蛋白组学Word下载.docx
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ｆarwestern assay蛋白免疫印迹分析：
基于wesｔｅrnblｏt,用能够与目标蛋白结合的非抗体蛋白质,检测蛋白质间的相互作用。
pepｔide massfiｎｇeｒprinｔiｎg肽质量指纹图谱：
理论上每个蛋白消化后不同的肽的分子量的图谱
ｐepｔidetaｑ肽标签:
指那些分子量小，不影响介质蛋白活性的多肽。
proteｏmecoｎtip蛋白质组重叠群:
细胞表达所有蛋白质中彼此可以通过末端重叠序列相互连接形成连接DNA长片段中一组克隆。
Lasercａpｔureｍicrodiｓsｅｃtioｎ激光捕获显微切割：
在不破坏组织结构、保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下直接从冰冻或石蜡包埋的组织切片中获取目标细胞。
ｇenｏmｅ基因组：
一个细胞或生物体所携带的一套完整单倍体序列
ｔｒａｎsｃrｉptoｍｅ转录组:
细胞内所有转录产物集合,mRNA，rRNA ， Ｔrnａ，非编码ＲNＡ
proteome蛋白组学：
一个基因组或一个细胞组织表达的所有蛋白质
exｐｒｅssiｏnproteomicｓ表达蛋白组学:
把细胞中蛋白建立蛋白定量表达图谱,整体水平上研究生物体蛋白质表达的变化。
differentiａｌ proｔeｏｍics差异蛋白组学：
通过寻找各种因素引起的蛋白质表达差异,以解释细胞生理和病理机制。
ｔａrgｅｔｅｄｐroteomics 定向蛋白组学：
利用质谱仪对一组过预筛选的蛋白质样品进行分析。
定向蛋白质组是指对特定已知蛋白质进行质谱检测,而不会像发现蛋白质组那样对所有未知蛋白进行全检测。
包括定向和定量。
第一章:
蛋白质组学简介
1．whyproｔeｏmics？
为何进行蛋白组研究?
①.蛋白质的重要性
a.蛋白质是细胞中的功能的承载者
ｂ.蛋白质参与了几乎所有的细胞过程，并实现了许多功能
c.从正常状态的偏差是造成疾病
d.蛋白质是药物/治疗靶点
②.全基因组序列的优势:
包含了巨大的信息
③.全基因组序列的缺陷
a.基因组序列-完成,不显示蛋白质的功能或生物过程发生
b.DNA、RNA和蛋白质之间的限制关系
c.一种蛋白质的功能往往取决于它的定位
d.一些生物样品不含核酸
④.蛋白质研究本身的重要性
a.蛋白质组反映生物系统状态的动态性
b.翻译后修饰
c.蛋白质折叠成特定的三维结构，确定功能
d．获得选择性剪接的洞察
e.艾滋病在基因组的注释
２．基因组（gｅｎome）、转录组（tｒａnsｃrｉptｏme）、蛋白组（pｒｏteome）三者的区别与联系
联系：
toｔalcｏncｅpt，cｏnｎecｔ bｙ centｒａldogma
区别:
geｎemRNA proｔeiｎ
ｓｔaticdｙnａmicdynamic
simplecomplex cｏmplex
static：
一个有机体从它的发生、发展、到衰老、死亡,不同细胞、组织、器官的基因组是基本稳定不变的。
dｙnamic:
转录组和蛋白组作为基因组转录表达的产物随时间、地点、环境等条件的变化而变化。
ｃｏmｐlex：
由于一个基因有多个转录产物,一个转录产物有多个蛋白。
3．为何一个基因有多种转录产物,一个转录产物有多种蛋白?
①.一个基因有多个转录产物：
a．可变剪切 b.可变启动子c.聚腺苷酸化的场所选用 d．特殊处理策略
②.一个转录产物有多个蛋白质:
a．启动子与终止密码子可变使用b.翻译中的修饰c.翻译后的修饰。
4.正向基因研究策略（foｒｗard geｎｅtics）：
phenotyｐeto gene正向遗传学:
通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变，然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因,并揭示其功能。
反向基因研究策略（ｒｅversｅgeｎetics）：
gｅnetophenotyｐe反向遗传学（geｎeknocｋout,geｎe ｋnockin） 在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。
5．seｑuenｃing coｍpletｅ不等于funcｔiｏnｋnown,ｗhy？
虽然遗传物质包含所有的细胞功能所需的信息，但是DＮA本身不进行细胞内的工作，在生物系统中进行化学和机械工作的蛋白质和调控性催化作用的RＮA都是那些基因的产物。
6.tradｉtionalproteinsｔudｙ和pｒoteomeｓtudｙ的区别。
蛋白质组研究本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰,蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。
而传统蛋白质研究是对单一蛋白质的结构和功能的研究，具有一定的局限性，无法联系各个蛋白之间的联系和影响。
第二章样品制备（选择\判断题）
1.样品制备的基本步骤
细胞破碎-蛋白提取－去除相互作用-去除杂质
２.细胞破碎方法（区别：
剧烈和温和裂解法）
ａ．剧烈方法：
超声破碎、珠磨法、高压匀浆法
b.温和方法:
酶法、去垢剂法、快速冻融法、渗透压法（低渗法）
3.（ｓａmplｅ ｅｘtraｃtioｎbuffｅｒ）样品制备液中6种主要组分,及其代表
变性剂（Ｄenaturereagent）:
变性和溶解，尿素、硫脲或者尿素和硫脲的结合
去垢剂（Detｅrｇｅnt）:
增加疏水性蛋白质的溶解度。
兼性离子型：
ＣHAPS，非离子型：
Tｒiｔon、Tween、NP-40，离子型:
SDS
还原剂（ｒeducing ｒeａgent）：
打断二硫键抑制蛋白的氧化作用。
带电荷的:
DTＴ、β-ME,不带电荷的：
TBP
两性电解质（aｍpｈolyteｓ）:
维持PH、一致的导电性促进溶解
染料（Dye）:
控制开始和运行的条件指示剂：
溴酚蓝
蛋白酶抑制剂（pｒoｔeasｅ inｈｉｂitors）:
抑制蛋白酶活性，ＰMSF（８mM）
第三章
1.双向电泳基本过程（等电聚焦—平衡—ＳDS电泳—染色—分析）
2．等电聚焦三种技术
ａ．IＳO-ＤＡLＴ：
用载体两性电解质生成PH梯度
b．Nｏn－equiｌibrium PＨgｒａdienteｌeｃtrophoresｉs:
非平衡等点聚焦电泳（半截中止）:
重要用于酸性蛋白的分离。
解决碱性蛋白质集中存在一点的问题。
c.IＰＧ-ＤALT:
baseｄonimmobiｌized PHgraｄｉent（IPG）sｔriｐｔs固定的PH梯度。
３．平衡的目的
将所有蛋白质与SDS偶联以提高从一维转向二维时的转移效果
4.SDＳ作用
蛋白质变性剂，使分子展开，同时给予蛋白质以负电荷,以去除蛋白质本身电荷所带来的影响。
５.主要染色方法？
分辨率约为多少?
染色方法 提取度 分辨率
考马斯亮蓝100nｇ３0nｇ-１0０nｇ
负染 15nｇ１5ng
银染20０pg ２0０pg-１pg
荧光染料 4００pｇ0.25-1ｎg
荧光标记 250ｐg
磷触屏0．2pg
稳定同位素标记＜１ｐｇ
分辨率：
在凝胶中将斑点分开的能力
6．如何提高分辨率,灵敏度?
提高分辨率：
a.使用更大的凝胶
ｂ.使用非线性的凝胶（非线性PH梯度）
ｃ.放大胶技术:
使用多个ＩEF胶,每个都有很窄的ＰH范围，然后将他们结合起来。
提高灵敏度：
a.放大胶技术
b.与分级分离或者亲和除去大量蛋白
c.增加染色的分辨率
7.特殊样本（如血液样本、膜蛋白样本）分析的主要问题及解决方法?
低丰度蛋白：
太少不能检测到,被高丰度蛋白所掩蔽。
解决办法：
提高沉淀量、使用窄PH范围的IPG,移去高丰度蛋白、样品预分级处理
膜蛋白样本:
低溶解度
强去垢剂溶解，预分级分离中选择性富集膜蛋白。
血液样本：
大多数血液流体中都带有大量存在的蛋白和盐离子
解决办法:
透析（除盐离子）、低电压等电聚焦电泳,预分级分离或移去大量存在的蛋白。
第四章
1.可用于样品鉴定的样品信息（PreoteinIＤs）有哪些?
各是如何获得的？
三种微测序方法及其原理？
分子量
等电点
氨基酸组成：
水解蛋白质-得到氨基酸,计算蛋白质中每种氨基酸的百分含量,在数据库中搜寻与查找。
Ｎ－端氨基酸:
用PＩTC标记N末端序列,水解，HPLC分析。
C-端氨基酸:
外肽酶加HPLＣ分析
蛋白质测序:
通过TagIdent软件,理论依据:
蛋白质末端序列有很高的特异性（N端保守性比Ｃ端强，可变性弱）
肽质量指纹图谱
三种测序方法：
N末端测序:
Edmａn降解，用PITC标记Ｎ末端序列（ＰITＣ属于比较柔的水解,只水解第一个氨基酸）。
水解（TFA）。
HPＬC分析。
C末端测序：
外肽酶和HＰＬC分析
重叠消化（胰蛋白酶+Glu－C）和Edman测序
2.质谱仪的基本组成？
哪些是离子化源，哪些是质量分析器？
质谱和串联质的区别?
如何命名质谱?
质谱仪组成:
离子化源（Iｏnizａtionsourｃe）、质量分析器（MasｓＡｎalyzeｒ）、检测器（Deｆectoｒ）、真空系统、进样系统
离子化源:
MALDＩ（mａtｒix-asｓiｓｔedlaser desorptioｎionization）基质辅助激光解吸电离
ＥSI（Eleｃtro-Sｐrayionizaｔioｎ）静电喷雾离子化
质量分析器:
Tｉme－ｏｆ-Fliｇhｔ（ＴOF）飞行时间
Qｕadrapole四级杆
Ioｎ-tｒａp离子阱
检测器:
ElecｔronMuｌtｉplier（EM）电子倍增器
质谱:
一个离子化源＋一个质量分析器
串联质谱：
一个离子化源+多个质量分析器（中间有碰撞室,将初选得到大的离子进一步碎片化。
多个分析器的目的是将母离子碎片化以得到分子的结构星系,也可以允许复制组分中成分的分离和鉴别。
3.常用的质谱信息有哪些？
什么是Peptideｍassｆiｎｇerｐrｉｎtiｎg和peptiｄeTaｇ,两者有何区别？
会根据质谱图计算蛋白分子量
常用的质谱信息:
质量范围、分辨率、灵敏度、扫描速度、稳定度、质谱图。
ｐeｐtｉdemaｓs fingerpｒinting（PＭF）肽质量指纹图谱：
用蛋白酶或化学试剂将目标蛋白消化成小肽，用质谱技术测量小肽的质量,将测得的质量与数据库中包含该蛋白序列的片段理论消化产物质量进行比较，然后用统计学方法比对对其进行评估和排名，确定小肽的结构。
将蛋白用酶消化成短肽,用质谱法测得质量，然后从已知序列的数据库中选择蛋白进行理论消化，得到理论短肽质量，两者进行比对，找到相似度最高的序列即可认为与目标蛋白相同。
Ｐeｐtｏdetag（肽序列标签）:
通过串联质谱法获得的肽的一段信息，可以用来识别蛋白质数据库中的这种肽。
ａa序列，N-末端片段质量、C-末端片段质量
４.比较MAＬＤI &
ESI、LａdｄerSeｑuｅｎcｉng &
tanｄeｍSeqｕeｎcing、Pｅptiｄeｍasｓfｉnｇerpriｎｔｉｎｇ&
ｐｅpｔｉdeTag
EＳI和MALDI的区别
MS/MＳ联用能力强弱
基质干扰无有
质量检测限 ７0KD 30０ＫB
电离方式软电离软电离
是否可用于研究非共价蛋白相互作用 可以 不可用
ＥSI适用于微孔径液相层析,适用于三级四级杆分析便于结构分析
电荷与峰谱多电荷、图谱复杂、分子质量测定准确但电荷或双电荷、图谱简单
适用于肽段翻译后修饰难测定肽段分析
分析复杂混合物不适合适合
定量需内标需内标
灵敏度亚fｍｏl-亚pmol 亚fmol-亚pmol
盐容忍性差，高反向色谱脱盐 较强
杂质容忍性直接进样时差,与液相联用后好 较好
LadｄｅrＳequenciｎg:
（阶梯测序）
是一种末端降解与质谱技术相结合的序列测定法
原理:
N-末端常用化学法,C-末端常用蛋白水解消
化法,, 级联由蛋白或多肽的Ｃ－或N-末端转化出一系
列片段（每个间相差１1个AA的肽序列阶梯））,用质谱分析ladder分子量，由分子量的差别确定AＡ类型从而测得ladder序列
质谱：
FＡB,PD（ｐｌasmadesｏrptｉon）,EＳI,MＡＬＤI-TOＦ
优点:
高数据获得率、测定时间短、样品需求少、灵敏度高（皮-飞摩尔）
tanｄemSｅｑuenｃing（串联测序）
通常一起使用一个以上的质量分析器,目的是从母体离子中的碎片离子提供分子的结构信息,还允许在复杂混合物中的化合物的分离和鉴定，碰撞细胞是在选择的离子被发送进一步的碎片
质量分析分离的多个阶段，可以完成与个别质谱仪在空间上分离的元素，或使用一个单一的质谱仪与时间间隔分离的质谱仪
第六章
1.什么是差异蛋白质组学？
主要研究技术有哪些?
哪些属于凝胶依赖的技术？
哪些属于非凝胶依赖的技术?
差异蛋白组学：
通过比较分析不同状态下或近似物种间蛋白质的表达图谱,实现对体内代谢的动态监测，从而揭示机体对内外环境的变化产生的本质规律。
主要研究对象：
①识别蛋白质动态变化或行为
②确定蛋白质的丰度不同，在两个或多个相关样本
③确定不同表达的蛋白质：
a.疾病标志物
b.新的治疗靶点
ｃ.具有相关功能的重要蛋白
主要研究技术：
①２－D聚丙烯酰氨凝胶电泳依赖的:
a.conveｎtionaｌ gel 传统的凝胶
ｂ. ２D-ＤIGＥ
ｃ. tｗo-in-onegeｌ
②质谱依赖的
ａ.蛋白的稳定同位素标记
b.无标记定量
③色谱依赖的
a.需要标记的定量模式:
代谢标记、化学标记、酶标记
b.不需要标记的定量模式：
ＳELDI、peｐtideｐｒoｆileｓ
２.什么是2D-ＤＩGE？
Twｏ-in-oｎe-gel?
２D-ＤIGＥ（twoｄｉmenｓiｏndiffｅｒence ｇｅｌelectｒｏｐｈoreｓis）一种新的荧光标记的定量蛋白质组学技术。
利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的第二向ＳDS-PAGE凝胶图像。
ｔwo－ｉn－oｎe-geｌ二合一凝胶：
将相同PＨ范围胶条一起进行ＳDS-PＡGE的技术
3．稳定同位素标记技术有哪些?
如何分类？
各有何代表?
同位素标记方法:
质谱依赖的:
蛋白质同位素标记法
色谱依赖的：
代谢标记:
细胞或者个体在富含稳定同位素的培养基或含有稳定标记的氨基酸的介质中生长，稳定同位素随细胞或个体代谢过程掺入合成的蛋白质，使蛋白质被标记。
如SILAC．
化学标记:
如（ICAT）同位素编码的亲和标签。
与含有硫基的蛋白肽反应
酶标记。
体内标记:
细胞或个体在含有同位素的介质中生长,稳定同位素被渗入合成的蛋白质,蛋白质被标记。
代谢标记、酶标记
体外标记:
在体外采用化学反应将合成好的内标与蛋白质结合使蛋白质被标记。
化学标记。
4.什么是ICAT?
iTRAQ？
两者的比较
ICAT（IsotopeCoｄｅdAffinｉtyTaq）同位素亲和标签技术:
iTRAQ（isobaric tａqｓfur ｒeｌatｉveanｄ aｂsｏｌuteｇuｅｎtiｔaｔion）同位素标记相对和绝对定量技术:
该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽Ｎ末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪分析,可同时比较８种样品间蛋白表达量。
第七章
1.蛋白质相互作用的研究技术分为哪三个层次?
所学的技术分别属于哪个层次?
原子水平、分子水平（二元分子相互作用、多分子相互作用）、细胞水平：
蛋白定位
技术层次：
原子：
ＮMR、X射线、免疫染色、电子顺磁共振
分子（二元）：
X射线、ＮMＲ、竞争性结合、凝胶阻滞分析、ELISA、双杂交、亲和柱、BＩAcｏre、电子顺磁共振、凝胶过滤、质谱筛选、免疫共沉淀、交联
分子（多元）：
ELIＳA、双杂交、亲和柱、BIＡcｏrｅ、免疫共沉淀、蔗糖梯度沉降、质谱筛选、凝胶过滤层析、共纯化
细胞:
免疫沉淀、免疫荧光共振、免疫定位、免疫染色、FRET、单克隆抗体阻塞、粘附相互作用分析、敲除、反义、短暂的共表达。
２．杂交技术的原理，主要问题,改进方式
原理:
通过转录因子和上游激活元件结合激活下游报告基因的转录与表达来研究蛋白与蛋白、蛋白与ＤＮA的相互作用。
当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后,诱饵蛋白结合于报道基因的启动子,启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用,反之则两者之间没有相互作用。
转录激活因子在结构上是组件式的,由两个（或以上）相对独立的结构域组成--DNA结合结构域（BD）和转录活化结构域（AＤ）。
两结构域建立空间联系是转录激活的关键,而单独作用无法激活转录过程。
分为：
酵母（单、双、三、反、核外）杂交系统、哺乳动物杂交系统、细菌杂交系统。
主要问题及改进方式
①核内作用:
不适于胞外受体配体作用及需要核外加工修饰等翻译后介导的蛋白质作用,也不适于膜蛋白。
改进：
改变某些细胞膜定位序列
在载体中添加核定位信号序列
专门研究非核内蛋白作用的系统（如ＳＯＳ恢复系统和泛素专一性蛋白酶系统等）
②假阳性：
靶蛋白本身含转录活化成分,即preyＡD自身可激活报告基因转录。
诱饵蛋白本身有激活作用,即BaitBD自身可激活报告基因转录。
preｙＡＤ对baitＢＤ无特异性
未被发现的调控途径激活报告基因,
杂交设计的原因:
暴露区域暴露，时空破坏
某些蛋白是依赖于遍在蛋白的蛋白酶水解途径成员，具有普遍蛋白间相互作用能力
改进:
对照实验
RＮＡ聚合酶Ⅲ转录基础上的双杂交系统
含三种不同的报告基因（ADE2，HＩS3和ＬacＺ）的酵母ＰJ6９-4A菌株
③假阴性：
融合蛋白对细胞有毒性,对于蛋白间相互作用效弱
选敏感性低的菌株或拷贝数低的载体
采取共转化的方法
选高敏感菌株或高拷贝载体。
④转化率低（比细菌低4个数量级）
共转化
酵母两性接合:
将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型单倍体酵母中再杂交
3.什么是展示系统?
展示系统如何分类？
哪些属于细胞依赖的展示方式？
哪些属于非细胞依赖的方式？
将外源肽或蛋白基因与噬菌体、细胞、细菌、真菌等特定蛋白基因在表面进行融合表达，且被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性,展示在细胞或受体的表面的技术,用以实现表型与基因型的统一。
细胞依赖（cｅｌl baseｄ）:
噬菌体展示（pｈagｅ ｄisｐlay）
细胞展示（cｅｌlｄiｓｐlaｙ）：
①细菌展示（Bactｅrｉｕm ｄisｐlay）
②酵母展示（Yeａstdiｓpｌay）
③哺乳动物细胞展示（Maｍmaliancelldispｌａy）
非细胞依赖（cellｆreｅ）：
体外展示（invｉｔroｄiｓplay）
①核糖体展示（Riｂoｓoｍedisplａｙ）
②ｍRＮＡ展示（mRNAｄｉsplａy）
③DＮA展示（ＤNAｄisplay）
４.区分单价展示（monoｄisｐlaｙ）和多价展示（ｍｕltｉpｌeｄiｓpｌａｙ）？
全展示（ｆuｌl dｉspｌay）和杂合展示（hybrid diｓｐlａy）？
多价展示还是单价展示的选择与载体类型的选择有关。
带有噬菌体正常启动子的普通噬菌体载体一般会形成多价展示，除非被展示蛋白被大量酶解。
另一方面,使用能在一个弱（或非诱导性）启动子的调控下将蛋白展示在ｐⅢ蛋白上的噬菌粒载体上,通常会导致被称为“单价展示”的结果。
5.亲和依赖的蛋白质相互作用方法有哪些？
各自的原理是什么？
①TagsPull-Down :
GST, His,Ｆlaｇ, HaloTaｇ
用
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