青岛科技大学海洋生物技术期末复习解读.docx

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青岛科技大学海洋生物技术期末复习解读

基因工程

1.基因是能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）的DNA序列。

✓分类：

根据产物的类别可以分为蛋白质基因和RNA基因（rRNA基因和tRNA基因）两大类；

✓根据产物的功能可以分为结构基因（酶和不直接影响其他基因表达的蛋白质）和调节基因（阻遏蛋白或转录激活因子）两大类。

2.基因工程或称基因重组技术，是将不同生物的基因在体外人工剪切、组合,并和载体（质粒，噬菌体，病毒）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。

3.基因工程的操作包含以下步骤：

获得目的基因构造重组DNA分子转化或转染表达蛋白质产物的分离纯化4.克隆（clone）：

来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。

5.克隆化（cloning）

包括：

1.获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。

2.分子克隆（DNA克隆）3.细胞克隆个体克隆（动物或植物）

6.DNA克隆：

应用酶学的方法，在体外将各种来源的DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子,又称基因克隆。

7.工具酶：

限制性核酸内切酶DNA聚合酶逆转录酶DNA连接酶末端转移酶TaqDNA聚合酶

（1）限制性核酸内切酶

定义：

识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内酶。

是细菌内存在的保护性酶。

分为I、II、III三类。

II类酶识别序列特点为回文结构。

粘性末端：

5´-端突出，3´-端突出　　

平末端:

限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。

不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatibleend），可用连接酶连接。

目的基因：

应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。

1.cDNA是指经反转录合成的，与RNA互补的单链DNA。

以单链cDNA为模板,经聚合反应可合成双链cDNA。

2.基因组DNA是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。

3.基因载体（vector）:

能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的可独立复制的完整DNA分子。

又称克隆载体。

其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载体。

4.常用的载体：

质粒、噬菌体DNA、病毒DNA

5.载体的选择标准：

能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；

有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子相对较小，一般3-10Kb

6.质粒:

是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。

大小约为数千碱基对。

常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。

重组DNA技术基本原理

原理部分

目的基因的获取

　　1.　化学合成法:

用于已知序列，或可推导出序列的基因

2.　基因组DNA:

基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）

3.　cDNA:

cDNA文库4.　聚合酶链反应PCR

　8.基因组DNA文库：

存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。

简称G－文库。

9.cDNA文库用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。

简称c－文库。

10.PCR的基本原理

原料：

4种dNTP混合物引物　模板DNA　TaqDNA聚合酶Mg2+

　反应过程：

高温变性、低温退火、适温延伸。

11.克隆载体的选择

①构建目的（构建gDNA或cDNA文库类型、和表达、亚克隆等不同目的）选择对应的载体；

②考虑载体中酶切位点是否合适；

③根据待克隆的目的基因片段的大小选择合适的载体。

（三）外源基因与载体的连接

1.粘性末端连接

2.平端连接:

限制性内切酶作用产生的平端；粘端经特殊酶处理变为平端

3.同聚物加尾连接:

由末端转移酶作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。

4.人工接头:

由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。

（四）重组DNA导入受体菌

受体菌条件：

安全宿主菌、处于感受态

导入方式：

转化（transformation）转染（transfaction）　

若受体细胞是细菌，通常称转化；若受体细胞是动/植物细胞，通常称转染。

（五）重组体的筛选：

重组DNA导入受体菌后，经过培养使其大量繁殖，再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选（screening）或选择（selection）。

1.直接选择法

针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。

其特点是直接测定基因或基因表型。

（1）抗药性标记选择（插入失活法）:

将目的基因插入带ampr和tetr基因载体的tetr基因中，则tetr基因失活。

在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养，进行筛选。

（2）标志补救（markerrescue）

若目的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对

营养素的依赖表型来筛选。

（3）分子杂交法：

利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。

两种方法：

原位杂交，Southern印迹　

（4）酶切鉴定

（5）菌落PCR

（6）序列分析

（六）克隆基因的表达

　　表达体系的建立：

表达载体的构建

受体细胞的建立

表达产物的检测

表达产物的分离、纯化

复习思考题：

　1.概念：

（1）克隆

（2）转化

（3）基因工程

（4）限制性核酸内切酶

（5）载体（6）G文库

（7）质粒（8）c文库

2.简述基因工程的基本过程。

3.简述目的基因的主要来源或途径。

参考答案：

（1）人工合成

（2）cDNA（3）G-DNA（4）PCR

4.已知某一基因的DNA单链5——ATGGGCTACTCG——3

（1）写出DNA复制时另一条单链的核苷酸序列。

（2）以该链为模板转录成RNA序列。

（3）合成的多肽序列。

参考密码子：

UAC酪氨酸CCG脯氨酸CGA精氨酸CAU组氨酸AUG蛋氨酸AGC丝氨酸GUA缬氨酸GCC丙氨酸

答案：

5——ATGGGCTACTCG——3DNA

（1）3——TACCCGATGAGC——5DNA

（2）3——UACCCGAUGAGC——5mRNA

（3）5——CGAGUAGCCCAU——3

N—Arg—Val—Ala—His—C多肽链

5.在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA？

为什么要在cDNA前加上细菌的启动子？

提示关键点：

真核生物有内含子

6.某一质粒基因载体具有Tet抗性和Kan抗性的表型，在Kan抗性基因内有一Bglll的切点。

先用Bglll切割该载体进行基因克隆，问

（1）转化后涂皿时应加什么样的抗生素？

（2）培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型？

7.怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRⅠ限制位点中去？

8.如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码蛋白的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达？

简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。

9.说明合成接头在基因工程中的主要作用

动物基因工程

1.转基因动物：

用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。

特点：

分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达。

基本原理

将目的基因导入实验动物的受精卵或着床前胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或胚胎细胞移植入受体动物的输卵管或子宫内，使其发育成携带有目的基因的转基因动物。

制作转基因动物的主要方法

⏹DNA显微注射法

⏹电脉冲导入法

⏹精子载体法

⏹逆转录病毒感染法

1.显微注射法是基因转移中应用最广泛和最成功的方法之一。

显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸管固定受精卵，另一侧将注射针插入受精卵原核。

拔出显微注射针解除固定管的负压，操作完成。

优点：

将外源DNA片段直接注入受精卵原核，使外源DNA随机整合到寄主基因组中，整合效率高，并且多数基因能够表达。

缺点：

受生物种类的影响；操作复杂，工作效率低。

2.电脉冲导入法

3.精子载体法

定义：

将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。

精子作为外源基因的转移载体依赖于将外源基因先“装载”到精子细胞中。

常用的装载方法有：

脂质体介导促进精子对外源基因的吸收；

电脉冲介导促进精子对外源基因的吸收；

精子结合外源DNA的机制

用精子载体法成功的获得转基因动物，精子与外源DNA共孵育期问有3个关键步骤：

与精子的结合

内化入精子头部

在精子基因组中的整合

精子结合外源DNA的定位及去向

定位：

主要位于精子头部的赤道段和顶体后区，而且主要吸附于精子头部表面，少数侵入到精子核区。

去向：

穿入精子核区的外源DNA首先紧密结合在核骨架上，随后与精子细胞基因组发生重组，且重组不是随机发生，精子细胞基因组上可能存在某些优先选择的重组位点。

影响精子与外源DNA结合及结合后基因转移的因素

较长的DNA片段与较短的DNA片段相比更容易被精子摄取

脱氧核糖核酸酶对外源DNA有降解

较高浓度的DNA易引起胚胎的死亡

精子来源不同

生殖细胞的精子由于可跟卵子形成受精卵，将它制作为外源基因转移载体来制备转基因动物，具有操作简单、耗费低、转染率高、适应性广等特点

外源基因的检测

1、染色体和基因水平的检测

（1）PCR

（2）Southern印迹杂交

（3）DNA斑点杂交

2、转录水平的检测

（1）Northern印迹杂交

（2）RNase保护分析

（3）RT-PCR

3、蛋白质水平的检测

Western印迹杂交

报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因,通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控.由于具有灵敏度高、检测方便等特点,报告基因技术有了广泛的应用.

常用的报告基因

氯霉素乙酰转移酶基因荧光素酶基因绿色荧光蛋白基因

细胞工程

1.定义:

在细胞水平运用各种生物技术，能够达到细胞产物或细胞及组织本身的规模生产

2.分类

1.

染色体工程：

按照人们需要来添加或削减一种生物的染色体，或用别的生物的染色体来替换。

可分为动物染色体工程和植物染色体工程两种

2.染色体组工程：

整个改变染色体组数的技术

3.细胞质工程：

又称细胞拆合工程，是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建新细胞。

4.细胞融合工程:

用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。

可用于产生新的物种或品系及产生单克隆抗体。

3.

1.原代细胞：

直接从动物体机体取得细胞，加以培养。

此细胞传代至10代左右即停止。

2.细胞株：

少数情况下，有些细胞可以传代至10代以上，甚至50代左右仍能保持原来的染色体二倍体数量及原细胞主要特征。

3.细胞系：

细胞株中如发生遗传突变，有可能无限制的遗传下去。

4.动物细胞生长特点：

帖附生长、悬浮生长

5.单克隆抗体的制备

鱼类细胞培养

1.鱼类细胞原代培养的方法包括：

（1）组织块固定法

（2）机械分散法（3）络合剂分散法（4）酶消化法

2.各种方法适用条件

⏹当组织量较少时，可以采用组织块固定法；

⏹机械分散法适于细胞间连接较松散的组织，如胚胎组织及幼鱼全鱼；

⏹络合剂分散法是用EDTA等螯合剂将细胞间的钙、镁离子结合掉，而使细胞间连接松散，主要用于囊胚细胞培养；

⏹酶消化法是目前鱼类细胞培养中最为常用的方法，胰蛋白酶质量分数为0．25％～0．5％。

海洋藻类基因工程

1．定义人工种子是指通过植物组织培养技术获得具有胚芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体，并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。

制作体细胞胚与藻酸钠混合后，滴入到硝酸钙或CaCl2中，20分钟后，表面聚合，形成人工种子

2．植物细胞杂交的主要过程如下：

①原生质体的制备

②原生质体的融合

③杂合体的鉴别与筛选

3．植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较

项目

细胞融合原理

细胞融合方法

诱导手段

用途

植物体细胞杂交

细胞膜的流动性

去除细胞壁后诱导原生质体融合

离心、振动电剌激、聚乙二醇诱导

克服远源杂交不亲和的障碍，获得杂种植株

动物细胞融合

细胞膜的流动性

使细胞分散开，诱导细胞融合

同上，还可用灭活的病毒诱导

制备单克隆抗体

脱分化（去分化）：

由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程。

再分化：

脱分化产生的愈伤组织重新分化成根、芽等器官的过程。

原生质体材料的选择和预处理

年龄：

早期营养细胞

部位：

靠近基部的营养细胞

预处理：

消毒海水反复冲洗，直至无附着杂藻为止

原生质体的融合

大型海藻的细胞融合，常见的有自发融合和诱导融合

酶解法去壁纤维素酶果胶酶

人工诱导融合的方法：

物理法：

离心振动电刺激

化学法：

聚乙二醇PEG

融合细胞的筛选

大型海藻杂种细胞的识别通过三种方法进行鉴定。

人工标记：

中性红标记法遗传标记：

叶状体的颜色因种而异

融合体与双亲细胞的差异：

融合体的体积比双亲原生质的体积大

主要采用显微操作法从融合液中分离异源融合体，进行单独培养。

习题部分

1用植物组织培养技术，可以培育或生产出

A.食品添加剂B.无病毒植物C.人工种子D.以上三者均是

2植物体之所以具有不同的组织器官是由于

A.基因选择表达的结果B.部分基因功能丧失的结果

C.分成不同基因细胞的结果.D.外界环境影响的结果

3番茄和马铃薯杂交过程不需要的细胞结构是

A细胞膜B.细胞壁C.细胞核D.高尔基体

4杂种细胞的原生质融合是

A.不同细胞的原生质直接融合在一起形成B.并没有实现融合的两部分C.必需通过人工诱导才能实现细胞融合D.只有细胞核融合

6植物组织培养形成的愈伤组织进行培养，又可以分化形成根、芽等器官，这一过程称为：

A、脱分化B、去分化

C、再分化D、脱分化或去分化

7下列不能作为植物组织培养的材料是：

A、秋海棠的叶B、马铃薯的块茎

C、成熟的花粉D、木质部中的导管细胞

8植物体细胞杂交尚未解决的问题有：

A、去掉细胞壁,分离出有活力的原生质体

B、将杂种细胞培育成植株

C、让杂种植物按照人们的需要表现出亲代的优良性

D、尚未培育出属间杂种植物

9不能人工诱导原生质体融合的方法是：

A、振动B、电刺激、

C、PEG试剂、D、重压

10用动物细胞培养技术使细胞传到50代以后仍能传下的传代细胞称为（）

A.原代细胞B.传代细胞C.细胞系D.细胞株

11“生物导弹”是指（）

A.单克隆抗体B.带有特定药物的单克隆抗体C.杂交细胞D.淋巴细胞

12能加快良种家畜繁殖能力的细胞工程技术是（）

A.组织培养B.细胞融合C.胚胎移植D.细胞核移植

13下列细胞中发育有癌变特点，可能在培养条件下，无限传代下去的这种传代细胞称之为（）

A.原代细胞B.细胞株C.细胞系D.胚胎细胞

14为了便于培养的动物组织细胞分散开来，配制成一定浓度的细胞悬浮液，选取来的动物组织应先用下列哪种物质处理（）

A.胃蛋白酶B.盐酸C.胰淀粉酶D.胰蛋白酶

15在动物细胞培养中，所培养的动物细胞大都取自（）

A.中年动物器官B.老龄器官C.幼龄器官D.中年动物组织

16表现型不同的母牛生育出基因型完全相同的小牛，产生这一结果最可能的原因是（）

A.试管动物培养B.胚胎移植C.胚胎分割移植D.受精卵移植

17下列细胞中，不能培养的细胞是（）

A.心肌细胞B.神经细胞C.根的皮层细胞D.木质部导管细胞

18有人做了如下实验：

用玻璃针移除两栖类卵细胞中的细胞核，然后用玻璃微吸管将蝌蚪胸腺细胞的细胞核注入去卵核的细胞内。

经特殊方法刺激，此卵细胞有可能分裂发育成蛙。

请根据以上实验回答。

（1）此实验属于细胞工程中的技术，实验中卵细胞被称为细胞；

（2）由此培育出来的蛙，遗传物质是来自，合成蛙胚细胞DNA和蛋白质

的原料来自和。

19现有甲、乙两个烟草品种（2n=48），其基因型分别为aaBB和AAbb，这两对基因位于非同源染色体上，且在光照强度大于800勒克斯时，都不能生长，这是由于它们中的一对隐性纯合基因（aa和bb）作用的结果取甲乙两品种的花粉分别培养成植株，将它们的叶肉细胞制成原生质体，并将两者相混，使之融合，诱导产生细胞团。

然后，放到大于800勒克斯光照下培养，结果有的细胞团不能分化，有的能分化发育成植株。

请回答下列问题：

（1）甲、乙两烟草品种花粉的基因型分别为和；

（2）将叶肉细胞制成原生质体时，使用破除细胞壁；

（3）在细胞融合技术中，常用的促融剂是；

（4）细胞融合后诱导产生的细胞团叫；

（5）在大于800勒克斯光照下培养，有种细胞团不能分化；能分化的细胞团是由的原生质体融合来的（这里只考虑2个原生质体的相互融合）；由该细胞团分化成发育成的植株，其染色体数是，基因型是；该植株自交后代中，在大于800勒克斯光照下，出现不能生长的植株的概率是。

答案：

DABCCDCDCBCCDCCD

18.细胞核移植受体蝌蚪胸腺细胞蛙卵细胞中脱氧核苷酸蛙卵细胞中氨基酸

19.aBAb纤维素酶聚乙二醇（PEG）愈伤组织22甲乙48AaBb7/16

一、名词解释

细胞工程基因组DNA文库末端转移酶精子载体法

二、选择题

1．已知某一基因的DNA单链5，——ATGGCATAG——3，以该链为模板转录成的RNA序列为（）

A、5，——ATGGCATAG——3，B、5，——TACCGTATC——3，

C、5，——GATACGGTA——3，D、5，——CTATGCCAT——3，

2.下列哪一项属于克隆（）

A、将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中

B、将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内

C、将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞

D、将某种瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系

3.植物体之所以具有不同的组织器官是由于（）

A、基因选择表达的结果B、部分基因功能丧失的结果

C、分成不同基因细胞的结果D、外界环境影响的结果

4.表现型不同的母牛生育出基因型完全相同的小牛，产生这一结果最可能的原因是（）

A、试管动物培养B、胚胎移植C、胚胎分割移植D、受精卵移植

5.通过诱变育种培育的是（）

A、三倍体无子西瓜　B、青霉素高产菌株

C、二倍体无子番茄　D、八倍体小黑麦

6.基因型为AaBb的水稻自交，自交后代中两对基因都是纯合的个体占总数的（）

A、2/16B、4/16C、6/16D、8/16

三、填空题

1.聚合酶链反应（PCR技术）是一项的专门技术，其包括、和三个步骤。

2.细胞核移植技术操作主要包括、和。

3．限制性核酸内切酶识别特异序列，并在识别位点或其周围切割的一类内切酶。

4．cDNA是指经反转录合成的，与互补的单链DNA。

以单链cDNA为模板，经聚合反应可合成双链cDNA。

5.制作转基因动物的主要方法是、、和逆转录病毒法。

6.植物细胞培养和动物细胞培养的原理分别是和细胞的增殖。

四、问答题

1.已知某一基因的DNA单链5'——ATGGGCTACTCG——3'（11分）

（1）写出DNA复制时另一条单链的核苷酸序列。

（2）以该链为模板转录成RNA序列。

（3）合成的多肽序列。

2.简述基因工程的主要过程（6分）？

3.在基因工程中，外源基因与载体的连接方式有哪些（至少四种）？

4.什么是细胞工程，按照需要改造的遗传物质的不同操作层次，细胞工程学包括哪些方面？

5.简要说明PCR技术的工作原理并举几例说明该技术在分子生物学不同研究领域中的应用（至少2个）。

6.某一质粒基因载体具有Tet抗性和Kan抗性的表型，在Kan抗性基因内有一Bgll的切点。

先用Bgll切割该载体进行基因克隆，问

（1）转化后涂皿时应加什么样的抗生素？

（2）培养后长处的菌落具有什么样的抗性基因型？

7.简要说明合成接头在基因工程中的主要作用。

五、分析题

1.在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA？

为什么要在cDNA前加上细菌的启动子？

2.PCR的基本原理是什么？

用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？

3.论述基因克隆包括哪些过程？

有哪些主要的应用价值？

4.基因文库和cDNA文库有何不同？

为什么要建cDNA文库？

？

5.现已从海水中分离到一株细菌，并已知该菌中含有编码琼胶酶的基因，如何克隆和表达琼胶酶基因。

六、论述题

谈谈你对基因工程的认识（定义、实验流程和应用）

七、实验设计

1.生物法处理石油废水比化学法更具有竞争力，利用微生物对石油污染物质的降解和转化功能可以对环境起到很好的保护作用。

然而，要有效地清除污染，单纯依靠天然微生物资源是远远不够的。

请通过所学知识，详细设计出可以通过哪三种途径获得具有特殊功能的“超级菌”？

2.20世纪60年代，有的科学家提出这样一个设想：

让番茄和马铃薯杂交，培育出一种地上结番茄，地下结马铃薯的植物。

要实现这一设想，你认为可以采用何种方法？

能否用传统的有性杂交方法做到这一点？

请写出详细的实验步骤。

读书的好处

1、行万里路，读万卷书。

2、书山有路勤为径，学海无涯苦作舟。

3、读书破万卷，下笔如有神。

4、我所学到的任何有价值的知识都是由自学中得来的。

——达尔文

5、少壮不努力，老大徒悲伤。

6、黑发不知勤学早，白首方悔读书迟。

——颜真卿

7、宝剑锋从磨砺出，梅花香自苦寒来。

8、读书要三到：

心到、眼到、口到

9、玉不琢、不成器，人不学、不知义。

10、一日无书，百事荒废。

——陈寿

11、书是人类进步的阶梯。

12、一日不读口生，一日不写手生。

13、我扑在书上，就像饥饿的人扑在面包上。

——高尔基

14、书到用时方恨少、事非经过不知难。

——陆游

15、读一本好书，就如同和一个高尚的人在交谈——歌德

16、读一切好书，就是和许多高尚的人谈话。

——笛卡儿

17、学习永远不晚。

——高尔基

18、少而好学，如日出之阳；壮而好学，如日中之光；志而好学，如炳烛之光。

——刘向

19、学而不思则惘，思而不学则殆。

——孔子

20、读书给人以快乐、给人以光彩、给人以才干。

——培根