整理红花中黄酮类化合物抑制基质金属蛋白酶活性的实验研究.docx

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整理红花中黄酮类化合物抑制基质金属蛋白酶活性的实验研究

（4）化工、冶金、有色、建材、机械、轻工、纺织、烟草、商贸、军工、公路、水运、轨道交通、电力等行业的国家和省级重点建设项目；

规划编制单位应当在报送审查的环境影响报告书中附具对公众意见采纳与不采纳情况及其理由的说明。

二、建设项目环境影响评价

（4）化工、冶金、有色、建材、机械、轻工、纺织、烟草、商贸、军工、公路、水运、轨道交通、电力等行业的国家和省级重点建设项目；

专项规划中的指导性规划　环境影响篇章或说明

1.准备阶段

一、环境影响评价的发展与管理体系、相关法律法规体系和技术导则的应用

D.可能造成轻度环境影响、不需要进行环境影响评价的建设项目，应当填报环境影响登记表

2.建设项目环境影响评价文件的报批时限第一章前言

1.1红花简介

红花（CarthamustinctoriusL．）为菊科植物，红花属红花的干燥花，生长周期为1~2年，在国际上，印度、美国、埃塞俄比亚、澳大利亚等地为红花主要种植地，在我国则主产于河南、云南、浙江等地，由于其在种植方面有较好的抗旱、耐盐碱、抗寒、用途广泛等诸多优点，在我国栽培种植已经有两千多年的历史[1-3]在历史上，红花被赋予了多种意义，不仅可以用来药用，还可用于食用、染料和油料等。

虽然红花成分较为复杂，但已被分离鉴定的化学成分有60多种，主要分为黄酮类、木脂素类、多炔类等几大类，而且存在着200多种色素类成分，其中含有丰富的黄色素和红色素，这是一种纯天然染色剂。

其他类型的黄酮类物质，主要有山奈酚（Kaempferol）和槲皮素（Quercertin）为基本母核的一系列衍生物及芦丁（Rutin），杨梅素（Myricetin），芹黄素（Apigenin），木樨草素（Luteoline）等。

研究表明红花有效成分主要为红花黄色素，是一组水溶性查尔酮类成分，红花中查尔酮类化合物多为色素类成分，而其中最重要的就是红花黄色素（saffloweryellow，SY）。

SY由红花黄色素A（HSYA）和红花黄色素B（SY-B）及其衍生物组成，羟基红花黄色素（HydroxylsaffloweryellowA，HSYA）的研究是最为广泛的，日本学者龟高德平首先从我国河南承德红花干花中分得红色素（含0.3%～0.6%），它是红花中含量最高的成分[4-7]。

红花黄色素有改善心肌及脑组织微循环障碍的作用[8]，亦有扩张冠脉，抗氧化，保护心肌，降血压，免疫抑制和脑保护的多种药理学功效[9]。

1.2基质金属蛋白酶（MMPs）简介

ECM（extracellularmatrixc）是一种存在于细胞间隙中的大分子物质，其临床方面对于研究肿瘤转移有着极其重要的意义，应用蛋白酶降解ECM是治疗多种疾病的有效方法，如强直性脊柱炎，心脑血管疾病，肿瘤，糖尿病，炎症等[10-12]。

基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）是一类与Ca2+，Zn2+金属离子结合，可对ECM有极强降解作用的超酶家族，据现阶段研究表明MMPs已鉴定出28种，其又可以分为5大类，分别为①胶原酶、②明胶酶、③基质裂解酶、④膜型金属蛋白酶、⑤其它型。

这里，胶原酶主要包含MMP-1、MMP-8、MMP-13，明胶酶主要包含MMP-2、MMP-9，基质裂解酶主要包含MMP-3、MMP-10、MMP-11，膜型金属蛋白酶主要包含MMP-14，MMP-15，MMP-16、MMP-17、MMP-24、和MMP-25。

酶本身的活性点各不相同，这种不同主要是由于染色体序列不同所导致，由此各蛋白酶对应的底物与抑制剂也各有不同。

根据报道，MMPs活性的抑制对肿瘤细胞的行为有重要的影响，而MMP-2的活性也与癌栓及肿瘤大小密切相关[13~15]。

本实验研究红花体外抑制基质金属蛋白酶-2活性的作用及抗肿瘤机理，从而为从分子水平上研究红花的治病机理奠定基础，也为进一步从红花中提取基质金属蛋白酶抑制剂提供实验依据。

第二章实验部分

2.1实验材料、试剂

红花药材购买于北京同仁堂大药房（长春汽车厂分店）。

羟基红花黄色素A（HydroxylsaffloweryellowA，HSYA）标准物质购于中国药品检验所（北京）、红花黄色素B（AnhydrosaffloryellowB，SY-B）标准品为实验室自主分离（纯度达98%）。

HEPES（Promega），基质金属蛋白酶-2（MMP-2，Sino-Bilogical），GM-6001（ENZQ），0.05%Brij-35（SANTA），荧光底物DQ（TM）GELTINFROMPIG（Life），无菌水，DMSO等。

2.2仪器设备

96孔酶标板（鼎国），ThermoScientificVarioskanFlash全波长扫描式多功能读数仪（Beckman），恒温培养箱（德国）。

2.3样品制备

自制HEPES缓冲溶液（pH7.0），其成分为50mMHEPES、0.2MNaCl、10mMCaCl2、20µMZnSO4及0.05%Brij-35。

精密称取适量广谱MMP的抑制药物GM-6001，用DMSO溶解，配置成15nmol/LGM-6001溶液待用，于-20℃下保存。

精密称取适量荧光底物DQ-gelatin，用HEPES缓冲溶液溶解，配置成每50μL缓冲溶液中含有0.2μg的DQ-gelatin溶液待用，于-20℃下保存。

称取100g红花药材粉末（过40目筛），75%乙醇室温下浸泡提取6次，每次提取12小时，将75%乙醇提取液过滤合并，减压浓缩得水液。

水液部分用石油醚脱脂2次，弃去石油醚溶液，再用乙酸乙酯溶液萃取5次，弃去乙酸乙酯溶液，水溶液减压回收蒸干，得到红花水提取物。

称取适量的红花水层提取物，超纯水溶解过0.45μm滤膜，配置成浓度为10mg/mL，8mg/mL，5mg/mL，2mg/mL，1mg/mL的样品溶液。

于-20℃下保存，用于抗炎活性测定。

精密称取羟基红花黄色素A和红花黄色素B两种标准品适量，加超纯水溶解，分别配置成浓度为10mg/mL，8mg/mL，5mg/mL，2mg/mL，1mg/mL系列标准品溶液。

于-20℃下保存，用于抗炎活性测定。

精密称取适量的基质金属蛋白酶-2，加入无菌水，配置成浓度为100ng/μL的储备液，于-20℃下保存[16][17]。

2.4实验原理和方法

（1）实验原理

对样品的抑制活性进行测定，本实验所需的试剂有基质金属蛋白酶（MMP-2）、底物DQ-gelatin、MMPs广谱抑制抑GM-6001，以及样品试剂。

在实验中，由于DQ-gelatin为荧光底物，被MMP-2降解DQ-gelatin后会发出荧光。

生物小分子的蛋白酶活性的测定中，向反应中加入红花样品溶液，红花样品与MMP-2结合后，底物不会被MMP-2降解，最终抑制荧光强度的变化。

（2）抑制活性的测定

将一定量的MMP-2分别与5μL不同浓度的红花水提取物及标准品溶液（10，8，5，2，1mg/mL）、1μL无菌蒸馏水、1μL15nmol/L的GM-6001加入96孔酶标板中，然后加入HEPES缓冲溶液，终体积为50μL，放入37℃培养箱中孵育30min；然后加入含有0.2μgDQ-gelatin的缓冲溶液50μL，最终反应体系为100μL，红花样品最终浓度分别为0.2，0.16，0.1，0.04，0.02mg/mL，立即用酶标仪进行检测，激发波长为460nm，发射波长为520nm。

检测10min。

检测的荧光强度变化就代表酶降解底物活力的强弱。

（3）抑制活性计算

抑制百分数[Inhibition（%）]公式为：

Inhibition（%）=1–Vi/Vo

Vi代表加入红花样品的荧光强度变化；用Vo代表没有加入红花样品的荧光强度变化。

当抑制百分数为50%时，则为红花样品抑制酶活性的IC50[18]。

第三章结果与分析

3.1不同浓度红花水层提取物对基质金属蛋白酶-2的影响

图1~6为红花水层提取物对基质金属蛋白酶-2体外抑制实验结果，依次为空白组、红花浓度分别为20，40，100，160，200μg/mL的实验组以及阳性抑制药物的实验结果。

底物降解速率用“MeanV”表示，也就是荧光强度随时间变化的变化速率，根据公式[Inhibition（%）=1–Vi/Vo]，能够计算出不同浓度的红花水层提取物对基质金属蛋白酶-2的抑制率。

由图1~7所示，空白组实验时，无菌蒸馏水对蛋白没有活性抑制，随着测定时间的变化，荧光强度逐渐增强；阳性对照组实验，基质金属蛋白酶光谱抑制剂GM-6001对蛋白有非常好的抑制效果，荧光强度保持不变；当加入样品溶液时，随着样品浓度的逐渐增大，对基质金属蛋白酶-2的活性抑制随之加强，当样品浓度达到200μg/mL时，抑制效果已经与GM-6001基本相近。

基于上述实验结果，我们可以推测出基质金属蛋白酶-2活性抑制达到50%时，需要的红花水层提取物的含量（IC50）。

如图8，所示IC50=5μg/mL。

并且，红花水层提取物对基质金属蛋白酶的抑制百分数与样品浓度成正比例关系，说明在红花中，可能存在对基质金属蛋白酶有活性抑制的成分。

图1　空白组:

MMP-2+底物DQ-gelatin+无菌蒸馏水5μL

、

图2Test1MMP-2+底物DQ-gelatin+红花水层提取物溶液1mg/mL

图3Test2MMP-2+底物DQ-gelatin+红花水层提取物溶液2mg/mL

图4Test3MMP-2+底物DQ-gelatin+红花水层提取物溶液5mg/mL

图5Test4MMP-2+底物DQ-gelatin+红花水层提取物溶液8mg/mL

图6Test5MMP-2+底物DQ-gelatin+红花水层提取物溶液10mg/mL

图7　阳性组:

MMP-2+底物DQ-gelatin+15nM/LGM6001

图8不同浓度的红花水层提取物对基质金属蛋白酶-2活性的抑制作用

3.2不同浓度红花标准品对基质金属蛋白酶-2的影响

对红花水层粗提物进行分离，得到两种主要色素类成分，羟基红花黄色素A和红花黄色素B，表1为两种成分对基质金属蛋白酶-2的抑制影响结果。

MeanV表明随着时间的改变荧光强度变化率，由实验结果，两种有效成分对基质金属蛋白酶的抑制百分数与样品浓度成正比例关系，经过对实验数据的推导，基质金属蛋白酶-2活性抑制达到50%时，需要的羟基红花黄色素A（HSYA）的含量IC50=84μg/mL，需要的红花黄色素B（SYB）的含量为IC50=3μg/mL。

由此可知，两种化合物对于基质金属蛋白酶有明显的体外抑制活性，且红花黄色素B的活性强于羟基红花黄色素A。

表1红花主要成分标准品对基质金属蛋白酶-2的影响

GROUP

MeanV

HSYA

SY-B

BLANK

24.627

POSITIVECONTROL

1.832

TEST1

15.17

10.91

TEST2

13.26

8.53

TEST3

11.99

5.17

TEST4

9.603

2.451

TEST5

8.009

1.757

IC50（mg/mL）

0.084

0.003

Blank：

MMP-2+DQ-gelatin；PositiveControl：

MMP-2+DQ-gelatin+GM-6001；Test1，2，3，4，5：

MMP-2+DQ-gelatinwithdifferentconcentration（20、40，100，160，200μg/mL）sample

3.3结论

据文献报道，基质金属蛋白酶（MMPs）有促进炎症产生的作用[19-20]，而红花通过对MMPs抑制作用，具有较好的抗炎活性。

通过上述体外酶抑制实验证实，红花水层提取物具有较强的基质金属蛋白酶的抑制活性，且两种主要成分都对基质金属蛋白酶有活性抑制效果，经过推断SYB对MMP-2的抑制作用要强于HSYA。

实验结果为从分子水平上研究红花治疗相关疾病的机理奠定了基础，也为今后进一步从红花中提取基质金属蛋白酶抑制剂并开发出以MMPs为靶点的中药新药提供了理论依据。

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