基因工程复习题汇总研究生课程.docx

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基因工程复习题汇总研究生课程

名词解释：

1.鸟枪法：

随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。

2.cDNA法：

互补DNA（ComplementaryDNA，cDNA）是一种利用逆转录酶，以RNA（通常是mRNA）为模板作成的复制品，经常用来将真核生物的基因（以mRNA形式）复制到原核生物细胞中。

3.PCR法：

又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。

4.基因库:

特定生物体全基因组的集合（天然存在）。

5.基因文库：

从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）

6.PCR（多聚酶链反应）：

是一种在体内快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。

在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

7.原位PCR技术：

即聚合酶原位扩增技术。

将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原位研究基因变化的技术。

8.荧光定量PCR：

在普通PCR的基础上加入非特异性的嵌入荧光染料或者特异性荧光探针，来反映或者更具特异性和专一性地反映PCR反应体系中总的核酸量。

9.实时定量PCR技术：

是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA（或cDNA）的起始浓度进行定量的方法。

10.质粒：

通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。

也成为DNA克隆载体。

11.同尾酶：

识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末端的两种酶。

12.同裂酶：

识别序列相同，对甲基化位点敏感性不同的两种酶。

13.转化：

重组质粒DNA分子通过细胞膜进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。

14.转导：

转导是指通过病毒将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象。

15.转染：

是针对真核细胞而言的，等同于转导。

真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程

16.包涵体：

在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地聚集在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构成为包涵体。

17.端粒重复序列（TEL）：

定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。

18.着丝粒（CEN）：

有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。

在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。

19.自主复制序列（ARS）：

一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。

20.原生质体：

原生质体指在人为条件下，去除原有细胞壁或抑制新生细胞壁后所得到的仅有一层细胞膜包裹着的圆球状对渗透敏感的细菌。

21.模式生物：

生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象，这种被选定的生物物种就是模式生物。

22.基因扩增现象：

基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。

经过压力筛选，相应的基因/酶高表达，附近的基因都会相应的扩增的一种现象。

23.转基因动物：

就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其胚囊细胞中，后改用注入受精卵的任何一个前核，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或胚囊细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物的子宫内，使之发育成具表达目的基因的胚胎动物，并能传给下一代。

这样，生育的动物为转基因动物。

24.细胞系：

从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。

25.细胞株：

从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。

26.凝胶过滤：

是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛。

27.电泳：

带电粒子在电场中移动的现象

28.盐溶现象：

加入离子有助于分散大分子上所带的电荷而使溶解度提高。

29.盐析：

离子强度提高到超多某一数值，带点分子将会沉淀下来。

30.亲和层析：

酶的底物或竞争性抑制剂通过共价键与惰性载体相连接，形成亲和载体。

当混合物通过亲和载体时，酶由于与底物或竞争性抑制剂之间由非共价键特异性相互作用而保留在柱子上，其他酶和杂蛋白被洗出柱子。

然后加入底物进行竞争，或改变pH或离子强度使结合的酶解吸，从而达到分离的目的。

31.酶的必需基团：

与酶活性有关的基因。

32.酶的活性中心：

由必需基因构成的与酶催化活性有关的特定区域。

33.酶的化学修饰：

通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。

34.定向进化技术：

人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因惊醒随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。

35.核酸分子杂交：

分子单链之间的互补碱基通过非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区。

36.生物芯片：

指通过自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。

37.蛋白芯片：

又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基，将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其他分子之间的相互作用关系。

38.微流控芯片实验室：

是以微流控技术为基础，把各种基本操作单元（细胞培养、分选、裂解、样品制备、反应、分离、检测等）集成到一块几平方厘米的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统而取代常规生物或化学实验室的各种功能。

简答题：

一、基因工程技术的主要内容或步骤：

1.从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。

2.在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。

3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞），并与之一起增殖。

4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。

5.从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。

6.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。

2、PCR技术的原理：

1.变性

在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。

2.退火

是模板与引物的复性。

引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。

3.延伸

从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’-3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。

3、成为质粒的必备条件

1.克隆位点（一个或多个）

2.能携带外源DNA片段进入受体细胞：

能自我复制，或整入染色体随受体细胞DNA复制而复制。

3.有选择克隆子的标记基因。

4.安全性（不含损害受体的基因，不任意转入别的，尤其人的细胞）

4、质粒克隆载体构建的基本策略（提高基因的表达，应如何增加质粒上的元件）

1.能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝）

2.克隆位点——组装MCS连杆

3.选择标记基因——抗性基因，LacZ’基因

4.分子尽可能小（转化率高），若分子量＞15kb，转化率大大降低。

5.组装各种“元件”，如启动子、终止子等。

5、核酸内切酶的分类

1.识别和切割位点不固定，随机性。

2.能在识别位点处切割DNA，切割位点固定。

核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的。

常用。

3.核酸内切酶活性和甲基化活性是不分开的。

6、影响限制性内切酶活性的因素：

1.DNA的纯度

2.DNA的甲基化

（1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌

（2）研究基因工程DNA甲基化程度

（3）改变限制酶的识别特性

3.温度

4.分子结构（对于具有超螺旋结构的质粒来说，切割时间要长，一般都是过夜；而对线性结构的DNA片段来说，2-3小时即可）

5.限制酶的缓冲液

【星号活性】：

在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列的现象。

7、作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性:

1.便于重组DNA分子的导入

2.能使重组DNA分子稳定存在于细胞

3.便于重组体的筛选

4.遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长

5.安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染

6.在理论研究和生产实践上有较高的应用价值

8、影响转化率的因素

1.分子质量较小的重组质粒DNA分子转化率较高

2.组成重组DNA分子的载体类型及其结构

3.重组DNA分子的浓度和纯度

9、大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素

1.SD序列将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译

2.翻译起始密码子

3.SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成（一般距离7个碱基较好）

4.基因编码区5’端若干密码子的碱基序列

10、包涵体的优缺点

优点：

1.能简化外源基因表达产物的分离操作

2.能在一定程度上保持表达产物的结构稳定

缺点：

以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，而这一操作实现起来较困难。

11、分泌性异源蛋白的表达以及其优缺点

在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：

即以可溶性或不溶性状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。

蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。

优点：

1.目的蛋白稳定性高2.目的蛋白易于分离3.目的蛋白末端完整

缺点：

1.大肠杆菌的蛋白分泌机制不健全2.外源真核生物基因很难在大肠杆菌中分泌表达，少数即便能表达其效率也很低

12、融合型异源蛋白的表达以及优缺点

将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。

优点：

1.目的蛋白稳定性高2.目的蛋白易于分离3.目的蛋白表达率高

4.目的蛋白溶解性好

缺点：

1.融合时要将目的基因切开，可能会造成结构的改变

2.目的蛋白需要回收:

融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获得目的蛋白。

13、酵母双杂交的基本原理

1.酵母双杂交系统首先在研究真核基因转录调控中建立。

2.典型的真核生长转录因子含有两个不同的结构域：

DNA结合结构域和转录激活结构域。

前者可识别DNA上的特异序列，并使转录酶激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

两个结构域不但可以在其连接区适当部位打开仍具有各自的功能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

14、噬菌体展示ScFv抗体操作示例。

15、

单克隆抗体杂交瘤技术与噬菌体抗体展示技术的比较

单克隆抗体杂交瘤技术

噬菌体抗体展示技术

宿主细胞

杂交瘤

细菌

免疫

必须

可避免

基因获取

再克隆

直接筛选

16、Ti质粒致瘤的分子机制

十七、原生质体的再生程序（理解）

将原生质体悬浮液滴在无菌滤纸片上，并置于含有普通植物细胞（即所谓的滋养细胞）的固体再生培养基的表面，使原生质体与滋养细胞不直接接触，但可吸收由滋养细胞分泌扩散出来的植物生长因子及其他化合物；培养2-3周后，将滤纸上的植物细胞蔟转移至含有高浓度分裂素和低浓度生长素的固体培养基上继续培育2-4周，滤纸片上便长出嫩芽；将嫩芽置入含有低浓度生长素而无分裂素的固体培养基上，使其根部发育；大约3周后再将之移植在土壤中，长成整株植物。

十八、利用转座子标签法分离基因的步骤

1.构建含转座子的质粒载体

2.将质粒载体通过农杆菌介导或其他适当转化方法导入目标植物中

3.分离和鉴定转座子插入突变体

4.检测转座子在目标植物体内的活动性能

5.利用转座子序列或克隆转座子的侧翼序列作为探针从插入突变体中分离克隆目的基因。

19、昆虫基因工程的研究主要在三大物种

果蝇系统：

P元件

蚊虫和农业害虫系统：

转座子转化

家蚕系统：

表达异源功能蛋白及病毒转染为特征

二十、杆状病毒作为载体的特性

1.病毒基因组较大，可以插入相当大的外源DNA

2.病毒对脊椎动物细胞无致病性

3.病毒基因组可以大量表达外源基因。

而且表达的产物分泌到细胞外面不致引起病毒或细胞的早日破裂，也有利于产物的分离提取。

4.外源DNA插入多角体蛋白基因内，使此基因功能失活，不能再合成多角体蛋白，也就不能形成包涵体。

用离心方法即可将其筛选出来。

5.杆状病毒——昆虫细胞系统能够完成翻译后蛋白质的加工修饰，使外源产物具有生物活性。

二十一、高等哺乳动物受体细胞应具备的条件

1.细胞系特征:

丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养

2.遗传稳定性：

外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存

3.合适的标记：

便于转化株的筛选和维持

4.生长快且齐：

分裂周期短，生长均一，便于控制

5.安全性能好：

不合成分泌致病物质，不致癌

二十二、营养缺陷型的哺乳动物受体细胞

二十三、培育基因靶向性敲除小鼠的实施步骤

1.首先将某基因突变为点经同源重组引入小鼠ES细胞

2.将含有靶向敲除的突变基因位点的ES细胞注入小鼠早期胚胎中，孕育出嵌合小鼠

3.检测嵌合小鼠交配后的生殖细胞内是否整合有突变的基因位点

4.在各只敲除的突变基因位点杂合行小鼠之间交配，以产生纯合性基因敲除小鼠

二十四、细胞培养中应注意的几个问题

1.培养液和培养物的比例

2.pH：

初培养pH应为7.4，培养过程中应不低于7.0

3.培养瓶内的空间：

一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:

10

4.容积、深度、表面面积

5.去除死细胞

6.温度控制：

动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。

温度低于36.5℃，细胞生长缓慢，高于37.5℃，细胞存活力降低。

二十五、细胞克隆技术的方法

1.稀释铺板法

2.饲养层克隆法

3.胶原膜板或纤维蛋白膜板克隆法

4.琼脂克隆法

5.在琼脂基底上用甲基纤维素克隆法

二十六、细胞系鉴定指标

1.形态学：

活细胞观察；固定染色观察培养细胞

2.染色体：

采用染色体数目、核型分析以及染色体分带技术检测

3.同工酶谱：

通常采用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、核苷磷酸化酶三种方法，根据条件选择

4.细胞DNA遗传特性：

一般采用Southern印迹杂交法检测。

二十七、哺乳动物细胞冷冻以及解冻要点：

慢冻快化

二十八、酶的分离方法

依据

方法

大小或质量

离心、凝胶过滤、透析、超过滤

电荷

离子交换色谱、电泳、等电聚焦

溶解度变化

改变pH、改变离子强度、降低介电常数

特异性结合位置

亲和色谱、亲和洗提

其他方法

热变性、羟基磷灰石色谱、疏水色谱、冷冻干燥浓缩

二十九、离子交换介质的选择原则

1）离子交换剂选择：

考虑酶稳定性需要

酶蛋白在くpI的pH条件下稳定用阳离子交换剂。

酶蛋白在〉pI的pH条件下稳定用阴离子交换剂

在﹤pIpH,﹥pIpH条件下均稳定二种交换剂都可用

2）如何选择强型和弱型交换剂

酶蛋白pI在<6或>9时

考虑用强型离子交换剂

酶蛋白是强型或弱型离子

考虑到酶的不稳定性，交换剂通用弱型

三十、具有特异性亲和作用的生物分子

1.抗原与抗体

2.DNA与互补DNA或RNA

3.酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子

4.激素或药物与其受体

5.维生素与其特异性结合蛋白

6.糖蛋白与其相应的植物凝集素

三十一、酶分离纯化的基本原则

1）切记酶是蛋白质，防止酶失活变性

a低温b.一般中性，pH<4,>10不稳定c.蛋白变性

d.重金属，有机溶剂，微生物及蛋白酶污染

2）不同的方法结合

3）追踪酶分离每一步的总活力和比活力，判别每步方法的可行性

三十二、原核细菌表达的重组蛋白产物的质量检测项目与方法

检测项目

检测方法

产品是否含有内毒素

家兔热源法

蛋白质是否变异

肽谱、HPLC、等电聚焦

甲硫氨酸是否被甲酰化

肽谱、质谱、HPLC、Edman分析

蛋白质是否变性、聚合、脱氨基

SDS-PAGE、凝胶层析、等电聚焦、质谱、HPLC

配体是否脱落

SDS-PAGE、免疫分析

氨基酸是否发生取代

氨基酸分析、肽谱、质谱

产品是否被细菌、病毒、支原体污染

微生物学检测

三十三、酶活性中心的共性

1）活性部位只占酶分子很小的一部分

2）活性部位是一个三维实体

3）活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中

4）活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）

5）酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合

三十四、稳定酶的方法

途径

方法

优点

不足

酶分子改造

核酸水平

蛋白质工程

从根本上提高酶分子稳定性

操作复杂，周期长

蛋白质水平

化学修饰

适应所有酶，操作简单经济

修饰过程破坏酶分子

剂型

固定化

适应所有酶，稳定新高，可重复利用和连续生产

载量较低，易失活

交联酶晶体

稳定性好，载量高，催化效率高

成本高

微环境改良

稳定剂

简单、经济

工作量大

反应介质

适用于特殊反应体系和酶类

适合的酶类还不普遍

三十五、核酸探针的种类

根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类；

根据探针的核算性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针,cRNA探针及寡核苷酸探针等几类；

DNA探针还有单链和双链之分

三十六、合成的寡核苷酸探针的优点

1.由于链短，其序列复杂度低，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短

2.寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能搭配能大幅度地降低杂交体的Tm值

3.一次可大量合成寡核苷酸探针，使得这种探针价格廉价

三十七、应用寡核苷酸探针的原则

1）长18-50nt，较长探针杂交时间长，合成量低；较短探针特异性会差些。

2）碱基成分：

G+C含量为40%-60%，超出此范围则会增加非特异性杂交。

3）探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构

4）避免单一碱基的重复出现

5）与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源

三十八、基因芯片的特点

1.微型化和自动化

2.高度平行性

3.巨大的信息产出率

4.高度敏感性和专一性

5.高度重复性

6.强大的类比性

7.哺育新的试验方法

PCR产物的酶切（先平连再消化）

载体的酶切

库的连接反应

电穿孔转化感受态E.ColiTG1细胞的制备

抗体库的构建

筛选

检测

分泌型ScFv的产生

测序

包括数轮识别-洗脱-复制的过程

活性克隆制备质粒DNA，VH和VL基因重新克隆于通用载体，利用通用引物测序。

PCR直接测序

电穿孔导入加入AMP抗性先构建轻链，再构建重链加入辅助噬菌体加入卡那霉素PEG-NaCl收集

a）ELISA检测b）特异型检测c）序列测定d）亲和性测定e）活性测定