型分型方法相比,PFGE更为精确,更适于应用和流行病学的研究[13]。

4.3.3限制性片段长度多态性分析（RFLP）

限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphisms,FLP）是指由于个体存在的基因差别,用相同的限制性内切酶酶切不同个体的基因时就会产生不同长短的片段。

利用这一特性可区分不同类型的SS。

OkwumabuaO等用PstⅠ限制性内切酶酶切SS基因组DNA，southern迹后用反转录自EscherichiacoliRE600的16S和23SrRNA混合物的cDNA探针杂交,大多数分离株（87%）拥有一个1.8kb的条带,他们认为此特异性条带可作为鉴定大多数SS分离株的一个有价值的基因标记,并证明采用RFLP能有效区分使用传统血清学、生化检测手段不能区分的SS分离株[13]。

4.3.4随机扩增核酸片段多态性分析（RAPD）

随机扩增核酸片段多态性（randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）是用一条随机引物对基因组DNA进行PCR扩增,引物非特异性识别细菌染色体上相应的DNA位点,发生多位点结合,这些位点间的DNA序列经PCR扩增,在琼脂糖凝胶电泳上出现多条分子质量大小不一的DNA带型；

若用多条不同序列的随机引物进行PCR扩增,就可对整个基因组DNA进行浏览,构建基因组指纹图谱（genomicfingerprinting）,根据图谱可鉴别细菌[13]。

RAPD法或DNA指纹法比血清学及生化试验方法更能反映菌株间的亲缘关系,能从分子水平上揭示菌株间的遗传距离,具有快速、简便、分型性高的优点。

4.3.5PCR法

SS的CPS、EPF、GDH基因序列已被测定,针对它们设计引物,采用PCR法可有效分离鉴定SS。

WisselinkHJ等利用cps、epf基因,使用多重PCR（multiplex-

PCR）法鉴定SS,将鉴定结果与细菌学检测结果作比较,有94%的结果与细菌学检测结果相同,另有6%的样品在细菌学检测中呈阴性,而用PCR方法检测呈阳性,可见PCR方法比细菌学检测更为灵敏[14]。

与其他分子鉴定方法相比,PCR法更为方便和快捷,适合于实验室检测大量样品,在临床和流行病学应用等方面有巨大潜力。

5.猪链球菌的致病机理

大多数研究者认为SS是通过上呼吸道进入宿主，聚居在腭的扁桃体中，定植于扁桃体黏膜表面后突破扁桃体及上呼吸道屏障,经血液循环到达中枢神经系统,在局部刺激产生大量细胞因子,炎症渗液大量蓄积于中枢神经系统,导致颅内的压力增大,从而出现典型脑膜炎症状[15]。

但也有研究者发现SS在猪的上皮和紧靠着上皮的次上皮区域中也有存在。

目前，相关研究主要集中在SS2型致猪脑膜炎的机理上。

一般认为SS2型首先定植于扁桃体中,突破扁桃体及上呼吸道的屏障后进入血液循环。

可能的机制有三种：

①在血液中，SS2被吞噬细胞吞噬,非致病株在细胞内被杀死，而致病株以某种机制存活下来，随单核细胞运行至大脑，继而入侵中枢神经系统。

②虽然在一定水平上观察到了吞噬作用，但很多链球菌仍在胞外，处于菌血症的猪外周血中，吞噬了细菌的单核细胞所占的比例低于2%，加之荚膜具有抗吞噬作用，因此大部分细菌游离存在于血液中随血液循环进行扩散。

③SS2能以高水平粘附于巨嗜细胞上而不被吞噬，因此推测血流中大量的胞外菌也是以粘附在细胞表面的方式进行扩散的。

血液中的猪链球菌穿过血脑屏障（bloodbrainbarrier,BBB）进入蛛网膜下隙（SAS）。

一般的脑炎病原菌，都是以游离菌的形式直接和BBB的脑微血管内皮细胞（BMEC）相互作用，而SS2和BBB的作用方式和其他脑炎病原菌不同，首先是SS2以游离状态，或粘附于吞噬细胞表面，或被吞噬在胞内三种方式和BMEC作用，其次是SS2的作用方式，试验表明SS2只能粘附于BMEC，所以粘附在感染中显得尤为重要，在粘附后，SS2穿过细胞层。

因SS2的溶血素有强大的杀细胞作用，所以推测在粘附作用和溶血素的联合作用下，可使细菌穿过BMEC进入中枢神经系统。

而溶血素阴性菌株，粘附后不直接损伤BMEC，通过其它机制穿越BBB，其中一种可能的机制是细菌粘附后，刺激白细胞或BMEC产生细胞因子，改变BBB的通透性，从而使溶血素阴性菌株穿过BBB，并且已有研究证明SS2确能刺激BMEC产生高水平的前炎性因子。

6.猪链球菌的药敏及抗药特性

与猪其它的病原细菌一样,SS对敏感的药物易产生抗药性。

Sanford等报道,SS对青霉素的敏感性一般为80%-95%[16]。

最小抑菌浓度试验表明，大多数分离株对青霉素中度敏感，对阿莫西林、氨苄青霉素等则高度敏感，对磺胺甲基异恶哇、壮观霉素、四环素、毗呱酸、复方新诺明、痢特灵不敏感，对四环素、林可霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素则具有高度的抵抗力[16,17]。

根据有关资料来看，不同地区分离的链球菌对抗生素的敏感性结果不一。

这与不同地区、不同猪场在饲养、疫病防治过程中用药情况不同有关。

细菌耐药性基因由质粒携带,并可通过性菌毛接合或转化等方式进行耐药性转移。

目前从SS获得的质粒基因在15-35kb,但抗生素抗性基因的转化却未得到证实。

Wasteson等证实猪链球菌对四环素、红霉素、卡那霉素的抗性可转移给敏感菌,这种猪链球菌间抗性的转移可能是由细菌的转座子介导[17]。

7.结语

SS血清型众多，所涉及的毒力因子也很多，对其致病机理的研究带来困难，同时也限制了有效疫苗的研发。

有研究表明，合理使用抗生素,配合药物治疗，如Chengappa用青霉素投入饮水或饲料中对SS进行防制，效果显著。

但也有研究显示，SS对敏感的药物易产生抗药性，故而研制能预防SS感染的疫苗成为防制该病的关键。

目前，国内外在猪链球菌病疫苗的研制方面开展了大量地研究，主要有全菌灭活疫苗、活疫苗和基因工程疫苗；

且大多集中在SS2型上。

因此，针对SS其他血清型的免疫防制及高效价基因工程疫苗的开发方面，有待于深入研究。

另外，选用何种动物及如何建立SS各血清型实验动物模型可能也是防制猪链球菌病的重要突破口。

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