哺乳动物基因组DNA的提取Southern杂交.docx

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哺乳动物基因组DNA的提取Southern杂交

哺乳动物基因组DNA的提取

&

Southern杂交

组别：

二组

组员：

摘要:

本实验在无液氮的情况下，制备鼠肝基因组DNA。

并将产物DNA做Southern杂交实验。

Southern杂交是分析基因结构或检测DNA中是否含有特定序列的有效技术之一,1975年由SouthernEM首创,取其姓氏而命名。

Southern杂交中探针有放射性标记和非放射性标记系统，本实验采用非放射性标记系统中的地高辛标记系统。

本实验先将凝胶电泳分离的小鼠DNA片段转移到尼龙膜上，然后用地高辛标记的碱性磷酸酶基因探针与之杂交，再通过显色反应来判断所提取的小鼠基因组DNA中是否含有与碱性磷酸酶基因同源的片段以及该同源片段的长度。

Southern杂交的转膜过程通过“夹心饼”式结构，即“滤纸-尼龙膜-凝胶-滤纸”完成。

在Southern杂交之前要进行预杂交，以此将杂交膜上的非特异性DNA结合位点封闭，减少与探针的非特异性吸附降低杂交结果的本底。

在鼠肝基因组DNA的制备过程中，要尽量避免DNA酶的污染，特别注意动作温和，减少对DNA的机械损伤。

关键词：

小鼠基因组DNA提取，Southern杂交

Abstract：

Inthisstudy，thelivergenomicDNAofratwaspreparedwithouttheliquidnitrogen.TheDNAproductwasusedtodoSouthernhybridization.SouthernhybridizationisoneoftheeffectivetechnologiesofanalyzingthegenestructureanddetectingspecificDNAsequences,whichwaspioneeredin1975bySouthernEMandnamedafterhim.TherearetwokindsofprobesinSouthernblotthatincludesradiolabeledsystemandnon-radioactivesystem.Inpresentstudy,theDigoxigenin-labeledsystemofnon-radioactivelabelingsystemwasapplied.Inthisstudy,transferringthemiceDNAfragmentsfromgelelectrophoresistonylonmembranefirstandhybridingitwithDigxigenin-labeledprobeofalkalinephosphates’gene.Atlast,determinewhetherthegenomicDNAextractedfrommicehashomologousfragmentswithalkalinephosphates’geneandthelengthofthehomologousfragmentbycolorreaction.ThetransferfilmprocessofSouthernblotwasfinishedby"puffs"structure--"thefilterpaper-nylonfilm-gel-filter".Inthepre-hybridizationbeforehybridization,theblotsasanon-specificDNAbindingsiteswereclosed,whichcanreducenon-specificadsorptionoftheprobehybridizationandthebackground.AvoidingthepollutionofDNAenzymes,andtakinggentleactionwhenpreparingthelivergenomicDNAofratsoastoreducethemechanicaldamageofDNA.

KeywordsMousegenomicDNAextraction,Southernblotting。

一、引言

1、鼠肝基因组DNA的提取

1）DNA研究的重要性

DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。

DNA是最主要的遗传物质，是基因的本质，控制生物的性状。

在生物的遗传和变异上起到重要作用。

因此，研究DNA序列、测定DNA的各项指标为研究基因结构和功能奠定基础。

2）基因组DNA的制备

真核生物的DNA具有不同来源，主要考虑材料取得的难易和操作是否简便。

通常的方法是在有EDTA及SDS一类去污剂的存在下，用蛋白酶K消化细胞，再用酚抽提除去蛋白质，相对分子质量低的杂志可用透析的方法去除，这样就能得到大约100~150kb大小的DNA分子，适用于Southern杂交分析。

3）DNA的损失

虽然双链DNA是惰性的化学物质，但它是非常易碎的，长链DNA长而完曲，很容易受到流体剪切力的伤害，因此，整个操作过程除了要尽量避免DNA酶污染外，还要注意将机械剪切力控制到最小，因此本实验操作动作温和。

此外，由于本实验在无液氮条件下进行，与有液氮的条件相比，产量和质量都有所下降。

3、Southern杂交

（一）分子杂交：

是用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质是否存在，以及相对分子质量的大小的技术，包括核酸分子杂交和蛋白质分子杂交，其中核酸分子杂交又分为DNA杂交（Southern杂交）和RNA杂交（Northern杂交）两类。

（二）Southern杂交：

Southern杂交是一项在复杂背景基因中识别特异性DNA序列的重要技术之一。

它是E.M.Southern于1975年首创的杂交方法。

它是检测核酸分子间序列同源性的一种技术，常用于重组体筛选、基因筛选、基因定位、DNA同源性检测等。

其原理是核酸分子在适宜条件下变性与复性，具有一定同源性的待测核酸与已知核酸序列在一定条件下退火，可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。

流程示意图：

1）基因组DNA的酶切：

将长链的基因组DNA切割成适合于Southern杂交的小片段。

在灭菌的1.5mL管中，按下表准备酶切反应体系：

100uL酶切体系

核酸

H2O

10xbufferK

HindIII

基因组DNA50uL

32uL

10uL

8uL

2）酶切产物的琼脂糖凝胶电泳：

A.电泳：

带电粒子在电场中的趋向运动。

a）丙烯酰胺凝胶电泳，5bp—500bp（分辨率高，1bp）

b）琼脂糖凝胶电泳，200bp—50kb（分离范围广、方便）

B.本实验采用琼脂糖凝胶电泳来分离酶切产物。

琼脂糖介质结构均一，含水量大（98-99%），可通过调整琼脂糖的浓度改变孔径的大小，起到分子筛的作用。

空隙大小决定其分辨分子大小的能力。

空隙小，分辨率高：

小分子较易通过，大分子难通过；空隙大，分辨率低：

大小分子几乎以同等速率通过

C.核酸为两性分子，在pH3.5时，碱基上的氨基解离而磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个分子带正电；pH=8左右时，碱基几乎不解离，而磷酸全部解离，整个分子带负电

D.在碱性环境下，不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构，几乎具有相同的电荷密度，其电泳行为与SDS-PAGE类似，线性分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目的对数值成反比。

可以近似用于估算分子的大小。

E.胶浓度与适用线性DNA分离范围，见表一。

胶浓度（%）

线性DNA分离范围（kb）

0.3

5-60

0.6

1-20

0.7

0.8-10

0.9

0.5-7

1.2

0.4-6

1.5

0.2-4

2.0

0.1-3

表一：

胶浓度与适用线性DNA分离范围

F.常用电泳缓冲液：

1×TAE

G.上样缓冲液：

增加样品密度、使样品带颜色，起指示作用、本身有一定迁移率，指示相对位置

H.常用染料：

a）SYBR：

新型低毒，高灵敏度荧光染料，可直接加入样品中，价格较昂贵，对DNA的迁移率有一定的影响

b）GoldViewTM：

无明显的致癌作用灵敏度与EB相当，加入胶中5uL/100mL胶，紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光而单链DNA呈现红色荧光。

对皮肤、眼睛有刺激，操作时带手套。

I.本实验采用1%琼脂糖凝胶25mL（1×TAE）,含1uLGoldViewTM。

a）加样：

DNAMarker8uL（DL15000或DL2000plS）

质粒10uL＋1uL10×loadingbuffer

酶切产物（鼠肝）10ul＋1uL10×loadingbuffer

基因组DNA（鼠肝）6ul＋0.6uL10×loadingbuffer

b）电泳：

恒压80V电泳

当溴酚蓝染料移出凝胶前沿10min后，停止电泳（电泳时间在1小时左右）

凝胶成像仪观察和记录电泳结果。

本实验中使用的染料为GoldViewTM：

其无明显的致癌作用，灵敏度与EB相当，加入胶中5uL/100mL胶，紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光而单链DNA呈现红色荧光。

对皮肤、眼睛有刺激，操作时带手套。

3）转膜：

将经限制酶消化的DNA片段经过琼脂糖凝胶电泳分离，分离的DNA片在胶层上用氢氧化钠溶液处理使之变性，然后用尼龙膜放在凝胶上使之按原有顺序将条带转移至尼龙膜上并固定起来。

本次实验的转膜过程采用“夹心饼”式结构，即“滤纸-尼龙膜-凝胶-滤纸”

结构，最后在其上放置一层浸湿转移缓冲液的滤纸（滤纸两端浸入到转移缓冲液中），让凝胶上的DNA下行转移过夜。

由于尼龙膜上带有正电荷，为了不破坏其电性，实验过程中要带上手套操作。

4）预杂交：

将杂交膜上的非特异性DNA结合位点封闭，减少与探针的非特异性吸附降低杂交结果的本底。

预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，可以自制或从公司购买。

不同的杂交液配方不同，杂交温度也不同。

但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针的DNA杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点，降低杂交背景，提高杂交特异性。

5）Southern杂交：

将吸附并固定咋尼龙膜上的DNA片段与特定的变性探针的特异性杂交过程。

用地高辛标记的单链核苷酸探针去寻找尼龙膜上能与其碱基序列全部或部分配对的单链核酸，再通过放射自显影、放射扫描或化学发光等方法显示出我们感兴趣的分子条带。

6）洗膜：

由于非特异性杂交的杂交体稳定性较低，在一定的温度和离子强度下，非特异性杂交体容易发生解离被洗掉，所以，通过洗膜，可以将滤膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针从滤膜上洗去，而特异性杂交体则保留在膜上。

所用的洗膜体系为：

一洗：

2×SSC＋0.1%SDS15min×2，室温慢摇

二洗：

1×SSC＋0.1%SDS15min×2，室温慢摇

三洗：

0.5×SSC＋0.1%SDS20min×2，65-68℃慢摇

四洗：

0.1×SSC，15min，室温慢摇。

7）检测：

将特异性杂交体通过各种方法显示出来。

方法有很多，主要分为非放射性标记探针的检测和放射性标记探针的检测。

a）非放射性标记探针的检测：

化学显色（比色）：

碱性磷酸酶（AP）显色体系、辣根过氧化物酶（HRP）显色系统

荧光检测：

碱性磷酸酶

化学发光：

辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶

b）放射性标记探针的检测：

放射自显影检测。

本实验采用的检测体系为：

碱性磷酸酶（AP）显色体系

地高辛（DIG，洋地黄类植物专一合成的复合物，DIG-11dUTP）配体是一种类固醇半抗原，可将地高辛连在dUTP上，然后用酶将其掺入新合成链中。

杂交反应后，杂交的靶DNA通过酶联免疫法与一个抗体复合物（抗地高辛配基碱性磷酸酶复合物DIG-AP）结合。

碱性磷酸酶可以使其底物BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐）脱磷酸并聚合氧化成浓紫色沉淀，在此过程中释放氢离子使NBT（氮蓝四唑）还原成浓紫色化合物，从而显示出特异性杂交条带。

碱性磷酸酶显色体系

二、实验材料、试剂及仪器设备

1.实验材料：

1）鼠肝、小指管、吸头、无菌过滤器、Tris、SDS、EDTA、蛋白酶K、胰RNA酶、氯化钠、乙酸钠、盐酸、Tris饱和酚、GoldViewTM等。

2）带正电荷的尼龙膜、地高辛检测试剂盒、四种脱氧核苷酸混合物（其中含有DIG-dUTP）、限制酶HindⅢ、Taq酶、特异引物、卫生纸、杂交盒、滤纸、玻璃平皿等。

2.试剂

1）分离胶缓冲液（100mL）：

1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）

2）浓缩胶缓冲液（100mL）：

0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）

3）凝胶储液（100mL）：

30%Acr/Bis（W/V），过滤，棕色瓶保存

4）10％APS，10mL（－200C保存）

5）生理盐水1000mL

6）组织匀浆液pH8.0（200mL）:

10mmol/LTris.HCl,25mmol/LEDTA,

100mmol/LNaCl

7）酶解液pH8.0（30mL）:

20mmol/LTris.HCl,50mmol/LEDTA,

200mmol/LNaCl,200ug/mL蛋白酶K

8）1％SDS封闭液（250mL）：

5%脱脂奶粉（用1xPBS配制）

9）一抗（150mL）：

用前用1xPBS稀释200倍

10）二抗（150mL）：

用前用1xPBS1：

200稀释

11）显色底物（150mL）：

1xPBS-150mL；DAB-200mg；H2O2-300uL（用时加入）

12）20×SSC（400mL）：

3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，用2mol/LHCl调pH7.0

13）变性溶液或碱性转移缓冲液（300mL/组）：

0.4mol/LNaOH、2mol/LNaCl

14）中和缓冲液（100mL/组）：

0.5mol/LTris-HCl（pH7.2）、1mol/LNaCl

15）检测缓冲液（500mL/班）：

0.1mol/LTris-HClpH9.5（20℃）、0.1mol/LNaCl

3.仪器

台式离心机、玻璃匀浆器、高压灭菌锅、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪。

三、实验方法和步骤

#实验流程：

转膜

电泳

酶切

杂交、检测

#实验步骤：

（一）鼠肝基因组DNA的提取

1.称取0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎；

2.将碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL匀浆液，匀浆6次（冰上操作）

3.匀浆液转入2mL小指管，4℃,5000rpm离心2min

4.沉淀加0.8mL无菌水，吹散，分成两份，再加0.4mL酶解液，慢慢颠倒混匀55℃水浴酶解过夜，4℃存放

本实验组在该步加入酶解液之后出现絮状沉淀，并未如预期一般呈澄清状态。

5.加RNase,终浓度200ug/mL，37℃保温60min

6.加入等体积的酚：

氯仿：

异戊醇轻轻混匀

7.12000r/min离心5分钟，用扩口枪头将上清转入一新管中（注意不要将杂蛋白絮状物吸入）

8.加入等体积的氯仿：

异戊醇，轻轻混匀

本实验组在该步之后出现分层现象，上层透明，下层淡黄色，中间有一层很厚，约2mm的胶状物。

9.12000r/min离心5分钟，用扩口枪头将上清转入一新管中（重复以上操作一次）

本实验组在该步之后，小指管底部出现少许淡黄色沉淀，怀疑是未被透析干净的杂蛋白质。

10.加入1/10体积的醋酸钠（3mol/LNaAcpH5.2），2倍体积的无水乙醇

11.轻轻旋转小指管，可见珠状絮丝，即为染色体丝，用枪头小心吸出液体

本实验组在该步之后，并未见到珠状絮丝，但依旧按照步骤完成了该实验。

后面的结果证明，虽然本组在操作过程中的部分结果与预期偏差较大，但还是提取到了少量的DNA。

12.染色体丝用75%乙醇洗涤2次（每次10000r/min离心5分钟）

13.室温下稍干，加0.2mLTE4℃溶解过夜。

（二）Southern杂交

I.基因组DNA的酶切

1.在灭菌的1.5mL管中，按下表准备酶切反应体系：

100uL酶切体系

核酸

H2O

10xbufferK

HindIII

基因组DNA50uL

32uL

10uL

8uL

2.37℃保温过夜

3.加入1／10体积的3mol/LNaAcpH5.2和2倍体积的无水乙醇

4.室温沉淀20分钟

5.12，000r/min离心10分钟

6.室温干燥

7.加入10uLTE溶解

II.酶切产物的琼脂糖凝胶电泳：

1.配制1%琼脂糖凝胶25mL（1×TAE）,含1uLGoldViewTM

2.加样：

（按下述顺序）

1）DNAMarker8uL（DL2000plS）

2）T质粒20uL＋1uL10×loadingbuffer

3）本组获得的酶切产物（鼠肝）：

10ul＋1uL10×loadingbuffer

4）来自于老师的标准酶切产物（鼠肝）：

10ul＋1uL10×loadingbuffer

5）未重组未酶切质粒（petBlue2）:

20ul＋5uL10×loadingbuffer

6）基因组DNA（鼠肝）：

10ul＋0.6uL10×loadingbuffer

7）基因组DNA（鼠肝）：

10ul＋0.6uL10×loadingbuffer

3.电泳：

恒压80V电泳

4.当溴酚蓝染料移出凝胶前沿10min后，停止电泳（电泳时间在1小时左右）

5.凝胶成像仪观察和记录电泳结果。

III.Southern转膜：

（注：

以下操作要戴上一次性手套）

1.用刀片切掉未用过的凝胶区域，并将凝胶切掉一个角,（对点样顺序做个标记），然后转至玻璃平皿中。

2.在室温下将凝胶浸泡在变性溶液中15分钟，并轻轻摇动。

3.更换变性液继续浸泡凝胶20分钟，并轻轻摇动。

4.将带正电荷的尼龙膜裁成比凝胶大一毫米大小，并在相应位置上剪掉一个角，再切六张与膜一样大小的滤纸，先用无菌水浸湿。

5.再放入碱性转移缓冲液中浸泡约30min。

6.制作夹心饼式的结构（由下至上）:

三张潮湿的滤纸--膜--凝胶--三张潮湿的滤纸（注：

胶与膜的切角对齐,千万不要有气泡），

7.在玻璃板上先放上约10cm高的吸水纸，并在其上放上10层同样大小的干滤纸，将夹心饼结构放到其上。

8.在上述结构的上面放两层浸湿转移缓冲液的滤纸（滤纸的两端浸入转移缓冲液中）

9.盖上盖子，让凝胶上的DNA下行转移过夜。

10.将尼龙膜与凝胶剥离，将膜浸在中和缓冲液中，室温15分钟，并轻轻摇动。

11.更换中和缓冲液继续室温浸泡15分钟，并轻轻摇动。

IV.预杂交：

将膜放入杂交管中，加入预杂交液，在65℃杂交炉中预杂交5-6h。

V.杂交：

1.将含膜的杂交管从4℃转入杂交炉中，待杂交液变清后取出，打开盖子，将预杂交液倒出。

2.加入含有探针的新鲜杂交液。

3.将杂交管放在62℃杂交炉杂交16小时或过夜。

VI.洗膜：

1.先将5×SDS稀释成0.1%SDS。

取100ml5×SDS加入400ml0.1%SDS，获得1×SDS500ml。

2.洗膜：

一洗：

10mL20×SSC＋10mL1×SDS+80mL水，15min／次×2次，室温慢摇；

二洗：

10mL20×SSC＋5mL1×SDS+85mL水，15min／次×2次室温慢摇；

三洗：

2.5mL20×SSC＋10mL1×SDS+87.5mL水，1次，室温慢摇，约10min；

再次二洗：

5mL20×SSC＋10mL1×SDS+85mL水，15min／次×2次,室温慢摇

再次三洗：

2.5mL20×SSC＋10mL1×SDS+85ml水,20min／次×2次，

65-68℃慢摇；

四洗：

0.25mL20×SSC+49.75mL水，15min，室温慢摇。

注：

本组在洗膜过程中，出现操作失误!

但是及时更正了。

VII.检测：

1.将膜放入洗涤液中，在15－25℃振摇5min；

2.将膜放入封闭液中，保温40min；

3.将膜放入抗体溶液（用封闭液1：

5000稀释DIG－Ab－AP）中，保温30min；

4.用洗涤液洗涤膜两次，每次20min；

5.将膜放入检测缓冲液中，平衡2－5min；

6.将膜放入5mL新鲜准备的有色底物溶液（5mL检测缓冲液＋100uLNBT/BCIP）中，避光使可见的有色斑点产生（千万不能摇动）

7.待颜色达到所需的程度时，用无菌水或TE浸泡5min即可终止反应

四实验结果

Southern杂交结果：

SouthernBlotting结果图

在第1条可见带之前还有两个样品并没有显示出条带，分别是DNAMarker和T质粒，依此类推，显色的3条带分别是第3、4、7样品孔。

其中，3号样品为本组获得的DNA酶切产物,表现出很明显的拖带现象，染色均一，但是并没有出现染色较深的区域；2号样品为来自老师的标准DNA酶切产物，共有4个染色较深区域，其中除了中间与探针的同源区域外，还出现了其他一些大小不一的片段，主要集中在三类分子大小较为接近的区域；7号样品为鼠肝基因组DNA，可见与4类似的同源区域，但颜色较浅，而且并没有其他分子量的片段。

五讨论

由显色结果可以看到，显色的3条带分别是第3、4、7个样品孔。

其中，3号样品为本组获得的DNA酶切产物,表现出很明显的拖带现象，染色均一，但是并没有出现染色较深的区域；2号样品为来自老师的标准DNA酶切产物，共有4个染色较深区域，其中除了中间与探针的同源区域外，还出现了其他大小不一的片段；7号样品为鼠肝基因组DNA，可见与4类似的同源区域，但颜色较浅，而且并没有其他分子量的片段。

通过该结果可以看出，鼠肝基因组DNA与碱性磷酸酶基因探针有序列同源性，经过酶切后，该同源性依旧保持，但是出现其他一些弥散的片段，这是由于经过酶切后的体系中含有不止一种分子大小的片段所导致的。

由于DNAMarker并未显色，无法估计发生杂交的同源区域的分子量大小，但是可以看出，酶切的DNA片段除了与基因组DNA在相似的片段出现与探针同源的区域外，还有有一类分子量较小的同源片段和两类分子量较大的同源片段。

关于DL2000plS并没有显色的原因，推测可能是由于它与探针并没有发生杂交。

在本次实验过程中，本组提取的鼠肝DNA并没有出现预期结果，推测可能的