微生物的培养与应用.docx
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微生物的培养与应用
微生物的培养与应用
[考纲要求]
1.微生物的分离和培养B
2.某种微生物数量的测定B （新增）
3.微生物的应用B（新增）
[夯实基础]
一、微生物的实验室培养
1．培养基
（1）概念：
人们按照微生物对的不同需求，配制出供其的营养基质。
（2）营养构成：
一般都含有水、、氮源和无机盐。
此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及的要求。
（3）种类：
按照物理性质可分为培养基、半固体培养基和培养基。
2．无菌技术[连一连]
3．大肠杆菌的纯化培养
（1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
配制步骤：
计算→→溶化→→倒平板。
（2）纯化大肠杆菌
①纯化大肠杆菌，其关键的步骤是接种。
②纯化培养方法：
法和法。
③纯化培养原理：
在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的，即可获得较纯的菌种。
二、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1．分离原理
土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们能合成，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起作用。
以尿素为唯一氮源的培养基能促进分解尿素的细菌的生长和繁殖，并抑制或阻止其他微生物的生长，从而将目的菌分离。
2．统计菌落数目
统计样品中的活菌一般用。
3．实验流程
土壤取样→制备→微生物的培养与观察→细菌的计数。
三、分解纤维素的微生物的分离
1．纤维素酶
（1）组成：
纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
（2）作用
2．菌种筛选
（1）方法：
。
（2）原理
即：
使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据来筛选纤维素分解菌。
3．筛选流程
土壤取样：
富含的环境
↓
选择培养：
用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量
↓
梯度稀释
↓
涂布平板：
将样品涂布于含CR的鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落：
产生的菌落周围出现透明圈
知识速背
1．培养基
（1）培养基的概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
（2）培养基的营养成分：
培养基可为微生物提供碳源、氮源、无机盐和水等主要营养物质。
2．无菌技术
（1）措施：
无菌技术的主要措施包括消毒和灭菌。
（2）常用方法：
培养基灭菌常采用高压蒸汽灭菌法，接种环灭菌常采用灼烧灭菌法。
3．微生物的纯化与计数
（1）纯化微生物的方法：
常用平板划线法和稀释涂布平板法。
（2）微生物的计数方法：
常用显微计数法和稀释涂布平板法。
4．微生物的筛选
（1）尿素分解菌的筛选：
以尿素为唯一氮源的选择培养基可以筛选分解尿素的细菌。
（2）尿素分解菌的鉴别：
在以尿素为唯一氮源的选择培养基中添加酚红，指示剂可以鉴别分解尿素的细菌。
（3）纤维素分解菌的筛选：
利用富含纤维素的选择培养基可以选择培养分解纤维素的微生物。
（4）纤维素分解菌的鉴别：
在富含纤维素的培养基中添加刚果红，可以从周围存在不变红的透明圈的菌落中挑选分解纤维素的微生物。
[要点讲解]
考点一 培养基及微生物的纯化培养技术
1．培养基的种类
（1）按物理状态分类
培养基种类
特点
用途
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
固体培养基
加凝固剂（如琼脂）
微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
（2）按功能分类
种类
制备方法
原理
用途
举例
选择
培养基
培养基中加入某些化学物质
依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计
从众多微生物中分离所需的微生物
加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别
培养基
培养基中加入某种指示剂或化学药品
产生特定的颜色或其他变化
鉴别不同种类的微生物
用伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌
2．消毒和灭菌的比较
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属工具
高压蒸汽
灭菌法
培养基及容器的灭菌
3.纯化微生物的接种方法
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
原理
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基上。
在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落
优点
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
可以计数，可以观察菌落特征
缺点
不能计数
吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用
范围
适用于好氧菌
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
4．平板划线操作的注意事项
（1）操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
（2）灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
（3）第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（4）划线时最后一区不要与第一区相连。
（5）划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
[典型例题]
1．下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是（ ）
原料
①
②
③
④
蛋白胨/g
10
10
10
10
乳糖/g
5
5
5
5
蔗糖/g
5
5
5
5
KH2PO4/g
2
2
2
2
伊红/g
0.4
美蓝/g
0.065
琼脂/g
10
20
NaCl/g
20
蒸馏水/mL
1000
1000
1000
1000
A．①③ B．②①
C．②④D．③①
2．不同的微生物对营养物质的需要各不相同。
下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述，不正确的是（ ）
A．氮源物质为该微生物提供必要的氮素
B．碳源物质也是该微生物的能源物质
C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
D．水是该微生物的营养要素之一
3．下列有关微生物实验的叙述，不正确的是（ ）
A．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染
B．平板划线法可用于微生物的计数
C．分离不同的微生物要采用不同的稀释度
D．观察菌落的特征可以用来进行菌种的鉴定
答案:
DBB
考点二 微生物的分离与计数法
1．筛选菌株
（1）原则：
人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
（2）菌株筛选原理的比较
土壤中分解尿
素的细菌
分解纤维素的微生物
选择培养基的成分
尿素作为唯一的氮源
纤维素作为唯一的碳源
鉴定方法
在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素
刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
2．几种典型微生物的筛选方法
（1）培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。
（2）培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。
（3）培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物。
（4）当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。
如当石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。
（5）改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养，只能得到耐高温的微生物。
3．统计菌落数目的方法
（1）显微镜直接计数法
①原理：
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
②方法：
用计数板计数。
③缺点：
不能区分死菌与活菌。
（2）间接计数法（活菌计数法）
①原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：
每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
③操作：
设置重复组，增强实验的说服力与准确性。
同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
[典型例题]
1．科研人员从被石油污染的土壤中分离获得能降解石油成分“多环芳烃菲”的菌株Q，步骤如下图所示，下列相关的叙述中，错误的是（ ）
A．步骤①～③中，培养液中需加入多环芳烃菲作为唯一碳源
B．步骤①～③中，将锥形瓶放在摇床上充分振荡，使菌株与培养液充分接触
C．步骤④是利用平板划线法纯化菌株Q，图中所示接种环最少灼烧2次
D．步骤④中每一区域可重复画几次，但1区和5区不能出现交叉
2．尿素是一种重要的农业肥料，但是不经过细菌的分解，就不能更好地被植物利用。
生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌），培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示，请回答下列问题：
KH2PO4
1.4g
Na2HPO4
2.1g
MgSO4·7H2O
0.2g
葡萄糖
10g
尿素
1g
琼脂
15g
将上述物质溶解后，用自来水定容到1000mL
（1）此培养基能否用于植物组织培养？
________，理由是
________________________________________________________________________。
（2）培养基中氮源是________，这种培养基在功能上属于________培养基，目的是只允许能合成________的微生物生长，其他微生物均不能生长。
（3）欲从土壤中分离获取上述特定微生物，可采用__________________________________法进行接种。
（4）在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________________________________________，
使指示剂变红色，而筛选纤维素分解菌的方法是__________________法。
3．下图表示从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。
下列与该实验相关内容的叙述中，不正确的是（ ）
A．实验中所用的培养基①②③④均属于选择培养基
B．图中Ⅰ、Ⅱ过程实现了对目标微生物的稀释
C．统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数
D．在⑤处培养基上形成菌落的微生物同化作用类型为异养型
4．饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。
若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸收利用的磷酸盐等。
以下是科研人员从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株的过程示意图。
请分析回答下列问题：
（1）培养基中除了添加植酸钙以外，还应含有________、________、水、无机盐等基本营养物质。
（2）为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿等进行________________，而且须将接种后的培养皿呈________状态放置。
（3）接种以前进行的一系列操作，目的是在培养皿表面形成________________。
根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的________就能大致推测出样品中的活菌数。
（4）由于植酸钙的不溶解性，使培养基中形成白色浑浊。
产植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产植酸酶。
实验结果显示A～E五种菌株中，________是产植酸酶的理想菌株。
（5）获得目的菌以后，若要用于植酸酶的生产，还需要进行____________________________。
答案：
1.C2.
（1）不能 缺少植物激素
（2）尿素 选择 脲酶
（3）稀释涂布平板法或平板划线
（4）酚红指示剂 刚果红染色
3.B
4.答案：
（1）碳源 氮源
（2）（高压蒸汽）灭菌 倒置（3）单个菌落 菌落数（4）E（5）扩大培养
[习题强化]
1．（2015·高考江苏卷）人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。
为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。
请回答下列问题：
（1）在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是________（填序号）。
①酒精灯 ②培养皿 ③显微镜 ④无菌水
（2）在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（3）向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是________________________________________________________________________
____________________。
（4）刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落（见图）。
图中降解圈大小与纤维素酶的________有关。
图中降解纤维素能力最强的菌株是________（填图中序号）。
（5）研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株________更适合用于人工瘤胃发酵，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
2．牛奶是微生物生长的良好培养基。
生鲜牛奶中的微生物情况反映了奶牛的健康状况，也影响奶制品的运输和贮藏。
牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物。
为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图所示操作。
用无菌吸管从锥形瓶中吸取1mL生牛奶稀释液至盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。
请回答下列有关问题：
（1）微生物培养操作过程中，为了防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行________（消毒、灭菌），操作者双手要进行清洗和________。
除巴氏消毒外，还有____________和化学试剂消毒法。
（2）取最终的牛奶稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布，选择的涂布工具称为________，为防止杂菌污染，该工具应浸泡于酒精中，涂布前应________________________________________________________________________。
（3）图中所示方法为稀释培养法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。
若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为________个。
运用这种方法统计的结果往往较实际值________（填“偏大”或“偏小”），原因是___________________________________________________。
3．如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：
（1）图甲是利用________________法进行微生物接种，图乙是利用________________法进行微生物接种。
这两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是________________和酒精消毒。
（2）接种操作为什么一定要在火焰附近进行？
_________________________________________________________________________。
（3）接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？
________________________________________________________________________。
（4）如图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是________（填图甲或图乙）。
4．耐高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。
研究者从热泉中筛选了高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图所示。
（1）进行①过程的目的是________；②过程所使用的接种方法是________________法。
（2）从用途上来说，Ⅰ号培养基属于________培养基，仅以淀粉作为________源；从物理状态上来说，Ⅱ号培养基属于固体培养基，配制时应加入________作为凝固剂。
（3）Ⅰ、Ⅱ号培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是________________；一般对配制的培养基采用________________法灭菌。
（4）部分嗜热菌在
号培养基上生长时可释放________分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈；应挑出透明圈______（大或小）的菌落，接种到Ⅱ号培养基。
微生物的培养与应用答案
一、微生物的实验室培养
营养物质,生长繁殖,碳源,氧气,液体,固体,称量,灭菌,平板划线,稀释涂布平板,菌落
二、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
脲酶，催化，稀释涂布平板法，培养基
三、分解纤维素的微生物的分离
刚果红染色法，是否产生透明圈，纤维素，纤维素酶
[习题强化]
答案1.
（1）③
（2）培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果 （3）避免培养基污染棉塞 （4）量与活性 ① （5）J4 发酵过程会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高
2.
（1）灭菌 消毒 煮沸消毒法
（2）涂布器 将涂布器引燃（灼烧）后待冷却
（3）3.4×106 偏小 当两个或多个菌落重叠在一起时按一个菌落计算
3.
（1）平板划线 稀释涂布平板 接种环 涂布器 灼烧灭菌
（2）火焰附近存在着无菌区域 （3）避免培养过程产生的水分影响微生物的生长 （4）图乙
4.
（1）稀释 稀释涂布平板
（2）选择 （唯一）碳 琼脂 （3）先调节pH，后灭菌 高压蒸汽灭菌 （4）淀粉酶 大
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