洋甘菊纯露的成分分析及抑菌研究.docx

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洋甘菊纯露的成分分析及抑菌研究

本科生毕业论文（设计）

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德国洋甘菊纯露的成分分析及抑菌活性研究

摘要：

洋甘菊纯露，指在提炼洋甘菊精油的过程中，从新鲜花瓣里分离出的饱和溶液。

目的以德国洋甘菊为主要研究对象，采用蒸馏法、琼脂扩散法和稀释法等对洋甘菊纯露的抑菌效果进行研究，并且采用气相色谱-质谱联用技术测定分析德国洋甘菊纯露成分。

结果从德国洋甘菊纯露中鉴定出65个挥发性化合物，其中酯类和醇类含量较高。

关键词：

德国洋甘菊；精油成分分析；GC-MS分析

Studyoncompositionanalysisandbacteriostasisofchamomileextract

Abstract:

ChamomileHydrosolisasaturatedsolutionseparatedfromfreshpetalsintheprocessofrefiningchamomileessentialoil.ObjectiveTakingGermanchamomileasthemainresearchobject,usingdistillation,agardiffusionanddilutionmethodstostudytheantibacterialeffectofchamomilepuredew,andusinggaschromatography-massspectrometrytodetermineandanalyzethecomponentsofGermanchamomilepuredew.Results65volatilecompoundswereidentifiedfromGermanChamomilePureDew,amongwhichestersandalcoholswerehigherincontent.

Keywords:

Germanchamomile;essentialoilcompositionanalysis;GC-MSanalysis

德国洋甘菊，属于菊科中的母菊，高度在0.4m上下，直径在6mm左右，原产欧洲[1]。

与罗马洋甘菊和摩洛哥甘菊不同，德国洋甘菊的味道带有稻草般的清香，常应用于药品中[2]。

德国洋甘菊具有良好的药理作用，在临床上被广泛的应用，可用于治疗眼病，具有镇静、止痛和消炎的功效[3]，也可用作保健品。

德国洋甘菊精油是油状的液体，颜色呈深蓝色，有消除炎症、舒缓皮肤敏感和缓解关节疼痛的作用。

德国洋甘菊纯露是萃取精油的过程中而留下的水，含有德国洋甘菊的水溶性成分和少量的精油分子。

德国洋甘菊中的辛酮糖酸具有抗炎的功效，黄酮苷类能够为高血糖患者有效地降低血糖[4]。

而对于德国洋甘菊在不同溶剂下的提取物，正丁醇提取物能够用于哮喘病患者的临床治疗中，乙酸乙酯提取物能够诱导乳腺癌细胞线粒体凋亡，水提取物能够对常见菌群产生抑菌作用，乙醇提取物可以使受到创伤的伤口快速愈合[5]。

通过大量文献调研发现，德国洋甘菊纯露相关研究很少。

植物纯露，即精油在蒸馏萃取中所留下的蒸馏水，成分包括有机酸、黄酮类、多糖类和植物纤维等，其中的少数纯露还有0.1-0.5%的精油成分[6]。

就德国洋甘菊纯露来看，它具有舒缓、抗菌和抗敏的作用，可以被当做爽肤水和面膜等的主要成分。

另外，多数纯露呈现弱酸性，因此可以用来调节皮肤的PH值，从而帮助调节皮肤状态。

相关研究表明，菊科类植物的纯露还具有快速止血的功能[7]。

因此，本课题采用水蒸气蒸馏法提取德国洋甘菊纯露，利用气相色谱-质谱（GASCHROMATOGRAPHY-MASSSPECTROMETRY，GC-MS）技术对纯露的化学成分进行分析鉴定，并对德国洋甘菊抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌和大肠杆菌的效果进行分析，了解其抑菌活性，为德国洋甘菊的深入开发提供参考依据。

早期，对于植物精油化学成分的研究仅局限于几个含量较高的成分，伴随科技手段的提升，科研学者们对植物精油化学成为的研究日益深入。

在这一背景下，有的植物精油甚至能检测出上百个化学成分。

其中最常用的实验研究方法就是GC-MS分析法[8]。

GC-MS分析法是成分定性和定量分析的常用方法，它所需的检测时间较短，可应用于检测的物质也比较广泛。

运用GC-MS分析法的实验，通常是在样本处理前进样分析，之后在气相色谱数据处理机中用面积归一化法测得各个组分的百分比含量，再用GC-MS总离子流色谱检测获得总离子流图，在计算机质谱数据库检索后，得出化合物的名称。

抑菌实验主要是利用滤纸片法、打孔法和牛津杯法等。

沈珺莲[9]利用水蒸气蒸馏法提取腺叶桂樱精油后，对精油的成分进行分析，再利用生长速率法测试精油的抑菌活性。

楚秉泉等[10]对山苍子精油的抑菌效果展开研究，结果发现不同浓度的山苍子精油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用。

SoumayaHajaj等[11]以酵母菌和根霉菌为研究对象，通过滤纸片法，用罗勒精油、松红梅精油薰衣草精油等分别对菌落的抑制效果展开研究，最终的实验结果表明松红梅精油对酵母菌和根霉菌的抑制效果最好。

HajajiSoumaya等[12]对枳壳、麸炒枳壳、吴茱萸、车前子和黄栀子五种中药纯露的抑菌效果进行研究，通过滤纸片法得出不同纯露的抑菌活性，最终发现这种纯露均有这良好的抑菌效果，其中枳壳和麸炒枳壳对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果最明显。

1仪器与材料

1.1微生物菌种

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌和大肠杆菌由实验室提供。

1.2仪器

仪器名称

仪器型号

生产厂家

单道可调移液器

Genex移液器

宝予德（中国）有限公司

超声波清洗器

KQ2200B型

昆山市超声仪器有限公司

紫外光可见光光度计

UV-1200型

上海美谱达仪器有限公司

旋转蒸发器

RE-52型

上海亚荣生化仪器厂

电热恒温培养箱

DNP-9052A型

上海冠戈实业有限公司

立式压力蒸汽灭菌器筒

BL-50A型

上海东亚压力容器制造有限公司

立式压力蒸汽灭菌器

YXQ-LS-50SH型

上海博迅实业有限公司医疗设备厂

智城恒温培养振荡器

ZWY-200D型

上海智城分析仪器制造有限公司

循环水式多用真空泵

SHB-lll型

郑州长城科工贸有限公司

净化工作台

SW-CJ-LFD型

上海博迅实业有限公司医疗设备厂

调温电热套

DZTW型

北京市永光明医疗仪器有限公司

电子天平

/

赛多利斯科学仪器有限公司

1.3材料

试验材料名称

型号（浓度）

生产厂家

蛋白胨生物试剂

01-001

北京奥博星生物技术有限责任公司

氧化钠（Nacl）

99.5%

天津市福晨化学试剂场

酵母浸粉生物试剂

01-012

北京奥博星生物技术有限责任公司

琼脂粉生物试剂

01-023

北京奥博星生物技术有限责任公司

氢氧化钠

相对分子质量：

40.00

天津市致远化学试剂有限公司

（原天津市化学试剂六厂三分厂）

2实验方法

2.1纯露提取

取300g干燥后的德国洋甘菊全花，置入5L圆底烧瓶中。

向烧瓶中加入3000mL蒸水完全浸泡洋甘菊样品24h，采用水蒸气蒸馏法进行提取。

溶液沸腾后加热4h，即得德国洋甘菊挥发油和纯露，用无水硫酸钠干燥后，低温避光保存在棕色瓶中，备用。

按照料液比1:

12，准备好德国洋甘菊，并取适量的干燥花朵，浸泡24h，水蒸气蒸馏法提取4h。

之后，可以得到德国洋甘菊的挥发油，而经由水蒸气蒸馏法流出的无色透明液体就是德国洋甘菊纯露[13]。

2.2纯露成分分析预实验

将大孔树脂浸泡在99%乙醇中，在经过乙醇的三次洗脱处理后，蒸馏水洗脱到层析柱流出的液体不带有酒精气味。

德国洋甘菊纯露上样层析柱中，调成最小流速，并向柱中加入洗脱剂二氯甲烷，将柱下旋钮调到关闭状态，进行混合，静置30min后得到混合溶液，取二氯甲烷层，向层析柱加入洗脱剂乙醚，再将收集到的液体和二氯甲烷层合并，在进行干燥处理后即得[14]。

2.3气质联用检测条件

取0.5ml的浓缩德国洋甘菊纯露，加入正已烷5mL，混合均匀后在0.22

有机相滤膜过滤。

色谱柱：

弹性石英毛细管柱；

柱流速：

1.0ml/min；

进样口温度：

240℃；

进样方式：

分流进样，分流比100:

1，进样量0.3

；

升温程序：

起始温度为60℃保持3min，以5℃/min的速率程序升温至270℃，保持5min。

电离方式：

EI

电离能量：

70eV

离子源发生器温度：

230℃

进样口温度：

300℃

辅助加热器温度：

280℃

质量扫描范围：

40-800amu

溶剂延迟：

3min

2.4抑菌活性检测方法

将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌和大肠杆菌接种到斜面培养基上活化，在2-3次后把细菌接种到LB液体培养基中，接着将其放入到恒温培养箱中生长数期，把四种菌种均匀涂在LB平板上，在37℃的温度下培养24h，并将菌液浓度稀释到0.5麦氏比浊管浊度[15]。

把菌液稀释成100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.562%和0.781%八个梯度浓度，将八种浓度菌液分别与10

德国洋甘菊纯露混合，分别作为1-8号试管。

9号试管为10

德国洋甘菊纯露，不含菌液的培养液，10号试管为0.1ML菌液，不含德国洋甘菊纯露的培养液，这两组为对照组。

接着，在37°C的摇床培养24h。

培养过后用肉眼观察各个试管，试管中培养液澄清臼浓度即为最小抑制浓度（MIC）。

3结果与分析

3.1纯露提取率

表3-1德国洋甘菊纯露提取率

材料

药材质量（g）

挥发油体积（ml）

提取率（%）

德国洋甘菊

300g

1.50

0.50

3.2纯露成分分析

3.2.1Molish反应

本实验通过Molish反应对德国洋甘菊纯露的成分进行分析，得出结果如下所示：

图3-1检验现象

左：

纯露

右:

在两相交界面出现白环（a-萘酚用苯酚代替。

molish反应本身应该出现紫色环，但a-萘酚用苯酚代替则会出现两相交界面白环。

）说明纯露中含有多糖

3.2.2三氯化铝反应

本实验通过三氯化铝反应对德国洋甘菊纯露的成分进行分析，得出结果如下所示：

图3-3检验现象

左：

纯露

右：

三氯化铝反应无明显现象，不含有黄酮类化合物

3.2.3三氯化铁反应

本实验通过三氯化铁反应对德国洋甘菊纯露的成分进行分析，得出结果如下所示：

图3-5检验现象

左：

纯露

右：

三氯化铁反应显黑色，说明纯露中含有酚酸

3.3纯露成分

表3-2纯露所检测出的物质

编号

保留时间

化合物名称

分子式

分子量

CAS码

匹配度

总量（%）

1

3.265

2-Buten-1-ol,2-methyl-

C5H10O

86.073165

4675-87-0

861

0.203

2

4.467

1-Pentanol,3-methyl-

C6H14O

102.104465

589-35-5

899

0.296

3

4.712

Butanoicacid,2-hexenylester,（Z）-

C10H18O2

170.13068

56922-77-1

757

0.129

4

6.083

Propanoicacid,2-methyl-,2-methylpropylester

C8H16O2

144.115029

97-85-8

892

1.326

5

6.297

2-Buten-1-ol,3-methyl-,acetate

C7H12O2

128.08373

1191-16-8

884

1.016

6

6.514

Butane,2-bromo-2-methyl-

C5H11Br

150.004412

507-36-8

862

1.433

7

6.655

α-Pinene

C10H16

136.1252

80-56-8

942

2.271

8

6.743

2-Propenoicacid,2-methyl-,2-methylpropylester

C8H14O2

142.09938

97-86-9

889

1.199

9

7.062

Camphene

C10H16

136.1252

79-92-5

858

0.122

10

7.189

3-Methyl-3-nitrobut-1-ene

C5H9NO2

115.0633287

1809-67-2

801

2.249

11

7.838

β-Pinene

C10H16

136.1252

127-91-3

882

0.323

12

7.940

Aceticacid,3-methylpentylester

C8H16O2

144.115029

856

0.201

13

8.285

2-Butenoicacid,2-methyl-

C5H8O2

100.0524297

13201-46-2

811

0.637

14

8.539

Butanoicacid,2-methyl-,2-methylpropylester

C9H18O2

158.13068

2445-67-2

896

0.683

15

8.635

Isobutylisovalerate

C9H18O2

158.13068

589-59-3

810

0.192

16

8.819

Propanoicacid,2-methyl-,3-methylbutylester

C9H18O2

158.13068

2050-1-3

894

0.440

17

9.002

2-Butanone,3,3-dimethyl-1-thiocyanato-

C7H11NOS

157.056135

57518-71-5

819

0.429

18

9.088

Hexanoicacid,2-oxo-,methylester

C7H12O3

144.078644

6395-83-1

771

0.126

19

9.235

Butanoicacid,2-pentenylester,（Z）-

C9H16O2

156.115029

42125-13-3

779

0.142

20

9.658

Cyclopropanecarboxylicacid,3-methylbutylester

C9H16O2

156.115029

860

0.996

21

9.710

2-Propenoicacid,2-methyl-,pentylester

C9H16O2

156.115029

2849-98-1

844

1.359

22

9.996

2-Butenoicacid,3-methyl-,butylester

C9H16O2

156.115029

54056-51-8

815

8.186

23

10.064

2,4-Dimethyl-1-penten-3-ol

C7H14O

114.104465

19781-54-5

816

0.085

24

10.167

2-Buten-1-ol,3-methyl-,acetate

C7H12O2

128.08373

1191-16-8

829

2.199

25

10.459

1-Octyn-3-ol

C8H14O

126.104465

818-72-4

726

14.387

26

10.527

Butane,2-bromo-2-methyl-

C5H11Br

150.004412

507-36-8

800

0.085

27

10.652

Propanoicacid,hexyleste

C9H18O2

158.13068

2445-76-3

801

0.091

28

11.002

2-Butene,1-bromo-3-methyl-

C5H9Br

147.988762

870-63-3

786

1.702

29

11.129

2-Butenoicacid,2-methyl-

C5H8O2

100.0524297

13201-46-2

804

0.311

30

11.420

Bicyclo[3.1.1]heptan-3-ol,2,6,6-trimethyl-,（1α,2β,3α,5α）-

C10H18O

154.135765

27779-29-9

717

0.335

31

11.539

Butanoicacid,2-methyl-,2-methylbutylester

C10H20O2

172.14633

2445-78-5

828

0.721

32

11.710

Hexanoicacid,2-methylpropylester

C10H20O2

172.14633

105-79-3

777

0.401

33

11.904

Propanoicacid,2-methyl-,hexylester

C10H20O2

172.14633

2349-7-7

809

1.191

34

12.167

Hexanoicacid,2-propenylester

C9H16O2

156.115029

123-68-2

780

0.112

35

12.375

1-Butanol,2,3-dimethyl-

C6H14O

102.104465

19550-30-2

796

0.144

36

12.642

Bicyclo[3.1.1]heptan-3-ol,6,6-dimethyl-2-methylene-,[1S-（1α,3α,5α）]-

C10H16O

152.120115

547-61-5

887

8.329

37

12.770

2-Propenoicacid,2-methyl-,hexylester

C10H18O2

170.13068

142-09-6

842

2.975

38

13.023

2-Butenoicacid,3-methyl-,pentylester

C10H18O2

170.13068

56922-72-6

820

6.455

39

13.139

Bicyclo[3.2.0]heptan-3-ol,2-methylene-6,6-dimethyl-

C10H16O

152.120115

828

0.136

40

13.249

Cyclohexane,nitro-

C6H11NO2

129.078979

1122-60-7

796

0.528

41

13.347

Pinocarvone

C10H14O

150.1044655

30460-92-5

793

5.378

42

13.420

Isoborneol

C10H18O

154.135765

124-76-5

796

0.197

43

13.515

3-Hexen-1-ol,（E）-

C6H12O

100.088815

928-97-2

835

0.157

44

13.668

Bicyclo[3.1.1]heptan-3-one,2,6,6-trimethyl-,（1α,2β,5α）-

C10H16O

152.120115

15358-88-0

853

0.208

45

13.750

2-Nitrohept-2-en-1-ol

C7H13NO3

159.089543

104313-51-1

719

0.215

46

13.984

2-Butenoicacid,3-methyl-,pentylester

C10H18O2

170.13068

56922-72-6

777

0.131

47

14.197

3-Methyl-2-butenoicacid,3-methylbut-2-enylester

C10H16O2

168.115029

789

4.135

48

14.296

（-）-Myrtenol

C10H16O

152.120115

19894-97-4

885

1.190

49

14.468

2,2-Dimethylpropionicacid,4-methylpentylester

C11H22O2

186.16198

150588-62-8

838

0.493

50

15.563

2-Hydroxy-2-methyl-but-3-enyl2-methyl-2（Z）-butenoate

C10H16O3

184.109944

80758-67-4

869

1.544

51

15.885

3-Methyl-2-butenoicacid,4-methylpentylester

C11H20O2

184.14633

789

11.091

52

16.590

（Z）-Hex-3-enyl（E）-2-methylbut-2-enoate

C11H18O2

182.13068

822

0.692

53

16.671

Isopentyl3-hydroxy-2-methylenebutanoate

C10H18O3

186.125594

80758-69-6

780

0.106

54

16.743

3-Methyl-2-butenoicacid,pentadecylester

C20H38O2

310.28718

785

0.124

55

17.110

3-Methyl-2-butenoicacid,4-methylpentylester

C11H20O2

184.14633

687

0.128

56

17.384

Bicyclo[3.1.1]heptan-3-ol,6,6-dimethyl-2-methylene-,[1S-（1α,3α,5α）]-

C10H16O

152.120115

547-61-5

783

0.097

57

18.069

4-Nonene,5-nitro-

C9H17NO2

171.125929

6065-1-6

690

0.190

58

18.711

Phenol,2-methoxy-4-（1-propenyl）-

C10H12O2

16