SD大鼠线栓法局灶性脑缺血再灌注模型的影响因素探析文档格式.docx

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脑血管病的发病率和病死率呈逐年上升趋势，给患者及其家庭和社会造成巨大的负担。

临床脑血管疾病中,70%以上为脑缺血性疾病,缺血性脑血管病中，大脑中动脉闭塞（middlecerebralarteryocclusion，MCAO）占60%以上，对其发病的机理、治疗方案的研究具有重要意义。

因此建立一种稳定性好、易操作、重复性好、梗塞部位确定为大脑中动脉闭塞（MCAO）的模型,对于实验缺血性脑血管病

的病机和治疗方案的研究,均有重要的医学价值。

国家自然资金项目：

电针对脑梗死远隔损害的影响及机制（81072947）负责人：

谭峰;

王健（1986-）广州中医药大学，研究方向：

脑病的临床与基础研究。

通讯作者：

谭峰（1959-）广州中医药大学附属佛山中医院脑病科主任，研究方向：

常见造模方法主要有:

电凝法、线栓法、血栓栓塞法、光化学诱导血栓法、开颅机械闭塞法等。

其中，线拴法建立MCAO模型因无需开颅即可造成脑组织半侧缺血、对动物病理刺激小、缺血侧和正常对照侧对比鲜明、缺血和再灌注时间可控、模型重复稳定性好、术后动物状态稳定等优点，线栓法被认为是唯一能观察到再灌注损伤的脑缺血模型。

国内外最常采用的大脑中动脉（MCAO）脑缺血动物模型的制备方法的是线栓法。

线栓法是1986年Koizumi首先采用的不开颅经颈总动脉栓入尼龙线导致大脑中动脉闭塞,这是可逆性的MCAO模型,开创了MCAO模型的经典方法。

在1989年,学者,Zea-Longa等对这种方法加以改良后广泛用于实验性脑缺血的研究[1]。

我们在实验中采用了,Zea-longa改进的线栓法,并对影响制备此模型的影响因素进行了总结归纳:

一实验原理

线栓法的解剖结构基础是颈内动脉系统在颅内和颈部的解剖连续性。

在颈外动脉上端插线栓，线栓经过颈外动脉—颈内动脉颈段—颈动脉管—颈内动脉脑底段—大脑后动脉起始端口—大脑中动脉起始端口—大脑前动脉始段上述血管结构。

在大脑中动脉从颈内动脉脑底段发出的起始端口，栓线的侧壁能进一步阻断进入大脑中动脉的血流，从而引起大脑中动脉供血区的缺血和梗死。

此时，栓线头端插入到大脑前动脉的起始部，并因其直径大于大脑前动脉起始部内径而停止在此。

大脑前动近段的血流被阻断，不可能回流入大脑中动脉。

而线栓侧大脑前动脉远段尚可经前交通动脉得到对侧的代偿血流而不出现缺血改变。

此外，栓线在颈内动脉脑底段内也可使进入大脑后动脉近段的血流减少，但线栓侧大脑后动脉远端还可得到经后交通动脉来的基底动脉系统代偿血流而不出现明显缺血改变。

因此，线栓法制备的缺血区主要发生在大脑中动脉供血区。

而大脑前动脉和大脑后动脉供血区还能保证较正常血流供应。

再灌注血流主要通过脑底动脉环的前交通动脉—大脑前动脉和后交通动脉—大脑后动脉而进入大脑中动脉缺血区，这包括了颈内动脉系统和椎-基动脉系统的代偿血流。

因具体线栓操作差异，血流代偿情况也出现各不相同。

从颈外动脉残端插入栓线进行线栓法操作，颈总动脉和颈内动脉只是暂时夹闭。

在灌注时，栓线被轻轻抽出到颈外动脉残端。

这样，线栓侧的颈内动脉代偿血流和脑底动脉环的代偿血流受到的影响小，比较接进生理性代偿血流。

大脑中动脉的再灌注代偿血流主要经脑底动脉环的前交通动脉和同侧的后交通动脉-大脑后动脉而来。

刘亢丁等[2]认为翼腭动脉结扎后，颈内动脉栓线周围容易形成血栓，导致管腔闭塞，影响再灌注时代偿血流的供应。

因此，缺血-再灌注大鼠模型不宜永久结扎翼腭动脉。

这也说明线栓法操作的改良要在掌握了大鼠脑血管解剖，造模原理的基础上进行。

不仅要考虑实用性，还要考虑是否能完全阻断进入大脑中动脉血流以及缺血后再灌注实现等问题。

二经典手术步骤

Zea-Longa[3]LongaEZ，WeinsteinPR，CarlsonS，eta1．Reversiblemiddlecere—bralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats[J]．Stroke，1989，20：

84—91．于1986年首次报道了尼龙线插线法制作的可逆性MCAO模型，解决了局灶性脑缺血再灌注损伤研究的难题。

该模型的制备方法是将动物麻醉后仰卧固定于手术台上，采用颈部正中切口或选择右侧颈部切口，分离一侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。

结扎颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉。

分离颈内动脉至鼓泡处可见其颅外分支翼腭动脉，穿线沿起点结扎分支。

在颈外动脉剪一小口，将制备好的尼龙线插入颈外动脉经颈总动脉分叉处进入颈内动脉，通过MCA起始端至大脑前动脉近端（插入深度平均约18.5±

0.5mm）。

再灌注时外拉此尼龙线使其球端回至颈外动脉内，即可恢复MCA血供进行再灌注。

若手术选择颈部旁侧手术入路，可使手术视野暴露更好，便于血管分离；

并且较颈部正中切口对气管刺激小，无需再行气管造瘘，使手术相对较简单。

病理检查结果显示，造模动物均存在缺血侧尾壳核及背外侧皮层梗塞，病变一致、稳定性好，缺血效果可靠。

尤其适用于基底节缺血再灌注的病理生理机制的研究和药物治疗效果与机制的观察。

此外，无需开颅、创伤小，栓线闭塞MCA后不引起血压、血气和体温的异常变化，不影响缺血后脑水肿和颅内压病理变化的自然过程等优点，均优于开颅闭塞MCA法建立的局灶性脑缺血模型。

三影响模型的成功因素与可改良的方案

3.1动物的选择

每种动物都有各自的生理特点，根据研究目的选择最合适的动物，建立一种最接近人类理想的脑缺血模型对于研究脑缺血病理机制和防治措施有着重要意义。

大鼠因脑血管解剖结构、功能与人类相似、品种多，成本低等优点，被应用于脑缺血的实验动物模型。

常用的实验大鼠品种有Sprague-Dawley大鼠，Wistar大鼠，Fischer-334。

造模过程中我们可以根据大鼠的品种、性别、年龄、体重进行筛选。

Wistar大鼠和SD大鼠都属于白色封闭群大鼠。

Wistar大鼠特点为头部较宽，耳朵较长，尾的长度小于身长与SD大鼠其特点为头部狭长,尾长接近身长，产仔多，生长发育较Wistar快。

这两种大鼠有很小的差异且SD大鼠在手术操作过程中出血较少，因此多选用SD大鼠。

因雌雌激素可通过MARK/ERK和PI3K/Akt细胞信号传导通路来快速、持续激活膜受体，起到保护神经元的作用，对脑损伤有保护作用，所以多选择雄性动物。

不同月龄的动物血管结构和形态均有不同程度的改变，对实验的进行有很大影响。

研究者发现，血管厚度随年龄而减小，内膜的变化主要表现为基膜增厚、内弹性膜厚薄不一、断裂或分层等。

文献发现老龄大鼠的抵抗力差，耐受性差，存故选择青壮年大鼠制备此模型，成功率较高。

1周龄、3周龄、5周龄、9周龄大鼠年龄相当于人类的婴儿期、青春期前、青春期、成年期,那意味着5-9周的大鼠相当于人类的青年时期。

毕方方等[4]认为250—300g的大鼠更适合制作MCAO模型，因250g以下大鼠颈动脉较细，线栓进入困难，且在再灌注中易引起蛛网膜下腔出血。

因而临床上我们多采用青壮年雄性体重在250—300g的SD大鼠。

综上我们选用SD雄性大鼠、月龄在5到9周、体重在250-300g的入组MACO模型。

3.2麻醉药物的选取

麻醉药物的选择是本模型制备中的一个重要因素，有多种麻醉药物可供选择，如水合氯醛、戊巴比妥钠、乙醚、乌拉坦等。

常用的几种麻醉剂，我们实验室更多的使用水合氯醛，就麻醉时间来说，感觉水合氯醛和戊巴比妥钠差不多，但戊巴比妥钠容易引起呼吸抑制，而且属于管制药品，获取比较困难，乌拉坦,会引起高渗，这么长的麻醉时间，中途肯定需要补充水分水合氯醛有现成的水溶液可用，虽然麻醉剂量与致死剂量相近，但还是很稳定的，一般能于术后2h左右清醒，有利于造模成功与否的判定以及行为学的观察[5]。

我们大鼠麻醉一般是10%，0.3ml/100g，小鼠是5%，0.08ml/10g，价格也很便宜，一般试剂公司都可以买到；

乙醚等吸人性麻醉药，因作用时间短暂，需持续给药，挥发的气体对呼吸道有明显的刺激，一般不宜选用。

我们选择10%水合氯醛，大鼠0.3ml/100g。

3.3线栓的选用

3.3.1线栓的种类

实施血流闭塞的特制材料是线栓，其直径与颈内动脉的内径逐渐相适应。

线栓的选择直接影响到大脑中动脉脑缺血动物模型制作的成败。

颈内动脉在走行中直径逐渐变细，而栓线直径没有变，栓线在插入过程中与颈内动脉结合趋于紧密，因此能逐渐减少、闭塞颈内动脉血流。

不同的人做同一型号的线栓的成功率会有很大的差别，我们需要型号和动物的匹配，还需要注意缺血时间和插线的深度是否合适。

另外如果采用不加任何处理的鱼线或仅用砂纸磨，因为头短的粗糙不光滑，会损伤血管内皮细胞，造成血栓形成，尽管有缺血，但很难再灌注了。

一般选用渔线或尼龙线，粗细与大鼠的体重相关，250～300g大鼠选取栓线直径以0.25mm为宜。

需要再灌注时,最好选择圆头顶端,以致将尼龙线抽回颈外动脉时不易脱出而引起出血。

线栓选择为外科尼龙线，直径有3-0、4-0两种，但研究者发现，使用3-0尼龙线导致蛛网膜下腔出血（SAH）率较4-0尼龙线要高，故现在多选用4-0外科手术线[6]。

我们在实验中发现运用0．20～0．24mm的进口鱼线代替4-0外科手术线，由于其韧性好，硬度也较佳，进线时较4-0手术线顺利，有利于模型的制备，故建议使用此线。

相同直径的鱼线，鱼线过软不利于插入MCA中，以硬度稍软的为佳，本实验室认为禁食后体质量在250～290g的大鼠，鱼线选择直径为0．25mm的较为合适。

3.3.2线栓的制备

制备大脑中动脉脑缺血模型线栓法中线栓的主要有两种方法。

为koizumi和longa等[7]的方法。

Koizumi将栓线的前段5mm左右的部分涂上硅树脂,使其变粗,变硬,直径达0.25～0.3mm,以利于进线和阻断血流。

Longa法是将栓线的头端烧成小的圆头,直径稍大于线栓的直径。

我们在实验中选用改进的longa法在解剖显微镜下,用烧灼器将线栓头端稍微加热,变粗即可,利于进入血管又能阻断血流。

3.3.3线栓的插法

线栓的插口选择有3种，一种是从颈总动脉插线，线栓直接从颈总动脉（CCA）经颈内动脉（ICA）插至MCA起始部，再灌注时抽回栓线至CCA内。

这种方法的特点是操作比较简单，插起来比较顺利，比较容易掌握，成功率也较高。

但该方法将导致持久的同侧颈总动脉阻塞,限制再灌注血流，若要进行缺血再灌注,则可将尼龙线从颈外插入,并且应将颈外和颈总动脉分支结扎,以防侧支血流进入缺血区,结扎翼腭动脉时,应于近分叉处结扎之,以防尼龙线误进翼腭动脉。

此方法中颈内动脉应尽量剥离较长,避免碰到颈动脉窦,若颈动脉夹松脱,会导致出血,影响模型进程。

另一种是线栓在颈外动脉（ECA）切口或断离,斜切口更易插入,插入后向下,剪断线栓上端颈外动脉（ECA）使之与颈内动脉（ICA）近似直线,顺颈外动脉（ECA）走向在颈内（ICA）缓慢推进直至感觉有少许阻力为止，入颅至大脑前动脉（ACA），达到阻断大脑中动脉的作用（如图2）[8]。

第三种是颈内动脉切口插入法:

此种方法要求有一定的技术操作,其手术前段注意事项同颈总动脉切口插入法,区别在于:

在剥离颈外时,不直接结扎,而将颈外动脉游离,要尽量剥离颈外动脉够一定的长度,小心处理颈外动脉的分支动脉,并在颈外动脉小切口下面备线待用。

颈内动脉和颈总动脉处理如上,插线时,力度适中,将颈外动脉拉下来同颈内动脉呈一条直线,剪口,插线,当线栓进入颈外动脉后即扎紧备线,然后松开颈内动脉夹,推进线栓进入颅内,其间主要注意血管被损出血情况[9]。

3.3.4线栓的插入的深度

线栓插入的深度是模型成功的关键环节，很多报道指出深度与动物的体重等情况相关。

建议长度，从分叉处记为18±

0.5mm，从颈外动脉起始处开始计深度为17mm，而其他一些学者研究280g的SD大鼠，发现从颈内动脉起始处计进入深度为22mm，在18mm更易产生神经障碍和缺血损害。

目前对于线栓进入深度较为统一的意见是18.5±

0.5mm，但是从颈外动脉起始处计。

若从颈总动脉进线，则线栓长度应适当加长，以使线栓能够达到大脑中动脉的顶部，使其有效阻断血流，使造模成功[10]。

如果线栓进入的长度明显小于17mm时，则会导致造模失败，影响实验的结果和可靠性。

四术后并发症和死亡原因

本模型手术后的常见并发症主要有：

蛛网膜下腔出血（SAH）、窒息、血栓形成等。

蛛网膜下腔出血（SAH）是该模型最常见的并发症，尼龙线在颅内穿破了动脉血管造成SAH。

发生SAH时,一些大鼠往往在抽线再灌注短时间内死亡。

研究者发现，使用3-0尼龙线导致蛛网膜下腔出血（SAH）率较4-0尼龙线要高,故现在多选用4-0外科手术线。

我们在实验中发现运用0.20～0.24mm的进口鱼线代替4-0外科手术线,由于其韧性好,硬度也较佳,进线时较4-0手术线顺利,有利于模型的制备,试验操作应轻柔,进线勿用力过度[11]。

血栓的形成是由于将尼龙线直接插入血管,引起了血管内皮的损害从而导致血栓形成,所以一些研究者使用肝素避免血栓形成,然而Elsaesser等[12]研究发现使用肝素和未使用肝素都未见血栓形成,使用肝素虽不增加SAH,但增加拔线后的出血,在插线过程中保持血管方向最大一致性、动作轻柔、尼龙线及其顶端圆头平整圆滑对预防血栓形成是很重要的。

线栓法手术过程及术后麻醉期,大鼠呼吸功能抑制,颈部手术过程中对呼吸道压迫及对支配相关神经损伤易使痰液阻塞呼吸道而出现呼吸困难,甚至窒息,可进行吸痰处理并尽量避免刺激神经。

五模型缺血效果评价

由于线栓法尼龙线入颅后的操作是非直视下进行的,MCA血流阻断与否无法直接判断。

根据神经症状,在MCAO不同时间观察动物行为,按不同方案进行评分,但对一些无或轻微神经功能障碍就认为是MCA阻塞不够,因此不能仅凭动物麻醉清醒后出现同侧Homer征和对侧前肢瘫痪判断阻塞成功与否[13]。

评价模型方法有多种，如神经功能损伤行为学评价、脑组织TTC染色、HE染色和CT灌注扫描等。

其中脑组织TTC染色能较直观地了解大鼠脑缺血情况，但需要一定的仪器设备和试剂，且需要处死大鼠，增加实验大鼠数量。

神经功能损伤行为学评价常用的方法有姿势反射实验、走木条实验、肢体放置实验及抓握一牵拉实验。

姿势反射实验主要用于评估永久性或暂时性MCAO模型中的皮质梗死，评估对侧肢体感觉运动及行为能力[14]。

本实验室在长期的实验观察中参考Longa[1]及Bederson[15]的5分制法在动物麻醉清醒后24h进行评分。

0分:

无神经损伤症状;

1分:

不能完全伸展对侧前爪;

2分:

向对侧转圈;

3分:

向对侧倾倒;

4分:

不能自发行走,意识丧失。

分值越高,说明动物行为障碍越严重。

神经功能缺失体征评分和脑组织TTC染色作为评价该模型缺血效果的标准。

六讨论

模型制作过程中需要注意以下几个问题：

（1）大鼠的麻醉程度要适中，过浅会影响手术过程的操作，过深会导致大鼠在术中的死亡。

但大鼠自身也有一定的差异性，可以在术前依据具体情况酌情追加一定量的麻醉药。

（2）术中血管的分离，在分离右侧CCA、ECA、ICA时,要特别注意迷走神经与颈动脉窦的保护,尽量避免对颈动脉窦和迷走神经的直接牵拉。

（3）手术视野的处理，为了在手术时能有一个清晰的视野，可以自制一些金属钩，将切口向左右拉开，加用显微眼镜尽量看清视野。

（4）栓塞线的处理,栓塞线是模型成败的关键，栓塞线一般选用钓鱼线，250～290g的大鼠，鱼线选择直径为0．25mm。

要用细砂纸将断端打磨圆滑,将栓线的头端烧成小的圆头，这也给模型的成功提供了保障。

（5）栓塞线插入方向的调整,在插入栓塞线时,有时栓塞线只进入了1cm左右就遇到了阻力,这种情况多数都是由于栓塞线误入了翼腭动脉可以将ICA继续向前分离,充分暴露出翼腭动脉,用镊子调整线栓的方向作以更正[16]。

综上所述，有很多因素都会影响脑缺血动物模型的制作，应考虑各种因素对模型的影响。

在制备大鼠大脑中动脉脑缺血动物模型过程中，要注意大鼠的选择，合适的麻醉剂，线栓的选取、制备情况，线栓的插入深度等，提高和保证造模的成功率，确保模型的复制成功，使实验的差异性进一步减小。

另外,大脑中动脉脑缺血动物模型线栓法还有许多不足,模型缺血失败的原因有两种:

一是尼龙线在颅内穿破了动脉血管造成SAH。

二是尼龙线虽然已经尽可能深入,但其头端仍没有到达MCA起始部,对血流的阻断不完全。

线栓法的缺点还有：

对实验动物体重有要求；

手术操作有一定难度；

与人类脑卒中存在一定差异。

这些都需要日后不断的补充、改进、完善,在实验中可以不断的摸索,寻找易复制的方法,以优化大鼠MCAO模型。

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