植物基因组DNA的提取及其定性定量分析Word格式.docx

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1OD260相当于dsDNA50μg/mL，ssDNA33μg/mL和ssRNA40μg/mL。

可以此来计算核酸样品的浓度。

紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。

【仪器、材料与试剂】

一、仪器及耗材

离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器（10、100、1000μL量程各一支）、100mL或250mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5mLEP管、PE手套和乳胶手套。

二、药品

三羟甲基氨基甲烷（Tris）、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠（NaCl）、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。

三、试剂

1.2×

CTABbuffer【1】

2.70%乙醇【2】

3.RNaseA（天根）

【3】

4.0.5×

TBE缓冲液（工作浓度）【4】

5.6×

loadingbuffer【5】

6.核酸染料（赛百盛）

7.DNAmarkerDL2000（Takara）

8.酚/氯仿（1:

1,V/V）【6】

【实验步骤】

1.取约100mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5mLEP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。

2.加入0.6mL2×

CTAB提取液（用前加入0.2﹪的巯基乙醇），混匀，65℃水浴30min，每10min颠倒混匀一次。

3.取出离心管，冷却后加入0.6mL酚氯仿混合液，混匀。

4.11,500rpm室温离心8min（若没离好可重复一次）。

5.将上清液（约400μL）转移到另一新的1.5mL离心管中。

6.加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500rpm离心8min，取上清（约350μL）。

7.加入600μL无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30min。

8.4℃，15,800rpm离心20min，弃上清。

9.1mL70％乙醇（预冷）洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能vortex，7,000g离心3min，弃上清，风干。

10.加入30μL无菌水（含20μg/mLRNaseA），37℃溶解DNA30min。

11.取5μLDNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：

（1）制备琼脂糖凝胶

称取0.3g琼脂糖，放入三角瓶中，加入30mL0.5×

TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全熔化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。

（2）胶板的制备

①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙），形成一个模具。

②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。

③待琼脂糖凝胶液冷却到60℃左右时，加入核酸染料1.5μL，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

④室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。

⑤加入0.5×

TBE电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1mm。

（3）加样

在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1×

。

用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNAmarker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。

每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面（注意：

加样前要先记下加样的顺序）。

（4）电泳

①接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动）。

DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此，最高电压不超过5V/cm。

②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

③紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。

12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度：

（1）用0.1×

TE对待测DNA样品按1:

20或合适的倍数稀释。

（2）开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrumentReady”时，进入核酸测定窗口。

（3）调零。

先用0.1×

TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。

点击“setref”键，仪器自动校正零点。

将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。

（4）吸70μL已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。

如果样品很少，可以用5-7μL的石英样品杯。

点击“enter”键，仪器即进入分析状态。

窗口同时显示260nm和280nm处的光密度（OD值）及A260/A280nm和A280/A260nm的比率以及DNA样品的浓度等。

（5）打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入下一个待测样品。

（6）DNA纯度：

以A260/A280比值来反映。

当A260/A280比值<

1.8时，说明样品存在蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE溶解后再测定。

当A260/A280比值>

2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去除RNA。

实验结果与分析

1.1%的琼脂糖凝胶电泳检测拟南芥基因组DNA

C组电泳结果如图所示

1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA5μl样品，电泳结果如图所示

有DNA条带出现，表明已经成功提取到了拟南芥的基因组DNA。

2.DNA样品的OD检测

检测OD值

C1：

浓度:

1061.7ng/

OD260/OD280：

1.87

表明：

C1接种DNA质量良好。

（如下图所示）

C2：

1017.6ng/

1.86

表明:

C2接种DNA质量良好。

C3：

711.0ng/

C3接种DNA质量良好。

注意事项：

1、磨样时要反复插入液氮中冷冻，但要避免液氮进入管中；

2、取酚氯仿混合液时要吸取下层；

3、加入酚氯仿和氯仿时要充分混匀；

4、氯仿抽提后取上清时不要吸到蛋白层；

5、晾干沉淀时，要尽可能的吸除酒精。

实验二PCR扩增目的片段

【实验目的】

通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

【实验原理】

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：

DNA模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的DNA引物、耐热DNA聚合酶。

PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。

整个扩增过程分三步：

①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段；

②退火，快速降低温度至50-60℃后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段；

③延伸，溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5′→3′方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。

经过25-30个循环后，DNA可扩增106-109倍。

PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。

PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（0.1-2.5μL）、200μLPCR管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000μL量程各一支）、100mL或250mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套。

二、试剂

1.10×

缓冲液

2.DNA模板1ng/μL（以实验一提取的拟南芥基因组DNA为模板）

3.dNTPMix（Takara）

4．引物

P3：

5′-CGGGTACCGGTGAATTAAGAGGAGAGAGGAGG-3′

P5：

5′-ACTCTAGATGAGTAAAACAGAGGAGGGTCTCAC-3′

引物溶液浓度：

2μM

5.rTaq酶5U/μL

6.低熔点琼脂糖

7.去离子水或TE（pH7.6）

【7】

1．在200μLPCR管内配制20μL反应体系：

反应物体积/μL

ddH2O11.3

10×

PCR缓冲液2.0

dNTP1.6（终浓度20—200μM）

引物12.0（引物终浓度0.2μM）

引物22.0（引物终浓度0.2μM）

模板DNA1.0

rTag酶0.1

Total20

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2.将上述试剂依次加入PCR薄壁管。

加样后用手轻弹混匀，6,000rpm离心15sec使反

应成分集于管底。

3.PCR反应热循环程序设置：

①94℃预变性3min;

②94℃变性30sec;

③64℃退火30sec;

30cycles

④72℃延伸1min;

⑤72℃延伸10min;

⑥16℃pause

反应结束后短暂离心，置4℃保存备用。

4.配制1％的琼脂糖凝胶。

5.取5μLPCR产物，加1μL的6×

loadingbuffer（上样缓冲液），轻弹混匀后进行电泳检测。

6.如果PCR产物非常特异，可以直接用于与载体的重组连接。

【实验结果】

本实验扩增片段长652bp。

1、加样时要精确用移液器。

2、检查PCR仪是否热盖。

3、每种试剂弹化后要离心；

做MIX时，最后加酶，分装之前要混匀；

分装后需离心混匀。

实验二的PCR扩增

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，电泳结果如图所示，有DNA条带，约600bp；

或者无DNA条带。