基因工程复习总结.docx

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基因工程复习总结

1.定义

基因工程（geneengineering）,又称DNA重组技术（recombinantDNAtechnique）、分子克隆（molecularcloning）和遗传工程（geneticengineering）,是上世纪70年代兴起的技术科学.通过特殊的酶处理，使遗传物质在体外发生重组，从而产生自然界从未有过的重组DNA分子（至少包含两种不同生物的DNA片段）。

在他们进入一定的生物寄主后，不仅可以得到维持，而且可以得到扩增，其上的外源基因甚至可以得到表达。

2．孟德尔遗传定律的重新发现者:

荷兰的德弗里斯（H.DeVries）德国的科伦斯（C.Correns）.奥地利的契马克（E.Seysenegg-Tschermak）

3.外源DNA进入细菌后，面临两种命运：

一是被限制，即被降解；二是被修饰，即发生甲基化，不被降解。

4.原核细胞中限制和修饰系统

I类酶酶分子：

三亚基双功能；识别位点：

二分非对称序列；切割位点：

距识别位点1000bp；限制性反应与甲基化反应：

互斥；限制作用需要ATP:

需要

II类酶酶分子：

内切酶与甲基化酶分离;识别位点：

4-6bp序列，回文结构;切割位点：

在识别位点中或靠识别位点;限制性反应与甲基化反应：

分开反应;限制作用需要ATP:

需要

III类酶酶分子：

二亚基双能;识别位点：

5-7bp非对称序列;切割位点：

在识别位点下游24-26bp;限制性反应与甲基化反应：

同时竟争;限制作用需要ATP:

不需要

5.命名规则：

生物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称

基本名称+菌株名的字母+罗马字母（发现顺序）

HindIII

Haemophilusinfuenzaed株中的第三个酶

EcoRI

基因位于Escherichiacoli抗药性R质粒上

EcoRI

细菌属名细菌种名菌株类型有几种限制酶

6.识别的序列一般为4-8bp，常见的为6bp

Eg:

5bp识别位点EcoRIICCWGGW表示A或T；S表示C或G

7回文结构：

DNA局部双螺旋以某一对称轴旋转180度后，与另一侧的互补片段的顺序完全的DNA结构

8.M表示A或C；K表示G或T;Y表示C或T；R表示A或G

9切割的位置，有的在内部，有的在外部，外部的又有两端、两侧和单侧之分。

10.粘性末端（cohesiveend）:

识别位点为回文对称结构的序列经限制性内切酶切割后，产生的末端为粘性末端，形成的两个末端是相同的，也是互补的

平末端:

在回文对称轴上同时切割DNA的双链

11.同裂酶:

识别相同序列的限制性内切酶称为～。

它们的切割位点可能不同

同序同切酶:

识别序列和切割位置都相同

同序异切酶（Isoschizomer）:

识别序列相同，但切割位点不同

同功多位许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能

同尾酶（Isocaudarner）:

不同的限制性内切酶切割DNA产生的末端是相同的，切是对称的，即相同的粘性末端

12DNA末端长度对限制酶切割的影响:

限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸

*PCR引物设计酶切位点的时候要注意，如果是要对PCR产物进行酶切，则引物末端的酶切位点上要加保护碱基；如果是先将PCR产物连接到T-Vector，再进行酶切，则不需要加保护碱基

13.星星活性:

在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为～

原因：

甘油浓度高（＞5%），酶过量（＞100U/ul），离子强度低（＜25mol/L），pH值过高（＞8.0），加入了有机溶剂如DMSO、乙醇等，或是铜、锰、钴或锌离子代替了镁离子

抑制星星活性的措施：

减少酶的用量、甘油的浓度，保证体系中没有有机溶剂，提高离子强度，降低pH值（7.0），使用镁离子

14影响内切酶活性的因素:

.DNA纯度DNA纯度低，蛋白质含量高，影响酶切效果

.DNA的甲基化程度

.酶切反应的温度;反应温度一般是37度

.DNA的分子构型:

线性DNA容易切割，超螺旋较难

.缓冲液:

不同的酶，其buffer是不同的

15.甲基化酶对限制酶切的影响:

.修饰酶切位点.产生新的酶切位点对基因组作图的影响

16.DNA连接酶有两种：

大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶

大肠杆菌DNA连接酶：

需要NAD+，只能连接粘性末端，不能连接平末端（后来研究发现也可以连接平末端，效率中等）

T4DNA连接酶：

需要ATP，能连接粘性末端和平末端。

连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺口

17.DNA片段在体外的连接:

1.粘性末端的连接2.平末端的连接3.非互补末端的连接（可以使用同聚物加尾的方法，通过在一群DNA分子3′加上寡聚（dA）,同时在另一群DNA分子的3′端加上寡聚（dT）。

末端脱氧核苷酸转移酶有此功能）4.接头的使用

（1）Linker:

是由化学合成的一段由8-16个核苷酸组成的双链寡核苷酸片段，其中具有一个限制性内切酶的识别序列，两端是平末端

（2）adaptor:

是一类由化学合成的、短小的双链寡核苷酸，寡核苷酸的一端是平末端，可与外源DNA相连，另一端是粘性末端，即与某种限制性内切酶切割后的末端相同。

5.PCR产物的连接

（1）T-vector的使用PCR反应使用的Taq酶，具有末端转移酶的活性，可以在PCR产物的3′末端加上1个A。

（2）在引物的5′端加上酶切位点（3）牛痘拓扑异构酶:

该酶可以切割和重新连接DNA分子。

线性双链DNA分子的两端附近放置一个CCCTT序列，可由牛痘拓扑异构酶活化，并插入到质粒载体中。

不需要限制酶和连接酶，反应时间是5min。

18影响连接反应的因素:

连接的温度16-22℃，2h；4℃，overnight

.离子浓度.DNA末端的特性粘性末端、平末端.DNA片段的相对浓度载体与外源基因的比例为1:

1~1:

3.DNA分子量

19大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ:

.具有依赖于DNA的5′-3′方向的DNA聚合酶活性

.具有5′-3′的外切酶活性，能从5′末端降解双链DNA，该酶还能降解RNA-DNA杂合体中的RNA

.具有3′-5′方向的外切酶活性在dNTPs存在的情况下，该活性被抑制

20.klenow片段:

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，经枯草杆菌蛋白酶处理后，分割成两个片段，其中大片段称为～。

具有5′-3′聚合酶和3′-5′外切酶活性

用途：

1）填充和补平限制性内切酶切割后产生的凹陷的3′末端2）标记DNA片段的末端3）催化cDNA第二链的合成4）用于DNA的序列分析5）催化与单链配对的寡核苷酸引物的延伸，合成杂交探针

21.T4DNA聚合酶

具有依赖于DNA的5′-3′聚合酶活性及单链和双链的3′-5′外切酶活性，且3′-5′外切酶活性非常强，是Klenow片段的200倍，缺乏5′-3′外切酶活性

用途：

不论是凸出的5′端还是3′端，只要满足高浓度dNTPs的要求，该酶都能将末端补平，使DNA便于与街头连接.;可用于3′端凸出DNA的末端标记;3′凹陷末端同位素标记

22.天然的T7DNA聚合酶:

用途：

（1）该酶具有极强的持续聚合能力，可用于引物长距离的延伸；

（2）用于定点诱变中的互补链的合成；（3）3′末端的标记

23.修饰的T7DNA聚合酶该酶的3-5外切酶活性被化学反应选择性地降低或被遗传修饰的方法完全抑制。

用途：

a）作为一种DNA序列分析的工具酶，修饰的T7DNA聚合b）酶具有一系列的理想特性：

加工性能高，无3′-5′外切酶活性，催化脱氧核苷酸类食物（双脱氧核苷酸）的聚合能力同催化正常核苷酸的聚合能力完全一样。

c）能有效地催化低水平的dNTPs，可用来制备标记的底物d）具有很高的比活性，且有失去了3′-5′外切酶活性，因此，可以有效地填补和标记具有5凸出末端的DNA片段之3′末端

24.依赖于DNA的RNA聚合酶

用途：

#.合成单链RNA，用作杂交探针，或在体外翻译系统中用作mRNA

#利用T7RNA聚合酶及其表达系统，能够使外源基因在细菌和酵母中得到表达。

25.末端脱氧核苷酸转移酶，简称末端转移酶，从小牛胸腺中分离出来。

.可以将dNTPs逐个地加到线性DNA分子的3′末端

.底物可以是单链DNA、也可以是具有3′末端凸出的双链DNA

.平末端双链DNA分子不是该没的有效底物，但如果用Co2+离子代替Mg2+离子，也可以成为有效底物

用途：

催化[α-32P]-3′-脱氧核苷酸标记DNA片段的3′末端

.催化非放射性的标记物参入到DNA片段的3′末端

.按照模板，合成多聚脱氧核苷酸的同聚物

26.核酸外切酶（exonucleases）是一类从多核苷酸链的一头开始按顺序降解核苷酸的酶。

.核酸外切酶Ⅶ:

大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ由两个亚基组成，分别为xseA和xseB基因编码

核酸外切酶Ⅶ是一种单链核酸外切酶，能从5′或3′末端降解DNA分子，不需要Mg2+

27.核酸外切酶Ⅲ:

由大肠杆菌xthA基因编码，降解DNA的速度取决于DNA分子的碱基成分，C≥A~T≥G

主要活性：

从3′-5′的方向催化双链DNA的降解

其他活性：

无嘌呤无嘧啶位点特异的核酸内切酶活性，3-磷酸酶活性和RnaseH酶的活性

主要应用是通过3′-5′活性，使双链DNA分子产生单链区，经过如此修饰的DNA，配合使用Klenow酶，可作为标记DNA的底物，制备探针。

3′隐蔽端与5′隐蔽端相比，优先降解3隐蔽端的双链DNA分子。

27.λ核酸外切酶催化双链DNA分子自5′-p末端进行逐步的加工和水解，但不能降解5′-oH末端

用途：

将双链DNA转变成单链的DNA，供按双脱氧法进行DNA序列分析；从双链DNA分子中移除5′突出末端，以便用末端转移酶进行加尾

28.单链核酸内切酶a）主要功能是催化RNA和单链DNA分子的降解，也可作用于双链核酸分子的单链区，这种单链区可以小到1个碱基。

b）可以测定杂交核酸分子（DNA/DNA或RNA/DNA的杂交程度c）给RNA分子定位.d）测定真核生物中内含子的位置e）探测双螺旋的DNA区域f）移除双链中突出的序列g）打开双链cDNA合成期间形成的发荚环结构

29.载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：

1分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。

.2能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。

3.要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。

4.有适合的标记，易于选择。

5.有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。

6.从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。

30.质粒（plasmid）是存在于细胞中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。

质粒是环形双链的DNA分子，但酵母的杀伤质粒（killerplasmid）是一种RNA质粒。

质粒具有三种构型：

.共价闭合环形DNA（cccDNA），通常呈超螺旋的SC构型，其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构

.开环DNA（ocDNA），即OC构型，两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口

.线性DNA，即L构型。

质粒DNA经适当的核酸内切酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子

31.作为基因克隆载体的质粒DNA分子，具有三个共同的组分：

复制基因replicator选择标记基因selectionmakergene和克隆位点

32.质粒编码一些重要的非染色体控制的遗传性状，包括抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子等。

还有一类质粒，它们究竟赋予寄主细胞何种表型，迄今仍不清楚，因此，这类质粒称为隐蔽质粒（crypticplasmid

33.质粒的类型

1）F质粒:

又叫F因子或性质粒（sexplasmid）。

它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

F质粒，又称F因子，即致育因子,在寄主细胞中以三中不同的形式存在：

以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA片段，这样的细胞称为F+细胞;.以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上携带有细菌的染色体基因或DNA片段，这样的细胞称为F′细胞:

以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上，这样的细胞称为Hfr细胞（高频重组细胞）

2）.R质粒:

通称抗药性因子。

它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力

3）.Col质粒:

即所谓产生大肠杆菌素因子。

它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。

大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

34.分类：

.结合型质粒（conjugativeplasmid），又叫自我转移质粒，除了具有自主复制所必需的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因

.非结合型质粒（non-conjugativeplasmid），又称非自我转移的质粒，具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和结合转移的基因，因此，不能从一个细胞自我转移到另一个细胞

35.质粒转移的必备条件

ⅰ.转移起点（oriT）,它是质粒DNA转移时的复制起点—顺式作用（cis-action）

ii.细胞附属物—性纤毛，由蛋白质构成—反式作用

ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用

质粒转移类型

ⅰ.自我转移（Self-transmissible）

ⅱ.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备oriT，若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。

若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。

ⅲ.重组转移（conduction）—若质粒无oriT，该质粒只有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。

36.质粒不亲和性（plasmidincompatibility），也称不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。

37.低拷贝数的质粒：

每个寄主细胞中仅有1-3份拷贝，这类质粒为严谨型复制控制的质粒（stringentplasmid）

高拷贝数的质粒：

每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝，这类质粒为松弛型复制控制的质粒（relaxedplasmid）

（质粒的拷贝数，是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含的质粒DNA分子的数目）

38.质粒载体必须具备的基本条件:

.具有复制起点一个质粒只有一个复制起点，但少数情况下有两个复制起点，但其中只有一个有活性.具有抗菌素抗性基因.具有若干限制酶单一识别位点.具有较小的分子量和较高的拷贝数

39.质粒载体的选择记号

抗菌素名称

作用方式

抗性机理

氨苄青霉素（Amp）

干扰细胞壁合成之末端反应而杀死细胞

Ampr编码β-内酰胺酶，可切割氨苄青霉素的β-内酰胺环，使之失去杀菌能力

氯霉素（Cml）

同50S亚基结合，干扰蛋白质合成，抑菌剂

Cml编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活

卡那霉素（Km或kan）

同70S亚基结合，导致mRNA发生错读，杀菌剂

编码氨基糖苷磷酸转移酶，可对卡那霉素进行修饰，从而阻止其同核糖体之间发生相互作用

链霉素（Sm）

同30S亚基结合，导致mRNA发生错读，杀菌剂

编码一种特异性酶，对链霉素进行修饰，抑制其同30S亚基结合

四环素（Tet）

同30S亚基结合，阻止蛋白质的合成，抑菌剂

编码的酶对细菌膜结构进行修饰，阻止四环素从培养基运到细胞内

40.不同类型的质粒载体:

高拷贝数的质粒载体.低拷贝数的质粒载体.失控的质粒载体.插入失活型的质粒载体.正选择的质粒载体.表达型的质粒载体

41.重要的大肠杆菌质粒载体优点

（1）较小的分子量10kb以内DNA分子纯化过程中可避免断裂，pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的外源DNA

（2）较高的拷贝数经氯霉素扩培后达1000～3000copys/cell

（3）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。

插入失活（图解）

41.pUC质粒载体的优点:

.具有更小的分子量和更高的拷贝数;适用于组织化学方法检测重组体α-互补;.具有多克隆位点MCS区段

42．α-互补：

LacZ′基因编码的α-肽链是β-半乳糖苷酶的氨基末端的短片段，它同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生有功能活性的β-半乳糖苷酶分子。

于是便可以应用X-gal和IPTG显色技术检测转化子。

重组子为白斑，非重组子为蓝斑

43.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）:

是一类有人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活的质粒载体

44.质粒载体的稳定性问题：

（1）不稳定性类型；分离不稳定性；结构不稳定性

（2）影响稳定性主要因素；新陈代谢负荷；拷贝数差度

45.噬菌体的核酸;双链线性DNA（最常见）双链环形DNA.单链环形DNA.单链线性DNA.单链RNA

46.

（1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）

（2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）

47.温和噬菌体（temperatephage）：

既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体

溶源性细菌（lysogen）：

具有一套完整的噬菌体基因组的细菌

溶源化（lysogenization）：

用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌

原噬菌体（prophage）：

在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA。

超感染免疫性：

溶源性细菌不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体在感染，溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体再感染的特性，称为～。

48.λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因（OL,OR）之间的相互作用来决定的；如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源周期。

49..λ噬菌体载体构建依据

.λ噬菌体是一种温和噬菌体

.能承载较大的外源DNA片段λDNA头部可包装约36.4～51kb（自身的75%～105%），且约有20kbλDNA可缺失（生长非必需）

.在λDNA上有多种限制性内切酶位点

该载体主要有如下特点：

（1）筛选简便；

（2）可克隆的片段大，最大可达23kb，而质粒最大仅10kb左右；（3）转化效率高。

*λ噬菌体载体可分为：

插入型载体；替换型载体

注意：

λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能：

38kb~52kb。

体外包装：

λ噬菌载体+尾部蛋白+头部蛋白

50.单链DNA噬菌体载体：

优点：

.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形DNA为中间媒介的，复制形式的DNA（replicationformDNA，简称RFDNA）；.RFDNA和ssDNA，都能够转染感受态的大肠杆菌细胞;.单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多寡制约，即不存在包装限制的问题

;.应用这类单链DNA噬菌体，可以容易地测定出外源DNA片段的插入方向

;.可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子

51.粘粒载体（cosmid），又称柯斯质粒载体，或黏粒载体，是一类人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

特点：

.1具有λ噬菌体的特性.2具有质粒载体的特性.3具有高容量的克隆能力仅具有一个复制起点、1-2个选择记号和cos位点，分子量只有5-7kb，最大可容纳45kb的外源片段4具有与同源序列的质粒进行重组的能力

52.酵母人工染色体

1.原理

酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）

包含3个关键序列：

.自主复制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）ARS的功能是确保染色体在细胞周期中能够自我复制

.着丝粒DNA序列（centromereDNAsequence,CEN）确保复制的染色体能够平均分配到子细胞中

.端粒DNA序列（telomereDNAsequence，TEL）与端粒酶结合，完成染色体的末端复制

2.优缺点：

优点：

克隆容量大

缺点：

.片段大，稳定性差，不便操作.文库中的嵌合现象严重

嵌合现象（chimaerism）是指一个YAC克隆中的DNA片段来自两个或两个以上的染色体

.YAC内部有重排现象.缺失，使文库不完整;.YAC转化酵母的转化率并不十分理想;.YAC的分子结构与酵母的天然染色体的分子结构有一定的相似性，故从转化细胞中分离YAC时，不易与酵母染色体分开

53.细菌人工染色体:

BAC载体是基于细菌的性因子（F因子）质粒的一些特点构建的

缺点：

.BAC载体插入的片段一般为100-350kb，没有YAC大（100-1000kb）.BAC是通过电击法转化大肠杆菌，对大片段DNA有限制作用

优点：

在寄主细胞中具有相当的稳定性。

由于复制子来源于F因子，拷贝数低，遗传100代仍很稳定.BAC文库中几乎不存在嵌合现象.BAC电击转化效率比YAC高10-100倍.BAC以超螺旋形式存在于寄主中，而YAC为线性，便于操作.BAC文库筛选方便，可用菌落原位杂交

.BAC载体上的插入片段可以直接进行测序以获得末端序列

54.大肠杆菌表达体系

a）优越性：

.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；

.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；

.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；

.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。

b）大肠杆菌中表达体系的不足：

.真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。

.真核基因的转录信号同原核的不同。

细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。

55.最佳启动子具备的条件

第一必须是将启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上

第二这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件

第三这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。

（IPTG）

56.启动子封堵作用：

由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。

*转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。

57.转译起始序列5’-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。

mRNA转译终止必须存在终止密码子。

58.融合