青岛农业大学分子生物学实验考试.docx
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青岛农业大学分子生物学实验考试
实验一、大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
一、实验目的
1、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法
2、解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义，学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。
二、实验原理
1、感受态细胞的概念
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细菌中。
进入细菌细胞的质粒能够自主复制并在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
本实验使用的pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp），理论上只有转入了pUC19质粒的大肠杆菌才能在含Amp的培养基上生长。
但抗性筛选只是初步的筛选，可能仍有部分未转进质粒的细菌能在抗性培养基上生存（假阳性），因此尚需提取质粒酶切、电泳作进一步的鉴定。
三、实验材料、设备及试剂
1、实验材料
大肠杆菌单菌落液体培养物
2、实验设备及器具
1、低速冷冻离心机、超净工作台、50ml离心管、10ml刻度移液管、玻璃棒（三种器具均已经过灭菌处理）。
恒温水浴箱恒温摇床无菌离心管标记笔玻璃涂布器微量移液器
3、试剂及配置
0.1M氯化钙溶液（配制：
称取1.1g无水氯化钙，溶于90ml双蒸水中，定容至100ml,转移至试剂瓶中，121℃灭菌20min，保存。
75%乙醇
1．LB培养基
液体培养基：
蛋白胨（typtone） %（1g/100ml）
酵母提取物（Yeastextraction） %（0.5g/100ml）
氯化钠 %（1g/100ml）
PH
固体培养基：
100ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉
含氨苄青霉素（Amp）50mg/l的固体LB培养基LB液体培养基中加%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手时加入Amp铺培养皿。
pUC19质粒配制成约50ng/μl。
四、实验步骤
操作步骤
一.感受态细胞的制备（0.1MCaCl2方法）
1、从LB固体平板挑单克隆于5mlLB液体培养基中（不加抗生素），37℃×200rpm×12-16h，可过夜培养。
2、将活化菌体按1`～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为。
3、取培养好的菌液ml于一离心管中，4℃离心8000rpm×1min。
4、弃上清，加500ul0.1MCaCl2（灭菌预冷）洗菌体，4℃冷冻离心8000rpm×1min。
5、彻底除去残液,加200ul0.1MCaCl2（灭菌预冷），悬浮菌体。
6、冰浴静置30min，4℃冷冻离心8000rpm×1min。
7、弃上清，加100ul0.1MCaCl2（灭菌预冷），悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。
附注：
1、整个过程注意无菌操作和保持低温。
2、培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。
3、如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。
4、LB液体培养基建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查菌体是否污染。
5、D600值指细胞密度，用于判断培养物是否处于对数生长期。
OD600值在-时，此时培养物处于对数生长期，细胞数在20min内加倍。
二、质粒对大肠杆菌的转化
1、将连接产物加入100ul制备好的感受态细胞，冰上放置30min。
2、42℃热激90S。
3、迅速冰浴3min。
4、加入300ulLB液体培养基，37℃轻摇培养45min。
5、加入30ulX-gal和6ulIPTG,混匀。
6、取100ul涂布在含有50ug/ml氨苄的LB固体培养基中。
7、37℃倒置，避光培养16-20h。
8、蓝白斑筛选，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。
转化实验本应设置两个对照：
对照组1用来判断不加入质粒的大肠杆菌在抗性培养基上生长的状况，排除假阳性
对照组2用来判断制备成感受态后的大肠杆菌在普通培养基上的生长状况
五、计算转化率
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数（CFU）可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×涂板前离心管中菌液体积／涂板时所用菌液体积
转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量（mg）
转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
注意：
实验从第三步开始，整个实验过程都必须无菌操作！
五、思考题
1、用试剂瓶盛装的氯化钙在灭菌时应怎样操作
答：
可以高温高压灭菌，也可以过滤灭菌。
高温高压灭菌注意盖子不要盖得太紧。
2、步骤3和4中，对离心机应当做什么样的预处理
答：
由于整个实验都应在低温下进行，因此需要对离心机进行4℃的预冷。
3、实验为什么必须全程在无菌条件下操作
答：
防止杂菌和杂DNA的污染。
否则会影响转化效率或杂DNA的转入。
实验二质粒DNA的提取
目的
学习碱裂解法提取质粒的原理
原理
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。
它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。
质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。
现在常用的方法有：
碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。
实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。
其主要原理：
利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
试剂与器材
一、试剂
1、LB液体培养基：
胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至。
高压灭菌20min。
2、LB平板培养基：
在每1000mLLB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20min。
3、溶液Ⅰ：
50mmol/L葡萄糖,10mmol/LEDTA,25mmol/LTris-HCl。
4、溶液Ⅱ：
LNaOH,1%SDS。
（必须现配）
5、溶液Ⅲ：
的醋酸钾溶液（5mo1／L乙酸钾60mL，冰乙酸mL，水）。
6、TE缓冲液（pH）：
10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA。
7、无水乙醇和70%乙醇。
二、器材
1、Eppendorf管、离心管架
2、10，100，1000ul微量加样器
3、台式高速离心机
4、摇床、高压灭菌锅
5、大肠杆菌DH5α（含质粒）
操作步骤
一、培养细菌
将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃×24h，然后从平板上挑取单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃×12h。
二、提取步骤
1、将菌液移入离心管，8000rpm×1min，倒置于滤纸上，彻底除去残液。
2、加入100ul预冷的溶液Ⅰ，用涡旋震荡器充分悬浮菌体。
3、加入4ulRNase，室温×2min。
4、加入200ul溶液Ⅱ，快速颠倒，温和混匀，冰浴5min。
此时溶液应非常粘稠。
5、加入150ul预冷的溶液Ⅲ，温和混匀（此时应有可见沉淀），冰浴5min。
6、12000rpm×5min。
转移上清液至另一离心管中。
7、上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃×20min。
8、12000rpm×5min，彻底除去残液。
9、加入500ul70%乙醇洗DNA沉淀。
3000rpm×1min，彻底挥发除去乙醇。
10、加入40ulddH2O溶解DNA，待用。
（或用TE溶解，-20℃保存）。
实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度
一、实验目的：
1、了解紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理2、熟悉分光光度计的操作；3、计算DNA含量，学习核酸浓度的定量技术。
二、实验原理
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，在240~290nm的紫外波段有强烈的吸收峰，DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其吸光率（absorbance）以A260表示。
A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。
RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。
不同核苷酸有不同的吸收特性，所以可以用紫外分光光度计通过测定核酸溶液对光的吸收确定核酸的浓度和纯度。
但不能区分DNA与RNA的含量。
纯DNA的A260/A280应为，纯RNA应为。
样品中如果混杂有蛋白质或苯酚，A260/A280比值会明显降低。
通常在A260nm波长下，以1OD值相当于50μg／mL双螺旋DNA，或40μg／mL单链DNA（或RNA），或20μg／mL寡核苷酸加以计算。
此法操作简便，迅速。
但若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故为了测定准确应设法预先除去。
三、试剂与仪器设备：
DNA样品；灭菌双蒸水（ddH2O）
紫外分光光度计；狭缝石英比色杯；微量移液器、加样枪头
四、实验步骤
1、接通紫外分光光度计电源，使仪器处于紫外测定状态下预热20min；
2、调波长至所需，吸取1mlddH2O至石英杯中调节分光光度计零点；
3、倒掉ddH2O，在石英杯中加入已稀释好的DNA样品溶液，进行相应波长下的光吸收值的测定；
4、测定完毕，将石英杯中的样品溶液回收回指定的容器中；
5、用洗瓶洗涤石英杯，再重复2-4步骤进行第二个波长下的光吸收值的测定；
6、通过测定的260nm和280nm的OD值，计算A260/A280比率。
比率>说明DNA纯度较高；
7、计算样品的浓度
双链DNA浓度=50µg/ml×A260×稀释倍数
单链DNA浓度=33µg/ml×A260×稀释倍数
单链RAN浓度=40µg/ml×A260×稀释倍数
核酸总量=样品浓度×样品体积（ml）
五、实验结果分析
所测样品纯度，可能含有的杂质，样品DNA大致的浓度。
实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA
目的
学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。
原理
水平式琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测，其分辨效果比分光光度计法与溴化乙啶-标准浓度DNA比较法更高，更直接，检测DNA范围更广，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DAN发射的荧光，增强几十倍。
而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。
若用薄层分析扫描仪检测，则可精确地测得样品的浓度。
电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。
如肉眼观察，可检测到~的DNA。
在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。
质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可以该样品的分子量大小。
凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可鉴别分子量相同，但构型不同的DNA分子。
在抽提质粒的过程中，由于各种因素的影响，使得超螺旋共价闭环结构的DNA（SC）的一条链断裂，变成开环（OS）分子，如果两条链发生断裂，就变成线形分子（L）分子。
这三种构型的分子有不同的迁移率。
在一般情况下，超螺旋迁移速度最快，其次为线形分子，最慢的为开环分子。
当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA，在琼脂糖电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可以分析样品的纯度。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。
在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。
增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。
同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。
试剂与器材
一、试剂
1、DNA样品
2、TBE缓冲液（5×）：
用时需稀释10倍
3、点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：
%溴酚蓝，40%甘油
4、溴乙啶染色液（EB）：
10mg/ml溴乙啶注意：
该试剂具致癌作用，用时要小心。
5、琼脂糖
二、器材
1、电泳仪系统
2、紫外灯
3、恒温水浴箱
操作步骤
1．选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检测稳压电源与正负极的线路。
2．选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为~1.0mm。
3．制备琼脂糖凝胶：
按照被分离的DAN分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。
一般情况下可参考下表：
琼脂糖的含量（%）
g/ml
分离线状DNA分子的有限范围（kb）
60~5
20~1
10~
7~
6~
4~
3~
称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约40ml凝胶液，置微波炉中或水浴加
热，至琼脂糖融化均匀。
4．将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，在一端插好梳子。
待凝胶溶液冷却至60℃
左右时，在凝胶溶液中加EB（EB最终浓度为µg/ml），摇匀，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。
待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TBE缓冲液），然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。
注意：
电极缓冲液要高出凝胶面2-5㎜。
5．待测的DNA样品中，加入1/5体积的点样缓冲液，混匀后小心的进行点样，记录样
品点样顺序和点样量。
6．开启电源开关，最高电压不超过5V/cm。
7．电泳时间看实验的具体要求而异，在电泳中途可用紫外灯直接观察，DNA各条区带
分开后电泳结束。
一般20min—3h，取电泳凝胶块直接拍照。
实验三琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA
一、实验目的：
学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，了解质粒DNA电泳条带的多态性
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。
在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。
如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA（OpencircularDNA,简称ocDNA）；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA（LinearDNA）。
当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快，开环与线状分子的泳动亦有差异，于是在电泳时会产生三个条带的现象。
三、试剂与仪器设备：
1.质粒DNA
2.琼脂糖
3.6×载样buffer%二甲苯青FF，%溴酚蓝，30%甘油
4．50×TAE电泳Buffer12.2gTris，冰醋酸，10mlmol/LEDTA，加水至50ml。
5．溴化乙锭（EB）溶液10mg/ml（避光保存），每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液，即凝胶中EB终浓度为μg/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。
6.DNAMarker：
共6条带，2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
上样6ul时750bp的带约为100ng，其余带约为50ng
7．各种国产移液器（10，20，100μl）
8．消毒的tips枪头
9．水平电泳槽和电泳仪
四、实验步骤
1、胶液的制备：
称取0.4g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入50ml1×TAE稀释缓冲液,放电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为％琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
2、胶板的制备：
将有机玻璃胶槽两端分别用挡板隔出需要制胶的空间，将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封挡板内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。
倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。
待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入1×TAE缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4、加样：
取1μlDNA溶液与适量载样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。
质粒DNA加样完毕，选取一个未加样点样孔加入6ulDNAMarker。
注意每加完一个样品要更换tip枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、电泳：
加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。
控制电压保持在5V/cm。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2～1cm时,停止电泳。
6、染色：
未加EB的胶板在电泳完毕后移入μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。
7、观察：
在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板。
DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。
[注意]EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。
凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
五、实验结果分析
质粒DNA电泳条带的形态。
根据DNAmarker分析质粒DNA溶液大致的浓度。
六、思考题
1、电泳时所加电压值如何确定
答：
可根据DNA大小来确定，越大的电压可低点，避免拖尾现象；越小的电压可适当大一点缩短电泳时间，避免时间过长DNA扩散导致条带模糊。
2、就你的理解，DNAmarker的用途是什么
答：
分析DNA大小和浓度的依据。
3、电泳中用到两种buffer，各自的作用。
答：
上样缓冲液主要作用：
（1）螯合Mg2＋，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/l的EDTA。
（2）增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。
而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。
（3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。
电泳缓冲液的作用：
一是维持合适的pH；二是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移。
此外，电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。
4、如果质粒DNA电泳条带只有一条，说明提取的质粒质量高还是低，为什么
答：
质量高。
这说明产生只有超螺旋的正常质粒闭合环双链DNA。
实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
原理
限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。
因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。
用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象：
共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；
如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；
线状DNA，双链DNA断开成线状。
电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。
因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。
试剂与器材
一、试剂
1、EcoRⅠ酶
2、λDNA
3、TBE缓冲液（5×）：
用时需稀释10倍
4、点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：
%溴酚蓝，40%甘油
5、溴乙啶染色液（EB）：
10mg/ml溴乙啶注意：
该试剂具致癌作用，用时要小心。
6、琼脂糖
二、器材
1、电泳仪系统
2、紫外灯
3、恒温水浴箱
操作步骤
一、质粒DNA酶切
管号
①
质粒DNA
10
10
10
EcoRⅠ/ul
1
1
酶切Buffer（10×）/ul
2
2
2
ddH2O/ul
8
7
6
RNA酶
1
1、按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。
2、加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2h。
然后每个管中迅速加入2ulEDTA
终止反应。
二、琼脂糖凝胶电泳
1、琼脂糖凝胶的制备（1％）
称0.4g琼脂糖加40mlXTBE缓冲液,加热熔解。
冷却至60℃加2ulEB，混匀。
2、胶板制备
将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，然后倒入熔好的
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