分子生物学基础知识Word格式文档下载.docx
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在细胞克隆中，对培养的细胞来说，从原有的克隆中，再筛选出具有某种特性的细胞进行培养，就是亚克隆。
在分子克隆中，从大片段的克隆中选取特定小片段再克隆。
亚克隆就是初步克隆的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，将目的基因所对应的一小段DNA找出来。
对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
亚克隆的基本过程包括：
（1）目的DNA片段和载体的制备；
（2）目的DNA片段和载体的连接；
（3）连接产物的转化；
（4）重组子筛选。
亚克隆技术：
限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。
首先，使用限制酶将目的基因切下。
切下来的目的基因需经过纯化（常用手法是凝胶分离法）。
之后，可以通过PCR来制造一定数量的该目的基因的拷贝。
同时，需要用切割目的基因的那种限制酶切割载体，以让载体产生与目的基因互补的黏性末端，以使得它们能在后续步骤中被DNA连接酶连接。
磷酸酯酶（通常是小牛肠道碱性磷酸酶（CIAP））在该过程中也必不可少，因为它能防止载体的自身黏合。
之后，再对目标载体进行分离/纯化。
接下来，将目的基因与载体混合，并添加DNA连接酶。
通常，目的基因和载体的分子数之比设定为5比1或10比1[1]（也有文献认为应为3比1[2]）。
目的基因与载体的数量过量都会造成不利影响。
另外，目的基因也不应过长。
超过10kb（千碱基对）的话，目的基因将难以和载体有效结合。
一般操作人员会把反应容器放在冰上，让反应进行一整晚
促卵泡激素
糖蛋白激素，α多肽
识别
其他数据
基因座11p13
促卵泡激素（英语：
follicle-stimulatinghormone,FSH，亦称为卵泡刺激素）是一种由脑垂体合成并分泌的激素，属于糖基化蛋白质激素，因最早发现其对女性卵泡成熟的刺激作用而得名。
后来的研究表明，促卵泡激素在男女两性体内都是很重要的激素之一，调控着发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的一系列生理过程。
促卵泡激素和黄体化激素在生殖相关的生理过程中协同发挥着至关重要的作用。
结构
促卵泡激素是一种糖蛋白，活性形式是糖基化的异源二聚体，由α和β两条多肽组成。
黄体化激素，甲状腺激素，人绒毛膜促性腺激素等糖蛋白激素采用了与促卵泡激素相似的结构。
它们共享同样的α亚基（含92位氨基酸残基），而β亚基则随激素的不同而不同。
促卵泡激素的β亚基含有118位氨基酸残基，负责与促卵泡激素受体的相互作用。
促卵泡激素表面的糖基化涉及海藻糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、以及硅铝酸。
其中，硅铝酸与促卵泡激素的生物半衰期紧密相关。
促卵泡激素的半衰期为3至4小时。
促卵泡激素的分子量约为30000Da。
基因
促卵泡激素α亚基的基因位于染色体，在多种不同细胞中有表达；
β亚基的基因位于染色体11p13，在脑垂体细胞中表达，受促性腺激素释放激素的控制，被抑制素所抑制，被激活素所增强。
活性
促卵泡激素调控人体的发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的一系列生理过程，特别是刺激生殖细胞的成熟。
在女性体内
在卵巢中，促卵泡激素刺激尚未成熟的卵泡的生长，直至成熟为格拉夫卵泡。
卵泡在生长过程中会释放抑制素以阻断促卵泡激素的进一步合成。
这一机制保证了排卵的选择性。
在黄体化阶段的末尾，促卵泡激素水平也有小幅度提升，可能与下一个排卵周期的开始有关。
在男性体内[编辑]
在睾丸中，促卵泡激素提高塞尔托利氏细胞合成男性激素结合蛋白的水平，诱发塞尔托利细胞的紧密结合，同时分泌抑制素，在成精子过程中起到至关重要的作用。
作用机理[编辑]
促卵泡激素的目标细胞表面表达有促卵泡激素受体，属于G蛋白偶联受体家族。
促卵泡激素与其受体蛋白的结合将导致后者的构象变化。
作为跨细胞膜的膜蛋白，促卵泡激素受体胞外的变构将引发胞内的变构，改变其与G蛋白的结合状态，并通过其它蛋白的参与，进一步诱发环磷酸腺苷等第二信使的生成，将信号传至细胞核内，实现对蛋白表达和细胞发育进程的调节。
相关疾病[编辑]
促卵泡激素水平在儿童期较低，而在女性的更年期之后则很高。
高促卵泡激素水平[编辑]
促卵泡激素的高水平预示着性腺引发的限制性反馈（负反馈）缺失，导致脑垂体不断合成促卵泡激素。
这在女性接近或处于更年期时属于正常现象，但对于处于生育年龄的女性则是不正常的，可能是以下疾病的信号：
过早绝经也称为卵巢早衰
性腺障碍或Turner综合征
阉割
斯外尔综合征
先天肾上腺增生的某些病例
睾丸失效
低促卵泡激素水平[编辑]
促卵泡激素分泌水平的降低将导致性腺功能的缺失。
在男性精子数量不足的病症中尤为典型。
在女性中表现为生育周期的停止，具体相关的疾病有:
多卵囊巢综合征，可能的体征有肥胖，多毛，不育等等；
考曼综合征
下丘脑抑制症
垂体机能减退症泌乳激素过多症
性腺功能低下症
正在接受性腺抑制治疗
使用促性腺激素释放激素结抗剂
使用促性腺激素释放激素促进剂（负调节）
医疗应用[编辑]
促卵泡激素可在绝经期女性的尿液中提取得到，也可以通过基因工程的方法重组表达得到。
临床用于对不育症患者的治疗，用以刺激卵泡的发育成熟，同时也用于体外人工受精和体内人工受精的相关治疗中。
促卵泡激素受体
FSHR基因位于人的2号染色体上p21区，长约2080个核苷酸
调控序列（英语：
Regulatorysequence，又译调节序列）是DNA中一段包含启动子、增强子，以及其他可与调节蛋白，如转录因子结合的位置。
这些序列调控了基因的表现，进而影响蛋白质的生产。
除此之外，mRNA也有调控序列，可与RNA结合蛋白或其他RNA结合
DNaseI，即DeoxyribonucleaseI，脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。
DNaseI水解单链或双链DNA后的产物，5'
端为磷酸基团，3'
端为羟基。
DNaseI活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。
镁离子存在条件下，DNaseI可随机剪切双链DNA的任意位点；
二价锰离子存在条件下，DNaseI可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。
特点：
不含RNase（RNasefree），可以用于各种RNA样品的处理。
提供了用于DNaseI失活所需的EDTA。
用途：
制备不含DNA的RNA样品；
RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染；
体外T7,T3,SP6等RNAPolymerases催化的RNA转录后去除DNA模板；
DNaseIfootprinting研究DNA-蛋白质相互作用；
缺口平移（nicktranslatioin）；
产生DNA随机片段文库；
细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照。
来源：
从牛胰腺纯化得到。
分子量：
约32kDa（单体）。
活性定义：
37℃10分钟内，将能够完全降解1μgpBR322质粒DNA所需的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件：
40mMTris-HCl，10mMMgSO4，1mMCaCl2，1μgofpBR322DNA。
纯度：
不含其它DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。
酶储存溶液：
50mMTris-acetate，10mMCaCl2，50%（v/v）glycerol。
ReactionBuffer（10X）：
100mMTris-HClat25℃），25mMMgCl2，1mMCaCl2。
失活或抑制：
加入EDTA至终浓度为后，65℃加热10分钟可使DNaseI失活。
酚氯仿抽提也可以使DNaseI失活。
金属离子螯合剂，达到毫摩尔/升浓度的锌离子，%的SDS，DTT、巯基乙醇等还原剂，50-100mM以上盐浓度均对DNaseI有显着抑制作用。
塞尔托利氏细胞会分泌以下的物质：
∙（AMH）——于生命的早期就开始分泌。
∙及——于后分泌，配合调节（FSH）的分泌。
∙——促进及成熟。
∙（GDNF）——证实是助长，以确保在产期时的自我更新。
∙Ets相关分子——滋养在成人精原细胞内的精细胞。
∙
结构[]
塞尔托利氏细胞之间的连接形成了，血睾屏障是一个结构分隔空隙区及内的向管腔区。
塞尔托利氏细胞控制养份、及其他进出睾丸的细管，且令向管腔区成为高度免疫的位点。
它亦负责确立及维持的利基，以确保精子的更新及精原细胞在的过程中逐步分裂为成熟的生殖细胞，而最终为放出。
其他
在的成熟阶段，塞尔托利氏细胞会消耗没有用的部分。
产生细胞
一旦塞尔托利氏细胞完全分裂，就不能再增生。
所以，一旦启动，就不会创造更多的塞尔托利氏细胞。
一些最近发现在身体以外仍能培育这些细胞。
这提供了治疗男性不育缺憾的可能性。
命名
塞尔托利氏细胞是由发现这种的生理学家塞尔托利（EnricoSertoli），他是在意大利研究医药时发现的。
他是于1862年在研究医药时用发现这种细胞。
他于1865年发表这种细胞的描述，并以“像树的细胞”或“黏性细胞”来形容它。
于1888年，其他以他的名字来称呼这些细胞。
组织学
标准的染色法，是很容易将塞尔托利氏细胞与其他生殖上皮混淆。
而它最大的分别就是它那深色的。
细管的横切面
病理学
是属于的
精子发生
维基百科，自由的百科全书
与成熟（）
精子发生（英语：
spermatogenesis）是的雄性动物的中，从一直发育到成熟的的过程。
细胞类型
/数量（人类）
拷贝/数量（人类）
Processenteredbycell
（typesAd,ApandB）
倍性（2N）/46
2C/46
（）
primary?
（1期）
2个
倍性（N）/23
（2期）
4个
1C/23
spermiation
倍性和染色体计数areforonecellinG1期,?
在?
anddivision之前
一个成熟的人类精子
目的
繁殖跟动植物一样。
位置
精子发生过程的位置是的数个结构。
最开始的阶段发生在睾丸，一直到结束。
附睾是发展中的精子成熟和储存直到的地方。
睾丸的是整个过程的起点，在那里邻近内管壁的干细胞朝着中心分裂—从管壁开始，进行到最内层的部分，即内腔—来生产未成熟的精子。
精子成熟过程发生在。
阶段
精母细胞发生
精母细胞发生示意图
主条目：
精细胞生成
精细胞生成（）是从生成（?
）的过程。
此过程前已生成的次级精母细胞迅速进入II期，产生精细胞。
精子形成
在精子形成（）阶段中，精细胞开始长出一条尾部。
塞尔托利氏细胞的角色
睾丸中的塞尔托利氏细胞（红色）和精母细胞（蓝色）。
附着于细胞的腔顶点尚未经历spermination的精细胞
影响因素
激素控制
精子发生的激素控制随物种而不同。
人类精子发生的激素控制机制尚未被完全理解。
参考文献
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DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
摘要:
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。
琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。
DNA在碱性条件下（pH80的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。
溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
Westernblot法即是一种将电泳与KIJSA结合起来的技术，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。
Westernblot法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定方法。
[1]
类型将电泳与KIJSA结合起来的技术分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段用途分析样本组分的免疫学测定方法，是美国斯坦福大学的乔治·
斯塔克发明的，WesternBlot法的名字就由发明者Southern与印迹的对象DNA相结合得出的Southernblot。
后来又出现了两个过程相似但对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个针对蛋白质，这两种技术分别被称为Northern和Western，WesternBlot法的叫法最终被确定下来。
生物大分子印迹法实际上是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶电泳已分离的区带转移并印迹于固定化纸上。
生物大分子印迹法始创于1975年，内苏格兰爱丁堡大学首先提出。
他将限制酶切后的DNA片段先进行琼脂糖凝胶电泳，把一张硝酸纤维素纸放在凝胶上，利用毛细作用原位凝胶中的DNA八片段转移到硝酸纤维素纸上使之固定化。
由于这种技术类似用吸干作品上的墨迹，使吸墨纸染上墨迹而被称为印迹法（blotting）。
1979年，Towbin等人利用电洗脱装置作为印迹动力，首先把Westernblot法用于抗原捡出，并称之为免疫印迹法（immunoblotting）。
对应于Southern（DNA分子杂交）、NoHhern（RNA分子杂交）。
1981年Burnette把免疫印迹法称为Westernblotting即蛋白质印迹法-Westernblot法。
[2]
分子生物学、生物化学和免疫遗传学中时常会用到的一种实验方法，并且是一种能对蛋白进行定性和半定量的分析方法。
是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，并且通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
蛋白质分析Western杂交法
DNA分析Southern杂交法
均是把电流分离的组分从凝胶转移至一种固相支持体，并均以针对特定氨基酸（Westernblot法）或核苷酸（Southern杂交法）序列所制备的特异性样品作为探针检测其相同或相似序列。
蛋白质的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
Westernblot法的主要优点在于，它能够从生物组织的粗提物或部分纯化的粗提物中检测和识别几种特异的蛋白质。
将聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分离的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶上通过电转移到一张合适的印迹膜上，随后用和灵敏检测系统相偶联的抗体来识别结合在膜上的一种或几种蛋白质。
这一技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需像免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。
因此要对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量时，Westernblot法极为有用。
由于蛋白质的电泳分离几乎总在变性条件下进行，因此溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题全都无需加以考虑。
启动子是DNA模板上专一地与RNA聚合酶结合并决定转录从何处起始的部位，也决定基因的转录效率。
生物中有许多启动子，如大肠杆菌约有2000个启动子。
各启动子的效率可不相同，大肠杆菌的强启动子每2秒钟启动一次转录，而弱启动子每10分钟才启动一次，从百多个大肠杆菌启动子结构的分析，得知两个强启动子的同源序列的中心在转录起始部位（基因编码链上第一个核苷酸）5'
侧约10和35个核苷酸处，弱启动子序列中往往有多处核苷酸被置换。
许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：
真核生物的启动子部位与原核生物不同，而且启动转录的活性，除需启动子外，还需某些外加序列。
启动子在遗传学中是指一段能使基因进行转录的去氧核糖核酸（DNA）序列。
启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。
在核糖核酸（RNA）合成中，启动子可以和决定转录的开始的转录因子产成相互作用，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。
完全的启动子称为规范序列。
3启动子元件
启动子代表一些重要的元件可以与其他调节区域（如增强子、沉默子、边界元件或绝缘子）合作一致，以主导基因转录的水平。
由于启动子一般都是在基因的上游，启动子所在的位置或是转录起始点会由+1开始编号。
上游的位置所以都是由+1逆数的负数，例如-100就是位置100的上游碱基对。
以下是各种启动子：
核心启动子是引发转录的必要部份及转录起始点，位置约为-35。
且是RNA聚合酶的结合位点及一般转录因子结合位点。
近端启动子是基因的近端序列上游，包括一些基本的调控元件，位置约为-250，且是特定转录因子结合位点。
远处启动子是基因的远处序列上游，包括一些额外的调控元件，影响力较近端启动子弱。
它是在上游更远的位置（但不是位置性的增强子或调控区域），是特定转录因子结合位点。
启动子规范序列的用途一般都是有问题的，且可引致对启动子序列的误解。
在规范序列中，转录因子结合位点在特定细胞情况下有一个单独的序列会与蛋白质牢固地结合。
但是自然选择会偏向较低能量的结合，作为一种调节转录输出。
这种最普遍的序列称为野生型序列。
这纵然不是最有利的序列，最近证据显示多种基因（包括原癌基因）都有G四股结构作为潜在调控信号。
在演化生物学的一个主要问题是修补启动子序列在演化过程中的重要性，例如人类血统从黑猩猩分开后的改变。
某些演化生物学家建议启动子的演化或调节区域可能比序列编码更重要。
5侧翼区
DNaseI足迹法（footprinting）
方法原理：
先将待测双链DNA片段中一条单链的一端选择性地进行末端标记,然后加入恰当浓度的DNaseⅠ,使在DNA链上随机形成缺口,经变性后电泳分离,放射自显影,即可形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带。
但当DNA片段与相应的序列特异性DNA结合蛋白结合后,DNA结合蛋白可保护相应的DNA序列不受DNaseⅠ的攻击,因而在放射自显影图谱上,DNA梯度条带在相应于DNA结合蛋白的结合区域中断,从而形成一空白区域,恰似蛋白质在DNA上留下的足迹,因而被形象地称作足迹法。
如果同时进行DNA化学测序,即可判断出结合区的精确顺序。
具体操作步骤（举具体的例子）：
探针制备及纯化 分别以BamHⅠ（标记Lowerstrand）和XhoⅠ（标记Upperstrand）酶切含104bp启动子片段的质粒pEGFP2104,回收纯化后依次加入5μl10×
Klenow缓冲液,2μl115mmolPLdGTP、dCTP和dTTP混合物,2μlα232P2dATP,1μl的Klenow酶,加水补至50μl混匀后,37℃温育20min,对两个3′粘端补平,并参入同位素进行标记。
标记后用XhoⅠ和BamHⅠ进行酶切,电泳回收标记后的启动子片段备用.
DNaseⅠ足迹分析样品处理 根据对A33表达情况的检测[11],本实验以LoVo细胞为A33基因表达的阳性细胞,293细胞为阴性对照。
在Eppendorf管中混合下列成分:
5μl5×
结合缓冲液,一端标记的探针（cpm值为104）,LoVo（分30μg和60μg两组）和293细胞核蛋白（60μg）,poly（dI2dC）·
poly
dI2dC）1μl,用去离子水调至50μl体积。
不加核蛋白的对照组加入40μgBSA。
室温放置30min。
加入5μl10×
Ca2+PMg2+室温放置1min。
加入适量的DNaseⅠ室温作用1min,立即加入140μl终止液（012molPLNaCl,20mmolPLEDTApH810,1%SDS,0125gPLcarrierRNA）终止反应。
加入200μlTris饱和酚：
氯仿（1∶1）抽提一次。
将水相转移至另一Eppendorf管中,加入500μl无
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