PBS缓冲液的配方.docx

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PBS缓冲液的配方

PBS缓冲液的配方

发布日期:

2008-11-11热门指数:

865

PBS是最普遍不过的实验室缓冲液，但其配方各异。

以下是我的总结：

母液的配制：

0.2MNa2HPO4：

称取71.6gNa2HPO4-12H2O，溶于1000ml水

0.2MNaH2PO4：

称取31.2gNaH2PO4-2H2O，溶于1000ml水

各种浓度PB（pH=的配制：

先配0.2MPB（pH=，100ml）：

取19mlL的NaH2PO4，81mlL的Na2HPO4,即可。

然后只需将0.2MPB（pH=按相应比例适当稀释即可，如：

0.1MPB（PH=）：

取500ml0.2MPB，加水稀释至1000ml即可。

0.01MPB（PH=）：

取50ml0.2MPB，加水稀释至1000ml即可。

0.02MPB（PH=）：

取100ml0.2MPB，加水稀释至1000ml即可。

若需要NaCL的话，加入NaCL至%（g/100ml）即可。

另：

其它各种另PH值的0.2MPB（100ml）配方：

pH0.2MNaH2PO4（ml）0.2MNa2HPO4（ml）

928

9010

8515

5149

4555

3862

3367

2872

2377

19ml81ml

1684

1387

793

分子生物学常用溶液配制

发布日期:

2008-8-25热门指数:

3471

分子生物学常用溶液配制

一、分子生物学常用贮存液的配制

1．30%丙烯酰胺溶液

【配制方法】将29g丙烯酰胺和1gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。

加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。

用滤器（μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于，置棕色瓶中保存于室温。

【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。

称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。

一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman1号滤纸过滤以纯化之。

在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。

2．40%丙烯酰胺

【配制方法】把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。

继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。

【注意】见上述配制30%丙烯酰胺的说明,40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。

3．放线菌素D溶液

【配制方法】把20mg放线菌素D溶解于4ml100%乙醇中，1:

10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD440值。

放线菌素D（分子量为1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为，放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20℃。

【注意】放线菌素D是致畸剂和致癌剂,配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作,而不能在开放在实验桌面上进行,谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。

药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。

只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。

4．L腺苷三磷酸（ATP）溶液

【配制方法】在水中溶解60mgATP,用LNaOH调至pH值至，用蒸馏水定容1ml，分装成小份保存于-70℃

5．10mol/L乙酸酰溶液

【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。

6．10%过硫酸铵溶液

【配制方法】把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4℃保存数周。

7．BCIP溶液

【配制方法】把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃

8．2×BES缓冲盐溶液

【配制方法】用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6gNaCl和0.027gNa2HPO4，室温下用HCl调节该溶液的pH值至、然后加入蒸馏水定容至100ml，用μm滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20℃。

9．1mol/LCaCl2溶液

【配制方法】在200ml蒸馏水中溶解54gCaCl26H2O，用μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃。

【注意】制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml，用Nalgene滤器（μm孔径）过滤除菌，然后骤冷至0℃。

10．LCaCl2溶液

【配制方法】在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl26H2O，用μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

11．1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液

【配制方法】用20mlL乙酸钠溶液（）溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。

【注意】DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。

12．脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液

【配制方法】把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸取lTris碱分别调节每一dNTP溶液的pH值（用pH试纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP，分装成小份贮存于-70℃。

碱基波长（nm）消化系数（ε）[L/（molcm）]

A259×104

G253×104

C271×103

T260×103

比色杯光径为1cm时,吸光度=εM

13．lEDTA溶液

【配制方法】在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至（约需20gNaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。

【注意】EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近,才能完全溶解。

14．溴化乙锭（10mg/ml溶液）

【配制方法】在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。

【注意】小心：

溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。

15．2×HEPES缓冲盐溶液

【配制方法】用总量为90ml的蒸馏水溶解1.6gNaCl、0.074gKCl、0.027gNa2PO42H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用lNaOH调节pH值至，再用蒸馏水定容至100ml。

用μm滤器过滤除菌，分装成5ml小份，贮存于-20℃。

16．IPTG溶液

【配制方法】IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为），在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

17．1mol/L乙酸镁溶液

【配制方法】在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁，用水定容至1L过滤除菌。

18．1mol/LMgCl2溶液

【配制方法】在800ml水中溶解203.4gMgCl26H2O，用水定容至1L，分装成小份并高压灭菌备用。

【注意】MgCl2极易潮解，应选购小瓶（如100g）试剂，启用新瓶后勿长期存放。

19．β-巯基乙醇（BME）溶液

【配制方法】一般得到的是L溶液，应装在棕色瓶中保存于4℃。

【注意】BME或含有BME的溶液不能高压处理。

20．NBT溶液

【配制方法】把0.5g氯化氮蓝四唑溶解于10ml70%的二甲基甲酰胺中,保存于4℃。

21．酚/氯仿溶液

【配制方法】把酚和氯仿等体积混合后用LTrisHCl抽提几次以平衡这混合物,置棕色玻璃瓶中,上面覆盖等体积的lTrisHCl（pH=液层,保存于4℃。

【注意】酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。

所有操作均应在化学通风橱中进行。

与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。

22．10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液

【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20℃。

如有必要可配成浓度高达ml的贮存液（100mmol/L）。

【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。

一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。

凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。

PMSF在水溶液中不稳定。

应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。

PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。

pH值为时,20μmmol/lPMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>）并在室温放置数小时后,可安全地予以丢弃。

23．磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液

【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,用HCl调节溶液的pH值至加水定容至1L，在15lbf/in2（1034×105Pa）高压下蒸气灭菌20min。

保存于室温。

24．1mol/L乙酸钾（pH=）溶液

【配制方法】将9.82g乙酸钾溶解于90ml纯水中，用2mol/L乙酸调节pH值至后加入纯水定容到1L，保存于-20℃。

25．乙酸钾溶液（用于碱裂解）

【配制方法】在60ml5mol/L乙酸钾溶液中加入冰乙酸和水，即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度为5mol/L的溶液。

26．3mol/L乙酸钠（和）溶液

【配制方法】在80ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至或用稀乙酸调节pH值至，加水定容到1L，分装后高压灭菌。

27．5mol/LNaCl溶液

【配制方法】在800ml水中溶解292.2gNaCl加水定容至1L，分装后高压灭菌。

28．10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液

【配制方法】在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至，加水定容至1L，分装备用。

【注意】SDS的微细晶粒易扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%SDS溶液无须灭菌。

29．20×SSC溶液

【配制方法】在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/lNaOH溶液调节pH值至，加水定容至1L，分装后高压灭菌。

30．20×SSPE溶液

【配制方法】在800ml水中溶解17.5gNaCl、27.6gNaH2PO4H2O和7.4gEDTA,用NaOH溶液调节pH值至（约需10ml/LNaOH）,加水定容至1L,分装后高压灭菌。

31．100%三氯乙酸溶液

【配制方法】在装有500gTCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V）TCA。

32．1mol/LTris溶液

【配制方法】在800ml水中溶解121.91gTris碱,加入浓HCl调节pH值至所需值。

pHHCl70ml60ml42ml

应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值，加水定容至1L，分装后高压灭菌。

【注意】如1mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的Tris。

尽管多种类型的电极均不能准确测量Tris溶液的pH值，但仍可向大多数厂商购得合适的电极。

Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低个单位。

例如：

L的溶液在5℃、25℃、和37℃时的pH值分别为、和。

33．Tris缓冲盐溶液（TBS）（25mmol/lTris）

【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl和3gTris碱，加入0.015g酚并用HCl调至pH值至，用蒸馏水定容至1L，分装后在151bf/in2×105Pa）高压下蒸汽灭菌20min，于室温保存。

34．X-gal溶液

【配制方法】X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。

用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。

保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。

X-gal溶液无须过滤除菌。

二、常用抗生素溶液

抗生素贮存液a工作浓度

浓度保存条件严紧型质粒松弛型质粒

氨苄青霉素50mg/ml（溶于水）-20℃20μg/ml60μg/ml

羧苄青霉素50mg/ml（溶于水）-20℃20μg/ml60μg/ml

氯霉素34mg/ml（溶于乙醇）-20℃25μg/ml170μg/ml

卡那霉素10mg/ml（溶于水）-20℃10μg/ml50μg/ml

链霉素10mg/ml（溶于水）-20℃10μg/ml50μg/ml

四环素b5mg/ml（溶于乙醇）-20℃10μg/ml50μg/ml

a：

以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。

所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。

b：

镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培养基）。

三、常用的电泳缓冲液

缓冲液使用液浓贮存液（每升）

Tris-乙酸（TAE）1×：

LTris-乙酸50×：

242gTris碱

　LEDTA冰乙酸

　　100mlLEDTA

Tris-磷酸（TPE）1×:

LTris-磷酸10×:

10gTris碱

　LEDTA%磷酸（1.679g/ml）

　　40mlLEDTA

Tris-硼酸（TBE）a×LTris-硼酸5×：

54gTris碱

　LEDTA硼酸

　　20mlLEDTA

碱性缓冲液b1×:

50mmol/LNaOH1×:

5ml10mol/LNaOH

　1mmol/LEDTA2mlLEDTA

Tris-甘氨酸c1×:

25mmol/LTris5×:

15.1gTris

　250mmol/L甘氨酸94g苷氨酸（电泳级）（）

　%SDS50ml10%SDS（电泳级）

实验室常用技术参数资料

（二）

发布日期:

2003-11-1热门指数:

6468

二、常用缓冲液

　　1．分子克隆常用缓冲液

　　2．磷酸缓冲液

（1）25℃下L磷酸钾缓冲液的配制※

pH1mol/LK2HPO4（ml）1mol/LKH2PO4（ml）

（2）25℃下L磷酸钠缓冲液的配制※

pH1mol/LNa2HPO4（ml）1mol/LNaH2PO4（ml）

　　※:

用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml，根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值：

　　pH=pK’+1g（[质子受体]/[质子供体]）

　　在此，pK’=（25℃）。

　　3．电泳缓冲液

　　测序凝胶加样缓冲液

　　98%去离子甲酰胺

　　10mol/LEDTA

　　%二甲苯青FF

　　%溴酚蓝

　　甲酰胺：

许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。

不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与DowexXG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。

常用的电泳缓冲液

缓冲液使用液浓贮存液（每升）

Tris-乙酸（TAE）1×：

LTris-乙酸50×：

242gTris碱

　LEDTA冰乙酸

　　100mlLEDTA

Tris-磷酸（TPE）1×:

LTris-磷酸10×:

10gTris碱

　LEDTA%磷酸（1.679g/ml）

　　40mlLEDTA

Tris-硼酸（TBE）a×LTris-硼酸5×：

54gTris碱

　LEDTA硼酸

　　20mlLEDTA

碱性缓冲液b1×:

50mmol/LNaOH1×:

5ml10mol/LNaOH

　1mmol/LEDTA2mlLEDTA

Tris-甘氨酸c1×:

25mmol/LTris5×:

15.1gTris

　250mmol/L甘氨酸94g苷氨酸（电泳级）（）

　%SDS50ml10%SDS（电泳级）

　　说明：

　　①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。

　　以片都以1×TBE作为使用液（即1：

5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。

但×的使用液已具备足够的缓冲容量。

目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：

10稀释的贮存液作为使用液。

　　进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。

　　②碱性电泳缓冲液应现用现配。

　　③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

　　2×SDS凝胶加样缓冲液：

　　100mmol/LTrisHCl

　　200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）

　　4%SDS（电泳级）

　　%溴酚蓝

　　20%甘油

　　不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。

　　4．凝胶加样缓冲液

缓冲液类型6×缓冲液贮存温度

Ⅰ%溴酚蓝

4℃

%二甲苯青FF

40%（W/V）蔗糖水溶液

Ⅱ溴酚蓝

室温

%二甲苯青FF

15%聚蔗糖（Ficoll400）

Ⅲ%溴酚蓝

4℃

%二甲苯青FF

30%甘油水溶液

Ⅳ%溴酚蓝

4℃

40%（W/V）蔗糖水溶液

　碱性加样缓冲液:

300mmol/LNaOH

6mmol/LEDTA

Ⅴ18%聚蔗糖（Ficoll400）

4℃

%溴甲酚绿

%二甲苯青FF

　　使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：

增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。

溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的倍，而与琼脂糖浓度无关。

以×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。

在琼脂糖浓度为%～%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显着。

　　选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。

但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

　　5．各种pH值的Tris缓冲液的配制

各种pH值的Tris缓冲液的配制　

所需pH值（25℃）LHCl的体积

7．145．7

7．244．7

7．343．4

7．442．0

7．540．3

7．638．5

7．736．6

7．834．5

7．932．0

8．029．2

　　某一特定pH值的LTris缓冲液的配制：

将50mlLTris碱溶液与上表所示相应体积（单位：

ml）的LHCl混合，加水将体积调至100ml

（2）温度对50mmol/LTrisHCl液pH值的影响

4℃25℃37℃

8．17．57．2

8．27．67．3

8．37．77．4

8．47．87．5

8．57．97．6

8．68．07．7

8．78．17．8

8．88．27．9

8．98．38．0

9．08．48．1

9．18．58．2

9．28．68．3

9．38．78．4

9．48．88．5

　　（6）常用缓冲液的pKa值

缓冲液分子量pKa值缓冲范围

Trisa～

HEPESb～

MPOSc～

PIPESd～

MESe～

　　a：

三羟甲基氨基甲烷；b：

N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：

3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：

N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：

2-（N-吗啉代）乙磺酸。

　　7．温度对常用缓冲液pH的影响

缓冲体系pKa（20℃）△pKa/10℃

Mes

Ada

PiPes

Aces

Bes

Mops

Tes

Hepes

Tricine

Tris

Bicine

Glycylglycine

　　三、常用酶的配制

　　1．溶菌酶

　　用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20℃。

每一小份一经使用后便予丢弃。

　　2．蛋白水解酶类

　贮存液贮存温度反应浓度反应缓冲液温度预处理

　LTris　

链霉蛋白酶a20mg/ml-20℃（溶于水）1mg/mlLEDTA37℃自消化b

　%SDS　

　LTris　

蛋白酶Kc20mg/ml-20℃（溶于水）50μg/mlLEDTA37～56℃无须预处理

　%SDS　

　　a：

链霉蛋白酶是从链球菌（Streptomycesgriseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。

　　b：

自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：

把该酶的粉末溶解于10mmol./lTrisHCl、10mmol/lNaCl中，配成20mg/ml浓度，于37℃温育1h。

经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20℃。

　　c：

蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（TritirachiumalbumLimber）中纯化得到。

该酶有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。

然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。

所以，蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA（以抑制依赖于Mg2+的核酸酶的作用）。

但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/lCa2+而不含EDTA的缓冲液。

在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT（）至终浓度为2mmol/L,以鳌合Ca2+。

　　3．无DNA酶的RNA酶

　　将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/lTrisHCl、15mmol/lNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

　　四、常用抗生素溶液